Operações Unitárias

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Prova 2 – operações unitárias 
Precipitação
É uma das operações mais adotadas em escala laboratorial e industrial para a purificação de proteínas de origem microbiana, animal ou vegetal. O termo precipitado é usado para descrever uma operação na qual uma perturbação, química ou física em uma solução proteica causa a formação de partículas insolúveis de proteínas. 
Algumas vantagens são: 
· Facilidade de operação adaptadas em larga escala
· Uso de processos contínuos 
· Equipamentos relativamente simples 
· Grande número de precipitantes que podem ser utilizados sendo que alguns de baixo custo ou usados em pequenas quantidades. 
A duas técnicas de precipitação:
· Redução da solubilidade da proteína por alterações no solvente como adição de altas concentrações de sais (sulfato de amônio), solventes orgânicos (etanol, éter ou acetona) e de polímeros não-iônicos (polietileno glicol). 
· Redução da solubilidade por alterações na própria proteína como mudança de carga em virtude da adição de ácidos e bases, e uso de precipitantes aniônicos ou catiônicos ou ainda interação direta com alguns íons metálicos. 
Solubilidade
É a quantidade máxima que uma substância pode dissolver-se em um liquido. Uma típica proteína possui em sua superfície regiões polares ou apolares que determinará a solubilidade de uma proteína. Em geral a solubilidade de um soluto em um solvente é resultado das interações atrativas e repulsivas entre as moléculas de solvente e de soluto. Sendo favorecida quando as interações entre as moléculas do soluto são repulsivas e as interações do suto com o solvente são atrativas. Essas interações geralmente não fazem troca de elétrons (não-covalentes) e podem ser agrupadas de duas maneiras
· Interações eletroestáticas (dipolo-dipolo): são a base da solubilidade que moléculas polares neutras e com carga apresentam em solventes polares. São ligações fortes e resultam da interação das extremidades polares ou carregadas entre pelo menos duas moléculas. 
· Forças de Van der Waals: ligações frágeis e superficiais que se estabelecem apenas em contato íntimo das regiões apolares das moléculas, podem ter grupos capazes de formar dipolos instantâneos originados da assimetria na distribuição de cargas na molécula.
Dessas interações derivam-se as ligações de hidrogênio que é a formação de um dipolo-dipolo pela eletropositividade de um átomo de hidrogênio e outro átomo de hidrogênio eletronegativo se junta ao eletropositivo e forma-se então uma ligação dipolo-dipolo bastante forte, é o que acontece com a agua. 
As interações por solvatação acontecem quando moléculas do soluto interagem com as do solvente criando uma estrutura ordenada de moléculas de solvente em torno do soluto. *Quando o solvente é agua esse processo é chamado de hidratação*
Interações hidrofóbicas: é um processo termodinâmico espontâneo e inverso ao que ocorre em ligações polares, as moléculas apolares tendem a se juntar e reduzir a extensão em contato com a agua (se repelem, tem medo).
Desnaturação de proteínas
É a destruição da estrutura terciária de uma proteína ou deformidade que pode ser causada pelo aumento da temperatura que reduz as ligações de hidrogênio e pontes dissulfeto, mudanças de ph muito extremos causam desnaturação assim como solventes orgânicos que penetram o glóbulo de proteína causando a sua desnaturação. 
A precipitação é indicada para etapas iniciais de um processo de purificação já que proteínas precipitadas tem modificação na sua estrutura tridimensional então pode ser um método agressivo para as proteínas já que a sua função bioquímica depende de sua estrutura, esse método só é viável quando a adequação da proteína é recuperada após a precipitação. 
A precipitação pode ser realizada por: sais, solventes, polímeros, temperatura, isoelétrica, afinidade e fracionada. 
Precipitação por sais 
É a adições de sais que ocorre a neutralização das cargas superficiais da proteína e redução da camada de hidratação, favorecendo a agregação dos resíduos hidrofóbicos. 
Salting-out: regiões hidrofóbicas das proteínas ficam expostas e interagem e se agregam entre si. A adição de sais promove o aprisionamento de moléculas de agua (solvatação de ions) que se tornam escassas, e consomem as moléculas de agua ordenadas em regiões hidrofóbicas que ficam expostas, interagindo e se agregam.
É o método mais usado para separação de proteínas, em geral a proteína precipitada não é desnaturada e volta a sua atividade normal após dissolução e além disso os sais podem estabilizar as proteína contra desnaturação, proteólise ou contaminação bacteriana. O aumento da temperatura favorece a precipitação mas o processo é realizado preferencialmente a 4ºC. 
Os sais mais adequados para salting-out sçao aqueles que tem uma maior solubilidade, aumentam a tensão superficial do solvente, resultam no menor nível de hidratação das zonas hidrofóbicas e aumentam a probabilidade de interação entre essas zonas. Os mais usados são: 
· Citrato de sódio
· Sulfato de sódio 
· Sulfato de amônia (estabilizante de proteínas porém corrosivo) 
Salting-ing: ocorre porque a redução na concentração de sais e induzem interações iônicas e agregação entre as moléculas de proteína. 
*Globulinas: precipitam sob força iônica baixa porque as forças eletroestáticas repulsivas são insuficientes para estabilizar as proteínas em solução.*
Precipitação por solventes orgânicos 
Uma das vantagens do uso de solventes é a sua volatilidade que permite pronta recuperação e reciclagem ao processo, além de possuir propriedades bactericidase também a redução da densidade do meio liquido favorecendo a sedimentação do precipitado podendo eliminar o uso da centrífuga. Porém tem como desvantagem a tendência a causarem mudanças conformacionais nas biomoléculas e inflamabilidade, exigindo baixas temperaturas de operação para trabalho em larga escala. 
Funciona de maneira que os solventes orgânicos diminuem a atividade da agua pela diminuição da constante dielétrica da solução, ou seja o poder de solvatação das regiões hidrofílicas diminuem e ocorre aumento das forças eletrostáticas de atração entre as moléculas de proteína. 
Constante dielétrica: medida da polaridade do solvente, ou seja capacidade que ele apresenta de se colocar entre dois íons de cargas opostas e serpara-los. 
Constante dielétrica da agua: muito elevada, a agua separa os ions de carga oposta solvatando-os e mantendo a molécula em solução. O solvente o faz com amis dificuldade, permitindo maior atração entre as moléculas. 
O solvente afasta a camada de hidratação localizadas perto das zonas hidrofóbicas, e passa a circunda-las dada a maior solubilidade destas em meio ao solvente – causam alterações irreversíveis na conformação, reduzir a temperatura até 0ºC ou menores minimiza esse risco. 
Os solventes devem ser: 
· Miscíveis em agua 
· Não ter reação de modo direto com as proteínas 
· Ser bons precipitantes 
Os mais usados são o metanol, etanol e acetona, mas podem ser usados n-propanol, i-propanol, 2-metoxietanol, álcoois, éteres e cetonas. 
