Microscopia e Técnicas Histológicas

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Microscopia e Técnicas Histológicas  
 
-O método mais utilizado em histologia e na 
patologia para análise dos tecidos ou fins 
diagnósticos é o ​preparado histológico 
permanente​ (lâmina histológica) 
 
Etapas:  
 
COLETA  
-Retirada de amostras biológicas de um 
determinado organismo  
● Biópsia: retirar um pedaço de tecido, com 
organismo ainda está vivo, para observar o 
material  
● Necropsia: procedimento utilizado para 
estudo anatômico de todos os órgãos ou 
tecidos de um indivíduo morto  
-A amostra retirada é denominada de ​ESPÉCIME  
-Alteração das células possibilita a chegada de um 
diagnóstico  
-​FINS DIAGNÓSTICOS​: o material é analisado 
pelo patologista- fornecerá laudo macroscópico da 
peça anatômica, como cor, tamanho e aparência  
obs.: em instituições credenciadas em 
procedimentos histopatológicos- o material deverá 
ser acompanhado de uma ficha com o pedido da 
análise histopatológico  
 
➔ Tipos de Biópsia: 
A coleta da amostra depende da localização  
a) Biópsia cirúrgica:​ obtenção da amostra de 
tecido ou órgão em camada mais profunda 
da pele  
- Incisional: remove apenas uma porção do 
tecido/tumor  
- Excisional: remove todo o conteúdo 
tecidual/tumor  
b) Biópsia endoscópica:​ usada para órgãos 
ocos (estômago, intestino) através de um 
tubo flexível (endoscópio) que tem na ponta 
um chip responsável por capturar imagens  
c) Biópsia por agulha:​ a amostra é obtida pela 
punção do órgão (fígado, pulmão, mama), 
sem precisar abrir a cavidade natural  
d) Cirurgias amplas​: a amostra corresponde a 
peças grandes (ex.: tumores) ou órgãos (ex.: 
mama, útero) 
 
FIXAÇÃO 
-Consiste na utilização de procedimentos (físicos 
ou químicos) para imobilizar os constituintes 
celulares e fornecer maior resistência para as 
etapas subsequentes  
-Retarda os efeitos ​post mortem​ do tecido, 
mantendo sua arquitetura normal: impedem a 
destruição das células por suas próprias enzimas 
(autólise) ou por ação bacteriana 
obs.:​ manter a morfologia o mais próximo da 
situação “in vivo”, permite endurecimento do 
material e uma coloração adequada  
 
➔ Tipos de fixador: a célula depois de morta 
pode sofrer modificações e é preciso 
manter a integridade dela, para isso, 
utiliza-se um fixador   
a) Fixação física​: utilizando-se calor ou frio  
b) Fixação química​: soluções de agentes 
estabilizantes ou desnaturantes  
➔ Classes de fixadores:  
● Aldeídos  
● Oxidantes  
● Desnaturantes  
● Combinação de reagentes  
 -Um dos tipos mais comum de fixadores é o 
FORMOL​, que às vezes é manipulado de forma que 
ele seja tamponado 
 
-​Espessura da amostra: 
● Influência na penetração do fixador no 
interior do tecido  
● Amostra muito espessa: fixação lenta, 
autólise  
● Redução do tamanho (também pode ser 
chamado de clivagem)  
-​Tempo de fixação​:  
● Varia de acordo com o tamanho do 
fragmento do tecido, e o tipo de fixador 
(respeitar o tempo de cada fixador) 
● Pode variar entre 4 e 24h até 48h  
obs.:​ o recomendado é: 20 vezes o volume de 
fixador em relação ao volume de fragmentos a 
serem fixados  
- Após o tempo indicado, deve-se proceder 
com a lavagem indicada para cada tipo de 
fixador 
 
DESIDRATAÇÃO  
-Transferência do fragmento para álcool (etanol) 
-Consiste na retirada de água do interior da célula 
a fim de permitir a impregnação da peça com 
parafina  
-São feitos banhos sucessivos em álcool de teor 
crescente (70-100%) 
-6 banhos em 1h cada  
 
CLARIFICAÇÃO  
-Preparação do tecido para a incorporação da 
parafina (tem que preencher o “local” onde teve a 
saída de água) 
-Remoção do álcool por xilol (solvente orgânico) 
-O tecido torna-se semi-translúcido, quase 
transparente 
-São feitos 2 banhos com xilol, cada um com 1h de 
duração  
-Outros agentes clareadores: toluol, clorofórmio, 
benzol..  
 