A fatores que interferem no processo: 
· Temperatura: 20-30ºC estimulam a desnaturação. Temperaturas menores que 0ºC podem prevenir a desnaturação – mas em altas concentrações pode haver desnaturação mesmo em baixas temperaturas. A adição de solvente aumenta a temperatura por isso deve ser feita de modo lento e sob refrigeração. 
· Concentração de sais: altas concentrações de sais neutros como NaCl dificulta a precipitação por etanol por exemplo. As altas concentrações de sais dificultam as interações eletroestáticas e por conta disso dificulta a precipitação já que as proteínas interagem com os sais e aumentam a sua carga global.
· pH: próximo ao pI favorece a precipitação
Precipitação por polímeros 
PEG – polieilenoglicol
Polímero de alta massa molar, neutro e miscível com agua, disponível em diversos graus de polimerização. Age excluindo a proteína do meio aquoso, a concentração ideial de PEG depende do tamanho da proteína e da massa molar do polímero, sendo inversamente proporcionalà concentração da proteína. Para remove-lo pode ser usado métodos de ultrafiltração, diálise e adição de etanol. 
Polieletrólitos
Polímeros iônicos solúveis em agua, de baixo custo e de pouco resíduos. Os mais usados são os policátion, polietilenoiminca (PEI) e poliânion ácido poliacrílico (PAA). Atua de maneira que deve ter carga oposta à da proteína, por isso devem agir longe do ponto isoelétrico, ocorre em temperatura ambiente e pode ter dois modos de ação: 
· Agregação da proteína: floculação 
· Eletrostático: neutralização de cargas
Precipitação com temperatura
Temperaturas próximas a do ambiente favorecem a manutenção da proteína em solução. A variação causa precipitação de duas formas: 
· Diminuição: reduz a solubilidade de proteínas
· Aumento: induz interações hidrofóbicas e aumenta a interferência das moléculas de água nas ligações de hidrogênio, resultando na desnaturação, expondo os grupos hidrofóbicos que interagem com outras moléculas e formam agregados insolúveis. 
Precipitação Isoelétrica
É o resultado da atração eletrostática das proteínas quando estas estão próximas de seu ponto isoelétrico, pois a repulsão entre as moléculas é mínima. É simples já que precisa apenas de ajuste de pH na solução. Tem baixo custo dos ácidos (fosfórico, clorídrico, sulfúrico) que são os mais utilizados, mas como desvantagem tem o poder dos ácidos causarem uma desnaturação irreversível. Indicada para ser usada na precipitação de proteínas indesejáveis. 
Em dado pH as proteínas apresentam o mesmo número de grupamentos carregados positivo e negativamente, tendo a carga igual a zero – ponto isoelétrico. 
· Abaixo do pI: proteínas em forma catiônica 
· Acima do pI: na forma aniônica. 
· No ponto isoelétrico elas aglutinam e precipitam
Precipitação por afinidade 
Fazem uso de interações específicas e seletivas de uma proteína com um ligante, geralmente substrato ou inibidor se a proteína for uma enzima, que pode estar ligado a uma matriz insolúvel ou livre em solução. Envolve a ligação da proteína a um ligante que co-precipita. A aplicação da técnica é limitada, pois ligantes estáveis a preções razoáveis ainda não estão disponíveis para proteínas. 
Precipitação Fracionada
É dividida em duas etapas, pelo fato de que os meios que contem a proteína a ser purifica apresentam em geral misturas de diferentes biomoléculas. 
· Primeira etapa: remoção de proteínas indesejáveis menos solúveis. 
· Segunda etapa: precipitação de uma ou mais biomoléculas alvo, pode ser de duas formas:
· Simples: em um único estágio – concentração
· Fracionada: usada para indústria para a purificação
Tem pouca reprodutibilidade em laboratório e tem redução da eficiência em larga escala. A principal variável é a concentração de precipitante, porém ph, temperatura, força iônica e concentração de proteína também podem ser variáveis. 
Secagem 
É uma operação unitária que visa o produto sólido, ou seja, faz a retirada pequenas quantidades de agua (umidade) ou outro solvente líquido de maneira mecânica, envolvendo uma corrente de gás que arrasta a umidade. Tem o objetivo de reduzir o liquido residual até um valor desejado, mais baixo que o anterior. 
A secagem ocorre de acordo com dois processos fundamentais: 
· Transferência de calor: o calor flui do ambiente para a superfície externa e daí para o líquido no interior do sólido. 
· Transferência de massa: na forma de liquido e de vapor no interior do sólido e na forma de vapor da superfície para o ambiente. 
A secagem é importante já que irá facilitar o manejo do produto, permite emprego satisfatório do mesmo, reduz o custo de embarque, aumenta a capacidade de equipamentos, preserva os produtos durante o armazenamento e transporte e aumenta o valor e a utilidade dos produtos residuais. 
Tipos de materiais quanto ao seu comportamento na secagem, podem ser divididos em: 
· Materiais granulares ou cristalinos: a umidade é mantida em estruturas pouco profundas, em poros superficiais bem abertos. Nesses materiais a umidade movimenta-se no interior do sólido sem dificuldade pela ação de forças capilares e gravitacionais. 
· Sólidos amorfos: a umidade participa integralmente da estrutura molecular e retida nos capilares. Ex: caseína, insulina, amido.
A secagem pode ocorrer duas maneiras, devido a agua: 
· Difusão interna: movimento de um liquido ou de um vapor através de um sólido em consequência de diferença de concentração. 
· Escoamento capilar: escoamento de um liquido através dos interstícios de um sólido ou sobre uma superfície, provocados por atração molecular entre o líquido e o sólido. 
As propriedades dos materiais biológicos também estão relacionas a eliminação da umidade, e podem ser: 
· Secagem de sólido lenta: contração progressiva da estrutura, levando o encolhimento, vencendo a resistência dos elementos estruturais do tecido. 
· Secagem do sólido rápida: forma-se uma camada rígida na superfície provocando menor encolhimento e mantendo o interior com certa umidade. 
Psicrometria
A psicrometria é o ramo da ciência dedicado à análise das propriedades físicas e termodinâmicas das misturas entre gases e vapor e suas aplicações práticas importante nas operações de secagem já que é a capacidade do ar de retirar umidade, ao passar sobre um material úmido, em um secador. 
Liofilização 
É o processo de secagem de um produto previamente congelado em que a maior parte da agua foi removida por sublimação. 
Sublimação é quando a agua no estado sólido é convertida diretamente em vapor de agua, sem passar pelo estado líquido. 
Ponto triplo: quando todas as fazem ocorrem ao mesmo tempo sob pressão de 4,58 mm de Hg e 0ºC de temperatura. 
É dividida em 3 etapas: Congelamento; sublimação sob pressão reduzida e agua incongelável é removida por secagem a vácuo – dessorção. 