IMPREGNAÇÃO/INCLUSÃO  
-É o emblocamento da parafina  
-Tecido é colocado em um molde coberto por 
parafina fundida a 60ºC (colocada em pequenos 
blocos) 
-Esse procedimento possibilita o corte do material  
-Tempo: 8h  
 
MICROTOMIA 
-Aparelho utilizado é o ​MICRÓTOMO 
-São obtidos cortes sucessivos, delgados e 
uniformes, a partir dos blocos de parafina com as 
peças incluídas  
-ANTES DO CORTE: 
● Bloco de parafina é resfriado em uma 
PLACA REFRIGERADA a fim de facilitar o 
corte dos tecidos  
-CORTE: 
● Micrótomo rotativo: navalha de aço- 
espessura dos cortes varia de 1 a 60um  
obs.:​ um=microtômeros  
 → 1um= 0,001mm 
● De um modo geral, são obtidos cortes entre 
5 e 7um  
-Os cortes provenientes da microtomia ficam 
“enrugados”  
-Esses cortes são transferidos com auxílio de uma 
pinça ao banho maria (onde assumem a 
configuração de dobras retiradas) 
obs.: a água se encontra em 30ºC, abaixo do ponto 
de fusão da parafina utilizada  
-Uma vez que foram tiradas todas as rugas, é feito 
um esquema de “pescaria”, onde esses cortes são 
transferidos para uma lâmina de vidro previamente 
limpas e secas  
-Com o conteúdo na lâmina, é preciso tirar a 
parafina. Dessa forma, os cortes obtidos são 
transferidos para uma estufa entre 40-45ºC, para 
que aconteça a ​EVAPORAÇÃO DA PARAFINA 
 → Passa, no mínimo, 2h ou um pernoite  
 → No laboratório, cesmac, passa um tempo de 2h 
 
COLORAÇÃO  
-Tem a finalidade de dar contraste aos 
componentes dos tecidos, tornando-os visíveis e 
destacados uns dos outros  
-O mecanismo das colorações está relacionado a 
dois fatores: 
● Corantes (o mais comum é o HE: combinação 
entre hematoxilina e eosina)  
● Elementos a corar 
 
➔ Tipos de corantes: 
a) Hematoxilina:​ corante básico que cora 
componentes ácidos  
ex.: cora os ácidos nucléicos presentes no núcleo 
das células- cor azul púrpura (roxa) 
b) Eosina​: corante ácido que cora estruturas 
básicas de rosa  
ex.: atraída pelas proteínas do citoplasma da célula 
 
COMO QUE ISSO É FEITO?  
3 banhos de xilol → 5 banhos de álcool → passa na 
água → passa na hematoxilina → passa na eosina  
 
-Para corar peças é necessário a retirada de 
resíduos de parafina e a hidratação da peça  
-Sequência de banhos em xilol e álcool  
-Após a hidratação, os cortes são corados de 
acordo com o procedimento mais apropriado para 
análise  
-Tudo isso é feito na ​CAPELA DE EXAUSTÃO  
 
MONTAGEM FINAL DA LÂMINA  
-Consiste em depositar uma gota de resina líquida 
sobre o corte que está aderido na lâmina de vidro e 
cobri-lo com uma lamínula: ​BÁLSAMO DO 
CANADÁ  
-Evitar as bolhas de ar que se formam durante a 
colocação da lamínula  
-A resina depois de seca garantirá uma lâmina 
permanente que poderá durar anos  
 
LEITURA EM MICROSCOPIA DE LUZ  
-Botão de macrofocalização e botão de 
microfocalização: ajustam o foco  
-Condensador: concentra os raios de luz  
-Diafragma: regula a quantidade de luz  
-Filtro: seleciona os raios de luz  
-Espelho: permite que a luz passe pelo espécime 
 
CORTES HISTOLÓGICOS   
 
→ ​Problemas na interpretação dos cortes: 
● Distorções e artefatos causados durante o 
processamento do tecido  
● Visualização da totalidade do tecido  
● Duas ou três dimensões