O congelamento objetiva cristalizar a agua, evita produção de espuma ou migração dos solventes. A temperatura menor que 0ºC 
A secagem primária objetiva a sublimação do gelo em ebulição controlando a pressão a vacio e aumentando a temperatura. Elimina 90% da agua. 
Secagem secundária objetiva a eliminação de agua incongelável, aumenta a temperatura entre 20 e 60ºC. Elimina 8% da agua ligada e o produto é desidratado até 2% de umidade.
Equipamento
Câmera de liofilização: cilíndrico e com prateleiras com condutores elétricos que fornecem calor e sistema de fechamento para colocar os frascos. 
Condensador: Local onde ocorre a condensação do vapor, evitando o aumento da pressão, apresenta uma serpentina que circula um refrigerante a -50ºC. 
Bomba de vácuo: reduz a níveis sub-atimosféricos a pressão do sistema, possibilitando a sublimação.
As vantagens da liofilização são a vedação total da amostra, longa viabilidade, estabilidade elevada em muitas espécies, produção em larga escala, não requer armazenamento especial, fácil distribuição e transporte. Porém muitas espécies não sobrevivem ao processo, viabilidade ocasionalmente insatisfatória, mão de oba especializada e requer o uso de um equipamento sofisticado. 
Cristalização
A cristalização é uma operação de separação onde, partindo de uma mistura liquida se obtêm cristais de um dos componentes da mistura, com 100% de pureza. Na cristalização criam-se condições termodinâmicas que levas a aproximação das moléculas e se agrupam em estruturas altamente organizadas. 
Um cristal é uma estrutura altamente organizada caracterizada pela formação tridimensional ordenada em forma de grade espacial formada por partículas constituintes as quais podem ser átomos, ions ou moléculas que separam do seio da solução quando os níveis de potenciais termodinâmicos do sistema adquirem valores que assim impõem (????? Que?????) 
A força motriz dos processos de cristalização é a supersaturação da solução que determina as taxas de nucleação e crescimento dos cristais, assim dependendo das características de solubilidade do soluto, além das taxas de nucleação e crescimento. 
· Solução saturada: quando o teor de soluto está em equilíbrio com a fase liquida a uma dada temperatura. 
· Solução supersaturada: tem umteor de soluto acima do equilíbrio, nas mesmas condições de temperatura e concentração dos demais componentes. 
A solução pode atingir diferentes níveis de supersaturação, esses níveis são chamados de lábil ou de metaestável, que irão fazer como que a biomolécula sai da solução para uma fase cristalina, por adição de agentes precipitantes, remoção de agua, troca de solvente, difusão livre por uma interface, mudança de pH e combinação. 
· Lábil: ocorre nucleação primária de cristais que devem crescer. 
· Metaestável: não ocorre a formação espontânea de cristais, podendo apenas haver seu crescimento a partir de cristais menores que estiverem presentes nessa região.
Mecanismo de cristalização
Ocorre em duas etapas as quais consistem em fenômenos de diferentes naturezas, sendo elas nucleação e crescimento. 
· Nucleação: é a formação de núcleos cristalinos que determina o tamanho do produto final, assim como pureza e propriedades físicas, ocorre a partir de uma solução supersaturada. Pode ainda ser classificada em primária e secundária. 
· Nucleação primária: é a formação de cristais a partir de uma solução sem cristais, minúsculos grupos de partículas chamado clusters são formados e quando atingem o seu tamanho crítico L, correspondente a solubilidade, as forças atrativas no cluster prevalecem sobre a aç~~ao de partículas próximas presentes na solução e o núcleo permanece estável e continua a crescer, tornando-se um cristal. E pode ser dividida em homogênea e heterogênea.
· Homogênea: formação de cristal a partir de uma solução pura.
· Heterogênea: formação de cristal a partir de uma solução com substancias estranhas – pó, colóides e parede dos cristalizados. 
· Nucleação secundária: formação de partículas a partir de um cristal da mesma substancia existente no sistema, deve haver uma suspensão de cristais da qual será formada partículas menores, resultando sobretudo de contato mecânico que pode ser entre cristais ou paredes. 
· Crescimento: é o crescimento dos cristais a partir de núcleos presentes no sistema. E envolve 2 processos. 
· Transporte de massa até a superfície da partícula por difusão ou convecção. 
· Integração das unidades de crescimento, íons, moléculas, clusters na célula cristalina, em reações de superfície. 
Efeito de aditivos no crescimento de cristais
Impurezas podem causar alterações no crescimento dos cristais, mesmo em baixas concentrações. As alterações podem ser desejadas ou não, se desejada pode evitar incrustações por cristais nas superfícies de trocadores de calor industriais. Porém se indesejadas podem ser usadas quando o objetivo é de produzir cristais bem formados e de alta pureza. A ação desses aditivos pode se dar por 2 mecanismos: 
· Podem ser adsorvidos na superfície de determinadas faces dos cristais, inibindo o crescimento, alterando o habito ou deformando o cristal
· Por substituição de íons formadores dos cristais pelos aditivos, resultando em alterações tanto na taxa de crescimento quanto nas propriedades do produto final. 
Inclusões em cristais
São substancias sólidas, liquidas ou gasosas, apresentam-se em formatos de bolsas ou partículas dispersas no material. Causado pela alta taxa de crescimento. 
Aglomeração de cristais
Ocorre em duas situações e durante o armazenamento do produto normalmente que não tenham sido adequadamente secados podem sofrer de solubilização parcial e seguida de ligações de hidrogênio. 
· Cristalizador – crescimento: depende das propriedades da superfície do cristal, que pode fazer com que cristais se choquem e permaneçam aderidos. 
· No armazenamento: matérias higroscópicos armazenados em ambientes úmidos ou sem terem sido secados corretamente podem sofrer solubilização parcial ou sofrer ligações de hidrogênio. 
Cristalização fracionada
É usada para quando o cristal produzido em um único estagio tem a qualidade desejada, sendo assim pode-se usar a cristalização fracionada, onde o produto é retirado da solução mãe e lavado com solvente puro, que causa pequena dissolução dos cristais, ou uma solução saturada do produto e se mesmo assim as impurezas não forem totalmente retiradas, o produto lavado pode ser redissolvido em solvente piro e recristalizado, repetindo-se a operação até a obtenção do cristal puro. 
Cristalização por congelamento
O calor é retirado e assim é formado cristais de solvente e não cristais de produto. A separação desses cristais e sua lavagem com solvente puro conduzem a obtenção de solvente purificado. Pode servir para purificação de solvente e para concentrar soluções de interesse. Pode ser vantajosa para produtos alimentícios, normalmente usados quando se trabalha com sistemas eutéticos. Podem ser usados de 3 maneiras diferentes: 
· Contato indireto: uso de trocadores de calor externo
· Contato direto: injeção de refrigerantes imiscíveis e de baixo ponto de ebulição (propano, butano, CO2) que deverão ser recuperados e recomprimidos para retornar ao processo
· Congelamento a vácuo: pela expansão da solução no recipiente a baixa pressão. 
Cristalização supercrítica
Utiliza um solvente nas condições supercríticas, ponto triplo. O fluido comumente utilizado é o CO2 por possuir temperatura crítica próxima a ambiente e pressão crítica não elevada. A vantagem de se usar esse método é porque após a obtenção dos cristais, a separação é facilmente realizada pela expansão do solvente, o que gera um produto cristalino extremamente puro, porém tem alto custo de investimento. 
Processos de cristalização 
Contínuo: Regime permanente; operação em ciclos. Utilizados para grandes produções. 10t/dia
Semi-contínuo: remoção descontínua do produto, ou seja alimentação contínua e descarga após a obtenção do tamanho requerido do cristal ou concentração desejada; descarga periódica; anti-solvente
Descontínuo: resfriamento natural; programado e evaporação
Cristalização por evaporação 
A cristalização por evaporação é utilizada nos casos em que a solubilidade do soluto não varia muito com a temperatura, como na cristalização de NaCl. Nesse caso, é mais vantajoso obter-se a supersaturação por evaporação.
Cristalizadores industriais baseados nessa operação podem ser:
· Lagoas de evaporação pela radiação solar;
· Evaporadores com circulação da solução a pressão reduzida;
· Evaporadores à vácuo
Cristalizadores de misturas fundidas (melt) 
Melt: é usado para designar um líquido, ou mistura líquida, a temperatura ligeiramente acima da temperatura de solidificação. Os processos de melt consistem no resfriamento gradual da mistura fundida, até que uma massa de sólidos se forme. Devido a diferenças entre pontos de fusão dos componentes da mistura, a composição do sólido é diferente da composição do líquido remanescente.
Os processos de cristalização por melt apresentam duas configurações básicas:
· Cristalização sistema agitado: por resfriamento, forma-se uma suspensão dos cristais. Nesse caso são utilizados tanques agitados com trocadores de calor acoplados.
· Cristalização em camadas: as misturas fundidas estão em contato com superfícies tubulares ou planas, resfriadas, sobre as quais se forma uma camada de cristais. São utilizados trocadores de calor multitubulares que operam com raspadores da camada de cristais formada.
Cromatografia 
Um método físico-quimico de separação de misturas, identificação e quantificação de seus componentes. 
Tem como objetivo isolar e purificar a biomolécula de interesse, levando a pureza adequada para o uso. Pode ser dividida em dois grandes grupos: liquida e gasosa.
 E envolve uma série de processos de separação de misturas, acontece pela passagem de uma mistura por duas fases: estacionária (FE) e móvel (FM).
O principio é a separação das misturas por interação diferencial dos seus componentes com uma fase estacionária (FE – liquido ou sólido) e um fase móvel (FM – liquido ou gás).
A separação, depende da interação dos componentes da mistura com a fase móvel e com a fase estacionária, a qual é influenciada por diferentes forças intermoleculares, incluindo ioncia, bipolar, apolar, e específicos efeitos de afinidadee solubilidade. 
A identificação dos componentes da mistura se dá em comparação da interação de padrões com as fases estacionárias. 
A quantificação é feita pela comparação com padrões de concentração conhecidos, através de curva analítica. 
Pode ter duas finalidades, uma analítica e outra preparativa: 
· Analítica: identificação e quantificação de moléculas isoladas. 
· Preparativa: objetiva obter frações volumétricas do eluente contendo moléculas isoladas para posterior caracterização desta ou para submissão de outros testes. 
Classificação 
Pode ser pela forma física do sistema; pela fase móvel empregada; pela fase estacionária usada e pelo modo de separação. 
Forma física:
· Coluna: fase estacionária permanece num tubo. Ex: cromatografia liquida, gasosa e supercrítica. Cromatografia liquida 
· Planar: fase estacionária permanece em um plano. Ex: centrifuga, cromat. Em camada delgada 
· cromatografia em papel: usa de pequenas quantidades de amostra, uma técnica para partição liquido-liquido, e baseia-se na solubilidade de substancias em questão entre as dias fases imiscíveis, sendo geralmente a agua um dos líquidos. Útil para separação de compostos polares. É uma técnica simples, e de baixo ciso, porém com uso limitado, alargamento de banda difusão e poucas alternativas de reveladores. 
Fase móvel empregada:
· Uso de gás: cromatografia gasosa; gasosa de alta resolução: supercrítica – gás pressurizado. 
· Uso de liquido: cromatografia liquida clássica; liquida de alta eficiência. 
Fase estacionária empregada:
· Liquida
· Sólida
· Quimicamente ligadas
Modo de separação 
· Adsorção: fenômeno físico-químico através do qual um sólido (adsorvente) fixa em sua superfície um liquido ou gás, por meio de interações semelhantes as forças de Van der Waals. 
· Partição: baseada nas diferenças de solubilidade dos componentes na fase estacionária (liquido) e na fase móvel (liquido). Baseia-se na formação de uma fina película formada sobre a superfície de um suporte sólido através de uma fase estacionária liquida. 
· Troca iônica: ion da amostra se liga a carga fixa (grupo funcional) da fase estacionária. 
· Afinidade: ocorre uma ligação molecular especifica e reversível entre o soluto e o ligante fixado a fase estacionaria. 
· Exclusão por tamanho – gel filtração: as moléculas são separadas por seu tamanho
Cromatografia liquida 
É uma cromatografia em coluna, adequada para a separação dos componentes, seja eles macromoléculas, constituintes termolábeis de soluções liquidas. A amostra é injetada e é homogeneamente distribuída no topo da coluna, os componentes da mistura são separados por interação diferenciada com a resina, com base em propriedades moleculares como massa, carga, solubilidade e afinidade. Os componentes de um cromatógrafo liquido são: 
· Injetor: dispositivo com função de introduzir a amostra na fase móvel
· Coluna cromatográfica: dispositivo com função de separar os componentes da amostra 
· Pré-coluna: retem sólidos e em muitos casos retem materiais que por reações químicas podem precipitar na fase estacionária que é mais utilizada e composta por partículas microporosas de sílica, permáveis ao solvente e possuem uma área superficial de varias centenas de metros por grama. – não deve ser usada em sistemas com pH acima de 8,0. A fase móvel usa solvente HPCL de alta pureza e faz filtração em membranas de 0,45 µm, os solventes da fase móvel dependem da fase estacionária e deve ser consultado na lista “série elutrópica” 
· Detector: dispositivo com função de detectar os componentes eluidos da coluna. Examinam continuamente o material, gerando um sinal na passagem de substancia que foram separadas. Tem alta sensibilidade, resposta rápida para todos os compostos , invisível a mudanças na fase móvel e de temperatura, reposta independente e linear, não destrói a amostra, fácil operação e fornece informações qualitativas. Existem 3 tipos:
· Universais: geram um sinal para qualquer composto
· Seletivos: geram sinal para compostos com determinadas características 
· Específicos: geral um sinal para compostos que tenham um determinado elemento na sua estrutura. 
· Tipos de detectores: 
· UV-VIS: mais comum, deveido usar luz ultravioleta, a absorção da luz ultravioleta ou visível pela amostra, quando nela passa radiação eletromagnética. É seletiva, comprimento de onda fixo e pode ser selecionado, e o solventes também absorvem. 
· Fluorescência: emissão de energia fluorescente de um soluto que foi excitado por radiação UV. É seletivo pro aromáticos policíclicos e duplas ligações conjugadas e mais sensível que uv por ser emissão. 
· Índice de refração: mede a diferença no índice de refração da fase móvel e do eluente vindo da coluna. Não seletivo, sensível a variações de temperatura, pressão, fluxo e composição da fase móvel, muito usado em cromatografia preparativa. 
· Espectrometria de massa: determinação da massa de solutos através da ionização e determinação da relação massa-carga. Pode ser destrutivo, extremamente seletivo, analise de micro e macromoléculas e tem alta sensibilidade. 
Cromatografia em camadas delgada
Partição de um soluto entre duas fases, como na extração, sendo uma estacionária e uma móvel. O equilíbrio é constante deslocado pela fase móvel e os solutos separados pelas diferenças de mobilidade impregnada em placa de vidro ou alumínio. 
É um método rápido (20-40 min), usa diversos agentes cromogênicos, mais sensível, tem uma grande gama de compostos que podem ser analisadas, mais simples e mais barato. A fase móvel tem sistema de solventes e a fase estacionária usa de adsorventes como sílica, alumina, celite e amido (ativação de 30-60 min em temperatura de 105-110ºC), usa métodos de detecção físico-químicos. O princípio é adsorção (polaridade).
A seleção de fase móvel depende da natureza química das substâncias a serem separadas e da polaridade.
A placa deve ter riscos para assim saber a altura do início e fim da cromatografia. 
A cuba deve estar saturada com vapor da fase móvel para isso, coloca-se papel filtro dentro da cuba que irá indicar o nível de saturação. Deve ser vedada afim de manter a atmosfera. A placa deve ser colocada rapidamente e deve ser colocada em forma vertical. 
A revelação pode ser feita por:
· Procedimentos físicos: Luz ultravioleta 
· Procedimentos biológicos e enzimáticos: antibióticos, enzimas e substrato
· Procedimentos químicos: aplicação de um reativo químico para formar um derivado colorido ou fluorescente
As vantagens são de maior sensibilidade, ser mais rápida, reveladores reativos e permite aquecimento, porém tem dificuldades na quantificação e a degradação de compostos lábeis devido à grande superfície de exposição. 
Cromatografia de exclusão molecular 
Usada para separação de proteínas uma das outras de acordo com a sua massa molecular. O princípio básico desse método é que as moléculas sofrem partição, em virtude das diferenças no tamanho das espécies, entre um solvente (fase móvel) e uma fase estacionária de porosidade definida. Assim uma solução tamponante adequada flui por gravidade ou com auxílio de bombas, por uma coluna preenchida de esferas de material polimérico poroso altamente hidratado e inerte, ou seja, moléculas pequenas passam pelos poros enquanto moléculas maiores são retidas e moléculas médias, acabam por ficar no meio. A fase estacionária caracteriza-se por apresentar uma faixa de fracionamento o que significa que as moléculas dessa faixa podem ser separadas, os géis mais usados nessa fase são partículas compostas de sílica, polímeros vinílicos hidrolizados ou agarose com alto grau de reticulação. 
Fase móvel: selecionadas a partir das suas características quanto a composição, pH, força iônica, considerando as interações entre o solvente e a matriz em gel. A amostra deve ser solubilizada no mesmo meio que a coluna e para a filtração, deve ter pH na faixa de 6,0 a 8,0 e usar tampões com sais voláteis. 
Os detectores mais usados nesse tipo de cromatografia são os universais, viscosímetro capilar e espalhamento de luz estáticoque permite a determinação da massa molar absoluta. 
Volume hidrodinâmico e massa molar
O valor hidrodinâmico é todo o espaço que a molécula necessita na solução, não informa sobre a distribuição da massa mas quanto maior for a massa, maior será o volume hidrodinâmico. A configuração da cadeira e conformação, interação entre a molécula e o solvente e a temperatura, podem afetar essa relação. 
Aplicações
· Dessanilização: em comparação com a diálise, apresenta vantagens de ausência de entupimento, maior rigidez de processamento. 
· Separação de misturas: facilita a separação da proteína desejada frente a vários tamanho similares pelas quais não se tem interesse. 
· Determinação de MM: de macromoléculas hidrofílicas e polímeros, e também de suas distribuição de MM. 
· Determinação de tamanho de poros: utilizando uma macromolécula de tamanho conhecido, é possível determinar o tamanho dos poros para calibração de matrizes. 
Cromatografia de troca iônica 
Usada para purificar proteína, pois é mais fácil, pode ser feita em aumento de escala, alta resolução, alta capacidade de adsorção e versátil. 
Possui uma etapa de adsorção reversível de moléculas de solutos eletricamente carregados a grupos com cargas opostas, imobilizados em uma matriz (FE). Os solutos adsorvidos são subsequentemente eluídos após serem trocados com o mesmo tipo de carga, porém com maior afinidade pela fase estacionária. 
O princípio da técnica é baseado na competição entre íons de interesse e contaminantes pelos grupos carregados da matriz ou da fase estacionária, ou seja, é a troca de íons de mesmo sinal entre uma solução e um corpo sólido muito insolúvel. A carga das proteínas se da por aminoácidos, histidinas e lisinas (positiva) e ácidos aspárticos e glutâmico (negativo). 
Teoria da troca iônica
O ponto isoelétrico: pH no qual o numero de cargas positivas e negativas são iguais. 
· Acima do pI: as proteínas possuem carga liquida negativa.
· Abaixo do pI: possuem carga liquida positivas. 
A carga liquida de uma proteína depende da proporção entre suas cargas positivas e negativas e varia de acordo com o pH. 
A resina de FE pode ser catiônica ou aniônica, se catiônica com carga negativa irão adsorver proteínas de cara liquida positiva e se aniônica com carga positiva irão adsorver proteínas de carga liquida negativa. 
A cromatografia de troca iônica tem duas etapas: 
· Adsorção das proteínas: com carga contraria a resina, e saída da coluna das proteínas com mesma carga. 
· Eluição das proteínas adsorvidas: as condições de adsorção da coluna (pH e força iônica) são alteradas para neutralizar a interação entre proteínas e a resina. Mas utiliza-se um aumento da concentração do sal do tampão, pois alterações de pH podem desnaturar proteínas, levando a precipitar dentro da coluna. As proteínas com mesma carga da resina são repelidas pela mesma. 
As resinas podem ser constituídas de polímeros hidrofóbicos, macroporosos hidrofílicos naturais ou sintéticos, e partículas não porosas. 
Escolha de grupos funcionais
Os grupos catiônicos ou aniônicos podem ser classificados como:
· Fortes: aqueles com capacidade de permanecer na forma ionizada nas condições de pH normalmente usadas para purificação de proteínas. 
· Fracos: possuem faixa estrita de pH em que operam com eficiência e são, muitas vezes, usados na forma parcialmente ionizada. 
A fase móvel deve dissolver a amostra e ter uma força de solvente que leve a tempos de retenção razoáveis e interagir com solutos de modo a levar a seletividade. 
Pode ser usadas para separar moléculas de diferentes fontes (animais, vegetais, microbiana), tamanhos, formas, atividades biológicas e intra ou extracelulares. 
Cromatografia de afinidade
Baseia-se nas propriedades biológicas e funcionais das espécies que interagem: a proteína a ser separada e FE. Depende de interações altamente especificas como enzima-substrato, enzima-inibidor, antígeno-anticorpo. 
As vantagens incluem, alta resolução e recuperação do material ativos, alta especificidade, uso de grandes volumes de amostra, purificação a partir de misturas biológicas em uma etapa só, separação de formas nativas e desnaturadas, e remoção de pequenas quantidades da proteína alvo. 
Pode ser descrita em 3 etapas:
1. Imobilização do composto químico ou bioquímico (ligante) na superfície interna da matriz porosa FE. O ligante tem alta especificidade. 
2. Estagio de adsorção: a amostra contendo proteína alvo é colocada em contato com o adsorvente para permitir que as interações de adsorção ocorram. Também ocorre lavagem, onde a coluna é equilibrada com um tampão inicial onde os compostos não adsorvidos são removidos. 
3. Estagio de eluição: proteína alvo é liberada do complexo de adsorção e pode então ser atingida por modificações no pH, força iônica ou pela adição de uma substancia que tenha maior afinidade pelo ligante. Após a coluna é regenerada pela solução inicial. 
A matriz não deve interagir com as proteínas, sendo hidrofílica, deve ter boas propriedades mecânicas, boa porosidade, e deve ser mecânica e quimicamente estável. Pode ser feita com materiais orgânicos, sintéticos e polissacarídeos, como agarose, dextrana, celulse, poliacrilamida, alumina, sílica com porosidade controlada.
O ligante é o agente que reconhece e se liga diretamente a proteína alvo, podem ser corantes, pequenas moléculas, polissacarídeos. Devem ter ligação de afinidade específica e revers´vel com a substancia a ser purificada, e ter grupos modificados que permitem ser acoplados a matriz sem perder sua atividade. 
Regra geral: se o ligante é de cadeia grande e a proteína de baixa MM – o braço de extensão pode não ser necessário. E se a proteína ter alta MM, pode-se usar um braço de extensão tal que limita o impedimento estérico e aumenta a disponibilidade de sítio ativo. 
Eluição 
Requer a completa dissociação do complexo adsorbato-adsorvente. E pode ser:
· Não seletivo: mais usado, altera as propriedades físicas do adsorvente de forma que a intensidade da ligação seja reduzida e a dissociação seja promovida. 
· Seletiva: utiliza solução contendo alta concentração de ligante livre, podendo ser o mesmo ligante da matriz. Tem alta afinidade pela proteína adsorvida e ocorre competição entre os ligantes solúveis e imobilizados. A proteína é separada do ligante com base na diferença de MM.
Pode ser aplicada para analises quantitativas de identificação de proteínas, e separação e purificação de biopolímeros naturais como plasma sanguíneo. Pode purificiar, anticorpos, antígenos e glicoproteínas, enzimas. 
Membranas adsortivas
Cromatografia adsortiva, técnica para biosseparação, que apresenta a mesma flexibilidade das outras cromatografias de leito fixo, porém surgiu com o intuito de resolver alguns problemas que a cromatografia de leito fixo traz, por isso tem sido empregada em substituição aos suportes cromatográficos tradicionais em virtude de tratar grandes volumes por unidade de tempo – alta produtividade, por serem membranas rígidas e a transferência de massa se da por convecção e altas vazões podem ser obtidas com pressões moderadas sem a necessidade de equipamentos de alta pressão, porém também possuem limitações como a formação de camada de polarização de concentração e a colmatagem de proteínas retidas no interior de poros que fazem a biomolécula ser parcialmente adsorvida. 
Apresenta algumas limitações das cromatografias de leito fixo são a compressibilidade dos géis, nos fenômenos de adsorção, dessorção por transferência de massa, e entupimento dos poros. 
O princípio consiste na adsorção da biomolécula no sítio de adsorção (ligantes) localizado no interior dos poros da membrana. O processo é realizado em 3 etapas: 
1. Processo de adsorção da biomolécula alvo
2. Lavagem da membrana com um tampão de adsorção, onde pequenas moléculas presentes nos poros, são removidas
3. Eluição da biomolécula de interesse com um tampão de dessorçao da membrana pelo enfraquecimento da interação biomolécula-ligante, variando as condições do meio. 
A preparação das membranas envolve 4 etapas:1. Escolha da membrana
2. Recobrimento da membrana selecionada com matérias hidrofílicos, caso a membrana seja hidrofóbica
3. Ativação
4. Acoplamento ao ligante
A membrana deve ter:
· Uma porosidade adequada: isso é, ter um tamanho que permita a passagem da biomolécula penetrar e acessar os ligantes imobilizados, além de apresentar uma homogeneidade de distribuição de poros 
· Área superficial elevada: que possibilitaram a construção de módulos pequenos com alta capacidade
· Hidrofobicidade: suportes hidrofílicos previnem adsorção não-específica passível de ocorrer devido a interações hidrofóbicas. 
· Presença de grupos funcionais: são requeridos grupamentos que sejam falcilmente ativáveis por via química ou física para imobilizar o ligante. 
· Estabilidade química: o material deve ser estável em uma larga faixa de pH, na presença de sais, resistir a solventes orgânicos e aos reagentes utilizados nas etapas de derivatização (recobrimento, ativação e imobilização do ligante), assim como durante as etapas de operação e regeneração
· Estabilidade física: rigidez, estável a autoclavagem 
· Biocompatibilidade: importante quando usada em tratamentos extracorpóreos 
· Baixo custo
Para a ativação da membrana são usados reagentes como: carbonil diimidazol; bisoxirano, cloreto cianúrico e epicloridrina
Os ligantes e modo de interações tem sido estudados por essas membranas
· Interações por afinidade: bioespecíficos e pseudoespecíficos
· Bioespecíficos: exploram a formação de complexos de natureza funcional: tem alta afinidade. Anticorpo-antigeno, hormônio-receptor, podem ser aplicados em anticorpos monoclonais imobilizados para purificação por imunoafinidade e lectinas imobilizadas para purificação. 
· Pseudoespecíficas: pequenas, simples e de baixo custo, como corantes, aminoácidos, os quais possuem uma especificidade para um grupo de biomoléculas, podem ser imobilizados de modo estável e reação bem definidas. 
· Interações eletrostáticas: troca iônica
· Troca iônica: separação por cargas geradas através do pH específico da solução que controla o equilíbrio da ionização dos grupos. Seleção de tampões é um ponto crítico. 
· Interações hidrofóbicas: ocorre devido a forças de atração de Van der Waals entre grupos apolares localizados na superfície da biomolécula e ligante hidrofóbicos (alquila ou arial) imobilizados covalentemente nas membranas 
Modo de operação 
· Frontal: em membranas planas individuais ou cartuchos, solução é pressionada contra a membrana. A biomolécula permeia a membrana sendo adsorvida e as impurezas são retinas na superfície devido ao seu tamanho ou atravessam os poros sem sofrer interação 
· Tangencial: solução escoa paralelamente a superfície da membrana, de forma a evitar ou minimizar a formação de polarização de concentração na superfície. Usado em cartuchos de fibra oca, módulos espirais ou em módulos de placa plana. Soluções concentradas e viscosas provenientes de soluções complexas, como caldo bruto da fermentação, soro animal ou plasma sanguíneo 
Destilação
Um processo de separação, visa separar os componentes da fase liquida através de sua vaporização parcial. Realizam-se em estágios nos quais o liquido e o vapor entram em contato para produzir duas outras correntes cujas composições diferem das originais. 
Uma destilação pode ser conduzida de diferentes formas, cada uma com suas vantagens e desvantagens
· Diferencial:é descontinua, a carga é colocada no fervedor e aquecida até sua temperatura de bulição e o vapor é formado através de um condensador. 
· De equilíbrio: pode ser em batelada ou contínua, a alimentação liquida é pré-aquecida em um tanque de expansão, no qual parte do liquido irá vaporizar, o liquido e vapor não vaporizado são retirados. 
· Por arraste: consiste em injetar vapor vivo no fervedor em vez de realizar o aquecimento, usado para misturas liquidas insolúveis no solvente. 
· Extrativa: usada para separar componentes com volatilidade muito próximas, requer menos energia. Consiste em adicionar outro componente ao sistema (solvente) que aumenta a voltatilidade relativa dos componentes a serem separados. O solvente deve ser menos volail que os outros componentes, e ter baixo ponto de ebulição, miscível, não deve ser tóxico, inflamável ou corrosivo, deve ser estável e de baixo custo. 
· Azeotrópica: consiste em acrescentar um outro componente a mistura (solvente) porém deve ter a mesma volatilidade dos componentes, nessas condições o solvente forma um azeotrópico com um ou mais componentes a separar, devido a diferença de polaridade. 
· Vácuo: usada quando as substancias tem pontos de ebulição elevados, pois a destilação a vácuo reduz a pressão.
· Fracionada: feita em uma coluna de fracionamento o que a faz ser mais barata, e só pode ser usada quando os componentes da mistura tiverem pontos de ebulição bem diferentes, pode ser em batelada ou contínua. 
· Zonas de uma coluna: 
· Stripping/esgotamento: estágios nos quais a concentração de componentes menos voláteis estão na corrente liquida, encontrasse abaixo do ponto de alimentação
· Retificação/enriquecimento: a concentração dos componentes mais voláteis estão na fase de vapor, encontra-se acima do prato de alimentação.
Extração Liquido-Líquido (ELL)
 Operação Unitária de transferência de massa utilizada para separar componentes presentes em uma solução e/ou suspensão, distribuindo-os entre fases líquidas, parcialmente solúveis ou insolúveis.
Existe uma grande necessidade de técnicas de biosseparação eficientes, efetivas e econômicas em larga escala, que permitam atingir elevado grau de pureza e rendimento de recuperação, mantendo a atividade biológica da molécula, posto que a maior parte dos custos de produção para um produto biológico reside na estratégia de purificação. 
Sistemas aquosos bifásicos (SAB), formados por fases imiscíveis, constituem uma excelente alternativa para separação, concentração e purificação de biomoléculas ativas, pois são uma variante da extração líquido-líquido convencional, que favorecem a estabilidade de moléculas com origem em sistemas biológicos.
Sistema Extrativos
Transferência de solutos de uma fase líquida ou sólida para um solvente líquido. 
Líquido-Líquido→ Por solventes; Em sistemas de duas fases aquosas.
 Sólido-Líquido: contato do material sólido com o solvente e posterior evaporação do solvente
Purificação de produtos biotecnologicos:
SDFA tem sido aplicada à purificação de biomoléculas obtidas em células animais, vegetais, microbianas, na extração de vírus, organelas e ácidos nucleicos e na purificação de enzimas. Proteínas altamente sensíveis à desnaturação, podem ser purificadas em SDFA em decorrência de uma partição diferenciada da molécula alvo e impurezas entre as fases líquidas. Alto teor de água (75 – 80% em massa) garante a manutenção das propriedades biológicas das proteínas. As propriedades superficiais das proteínas são fatores decisivos: massa molecular, carga elétrica e hidrofobicidade.
Extração Liquido Liquido de Biomoleculas:
 
Vantagens comuns aos três métodos: Rápidos, Baixo custo, Biocompatíveis.
FUNDAMENTO: Em função da diferença de solubilidade da molécula-alvo nas fases Substância “P” é mais solúvel na fase de topo em relação a de fundo. Haverá um aumento do grau de pureza da molécula alvo caso os contaminantes apresentem mais solubilidade na fase de fundo.
T -> fase de topo (leve); F-> fase de fundo (pesada); P-> produto; C-> contaminantes.
Se um sistema termodinâmico possui mais de uma fase, os compostos presentes tenderão a distribuir-se de maneira diferenciada entre elas. Quando misturadas espécies quimicamente distintas em concentrações além das definidas pela zona de transição de fases, sob condições críticas de composição e temperatura, por exemplo, é formado um sistema com duas fases líquidas imiscíveis, predominando cada um dos componentes numa ou na outra fase. As fases são denominadas aquosas devido à predominância de água na sua constituição, e por isso, tornam-se um ambiente favorável para biomoléculas.
Tipos de SistemasPoliméricos: Fases são formadas pela reunião de determinados polímeros, polieletrólitos, ou ainda, polímeros em combinação com solutos de baixa massa molar, em uma mesma solução formando 4 grupos: 
1. Dois polímeros não-iônicos: PEG (poli etileno glicol) – Dextrana; PEG – Polivinil álcool; PPG (poli propileno glicol) – Dextrana; Metil celulose – Hidroxipropil dextrana 
2. Polieletrólitos x Polímero não-iônico: Sulfato dextrana de sódio – Polipropileno-glicol Carboximetilcelulose de sódio – metil celulose
3. Dois Polieletrólitos Sulfato dextrana de sódio : Carboximetildextrana de sódio - Carboximetilcelulose de sódio. 
4. Polímero não-iônico x Compostos de baixa massa molar PPG – fosfato de potássio PEG – fosfato de potássio Metoxipolietileno glicol – fosfato de potássio PPG – Glicose PEG – Glicose PEG – Sulfato de magnésio PEG – citrato de sódio
Sistemas Sistemas PEG - Sal 
Rápida separação das fases; Baixo custo; Elevada seletividade na separação baseada na solubilidade.
Curvas de Equilíbrio – Diagrama de fases
· Ordenada: composição em massa da molécula de maior concentração na fase de topo (PEG) 
· Abscissa: composição em massa da molécula de maior concentração na fase de fundo (Fosfato) 
· Ambos os componentes do sistema estão presentes nas duas fases.
Sendo assim
· Composições representadas por pontos acima da curva 
de equilíbrio (binodal), levam a formação de duas fases; 
· Composições representadas por pontos abaixo da curva
 de equilíbrio (binodal), levam a acima 
Curvas de Equilíbrio - Linha de Amarração 
Sistemas cuja composição inicial encontra-se sobre uma mesma linha de amarração possuem a mesma composição final. As relações de volume entre as fases varia com a composição, de acordo com a razão entre os segmentos TM e BM.
· Segmento TM: proporcional ao volume da fase de topo. 
· Segmento BM: proporcional ao volume da fase de fundo. 
· C – ponto crítico: composições e volumes da fase de topo e fundo são iguais. Sistema instável.
Valores de pH e temperatura também são variáveis que influenciam a curva b curva binodal.
Quanto maior a massa molecular molecular do polímero, polímero, mm menor a concentração concentração necessária necessária para a formação formação de duas fases
Curvas de Equilíbrio- Coeficiente de Partição 
· Partição de proteínas entre as duas fases é regida pela condição de menor potencial químico ou maior solubilidade. 
· Biomolécula apresentará maior concentração na fase onde sua solubilidade for maior. 
K = Cti/Cfi 
K= Coeficiente de partição
Cti= [soluto i] na fase de topo (g/L) 
Cfi= [soluto i] na fase de fundo (g/L)
· K é usado para avaliação da extensão das separações nos sistemas de duas fases aquosas. 
· K distintos para a molécula de interesse e para as demais indicam a ocorrência de purificação.
Fatores que influenciam no coeficiente de partição (K) de biomoléculas:
· Interações Hidrofóbicas; 
· Cargas superficiais e pH; 
· Diferença de potencial elétrico entre as fases; 
· Efeito de Salting-out da fase salina; 
· Diferenças de viscosidade; 
· Diferenças de densidade; 
· Interações bioespecíficas; 
· Concentração das fases – PEG e sal 
· Massa molar da biomolécula.
K também varia com o pH e com a massa molar de PEG
K distintos para a molécula molécula de interesse e para as demais indicam a ocorrência de purificação
Rendimento do Processo de Extração 
· Rtopo rendimento na fase de topo (%) 
· Ctopo concentração ou atividade da biomolécula na fase de topo (g/L)
· Cinicial concentração ou atividade da biomolécula na amostra antes da extração (g/L) 
Extrações Baseadas em Afinidade 
O valor de K em uma SDFA convencional, sem o uso de qualquer ligante, em geral, não é extremo devido às proteínas se comportarem indistintamente. Para aumentar o valor de K pode-se utilizar interações por afinidade.
· Ligante: substância que se ligará à molécula alvo, é acoplado por ligação covalente ao polímero. 
· Formação do complexo: polímero polímero-ligante ligante-biomolécula biomolécula 
· Pode ser substância natural ou molécula sintetizada. 
· Aumenta o rendimento da purificação; 
· O PEG reage facilmente com ligantes pois contém hidroxilas substituíveis.
Escolha do Ligante 
· A relação custo x benefício deve ser favorável; 
· O ligante deve ser bifuncional um sítio de ligação para a finidade com a biomolécula e outro sítio para imobilização no polímero; 
· Deve ser estável durante a imobilização; 
· Deve ser estável durante o processo de extração; 
· Não deve conter outros grupos que tenham afinidade por outras partes da biomolécula; 
· Não deve ser tóxico; 
· Ser disponível; 
· Ser fácil o rompimento da interação polímero/biomolécula.
 
Sistema de Afinidade 
· A fase superior rica em PEG-ligante e a biomolécula a ser purificada. 
· A fase inferior é rica em sal (sulfato de sódio) e contaminantes.
Equipamentos para ELL – SDFA
· Nível laboratorial: funil de separação
· Extração descontínua
· Nível Industrial: Seja qual for o tipo do equipamento, em geral, eles são operados de forma contínua, com alimentação em contra-corrente das fases.
· Pesquisa Área de Biotecnologia – operação semicontínua com uma das fases sendo mantida estacionária e outra alimentada continuamente na forma de fase dispersa.
Fases 
· Fase contínua onde se tem a amostra. 
· Fase dispersa fase adicionada para extração. 
Extratores e colunas de extração líquidolíquido têm basicamente duas funções
1.Estabelecer o contato entre as fases líquidas no sistema pela dispersão de uma fase na outra, com o objetivo de possibilitar a transferência de massa; 
2. Separar os dois líquidos depois da extração.
Equipamentos na indústria
1. Equipamentos por estágios: compostos por subunidades discretas (estágios) onde as fases são colocadas em contato, misturadas, separadas e enviadas para subunidades adjacentes. O equilíbrio entre as fases é alcançado em cada estágio. Ex: Misturador-Decantador 
Extração em operação em corrente cruzada. Série de misturadores-decantadores
Coluna de pratos perfurados 
Fase dispersa = leve.
· Forma-se barragem abaixo do prato, onde fase leve se acumula. 
· Passagem através dos pratos provoca a dispersão em número 
elevado de gotas e gera área de transferência de massa do estágio
superior.
· Fase pesada, escoa descendentemente e entre um estágio e
outro passa pela região externa das barragens
2. Equipamentos de contato diferencial: fornecem área de contato para a transferência de massa ao longo de praticamente todo o comprimento do equipamento. O equilíbrio não é estabelecido em nenhum ponto do extrator, sendo as fases separadas somente na extremidade deste
Coluna de Recheio ou Empacotadas. 
· Recheio tipo aleatório
· Tamanho < 1/8 do diâmetro da torre
· Material: plástico, cerâmico, metálico. 
· Recheio tipo estruturado. 
· Unidades maiores constituídas de placas finas ou folhas de material.
· plástico ou metálico recurvado;
· densamente empacotado geometria regular
Coluna de discos rotativos. Extração contra-corrente
Extração Líquido-Líquido em Sistemas Poliméricos de Duas Fases
Vantagens:
1.Possibilidade de operação contínua em larga escala à temperatura ambiente; 
2.Manutenção das proteínas em solução em meio a polímeros ou sais que as protegem da desnaturação; 
3.Possibilidade de eliminação de algumas etapas do processo de purificação para moléculas intracelulares, devido à separação de células e seus fragmentos em uma determinada fase (geralmente fundo) simultânea ao fracionamento de proteínas e outras moléculas.