Técnicas de identificação de bactérias, fungos e virus

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Aline Cristina | Medicina veterinária - UFERSA 
Técnicas de identificação microbiológicas 
 
 
 
 
 
Identificação de bactérias 
 
 
Muitos microrganismos patogênicos encontrados na natureza não são prejudiciais para humanos, animais e plan-
tas. Realmente, muitas bactérias e fungos têm importante contribuição para as atividades biológicas que ocorrem no solo, 
na água e no trato alimentar de animais. Os microrganismos que podem causar doenças em animais ou humanos são 
referidos como patogênicos. 
Bactérias são unicelulares, menores e menos complexas do que células eucarióticas, como as hemácias de mamí-
feros. Elas geralmente têm parede celular rígida contendo uma camada de peptidoglicano, multiplicam-se por fissão bi-
nária e exibem considerável diversidade morfológica. 
A investigação laboratorial de doenças bacterianas é necessária para identificar o agente etiológico e, algumas ve-
zes, para determinar a sensibilidade a antimicrobianos dos patógenos. 
O exame bacteriológico pode ser realizado nos mais diversos materiais. Deve-se colher a amostra diretamente da 
lesão. Pode ser colhida por meio de: 
 
- Lesões profundas: realizar rigorosa antissepsia da região externa e puncionar com seringa e agulha. 
- Fístulas e abscessos abertos: realizar rigorosa antissepsia da região externa e espremer o material da 
profundidade, colhendo a secreção com "swab" ou seringa. 
- Ouvidos, Vagina: realizar rigorosa antissepsia da região externa e colher com "swab". 
- Sangue: Realizar tricotomia, antissepsia de pele, deixar secar. Se a coleta não for feita a vácuo proceder à 
desinfecção da tampa do frasco antes da inoculação de pelo menos 5 ml de sangue. Informar ao laboratório a suspeita 
diagnóstica. Os frascos para hemocultura devem ser solicitados ao laboratório antes da coleta. 
- Urina: Para se fazer análise bacteriologia é importante que não haja nenhuma contaminação da amostra. Nunca 
colher com swab, pois inviabiliza a contagem de colônias. 
- Colheita por Citologia Aspirativa por Agulha Fina ou Punção Aspirativa: Usada para massas e órgãos superficiais 
como massas expansivas, linfonodos, tireóide. Usar seringa de 5, 10 ou 20 ml com agulha de diâmetro. Aspirar material 
representativo, colocar na lâmina e deslizar sobre outra. Fixar as 2 lâminas ao ar ou em álcool por 20 a 30 minutos e enviar 
ao laboratório em frasco porta-lâminas com histórico detalhado, técnica de colheita e de fixação. 
A presença de bactérias patogênicas pode ser confirmada pelo exame de esfregaços corados, pelas características 
culturais e bioquímicas. 
 
 
 
Cultivo bacteriano 
 
 
A cultura bacteriana é uma técnica dirigida e controlada do crescimento de colônias de bactérias, a fim de facilitar 
o seu estudo. Muitas vezes, o estudo da morfologia, arranjo e interpretação das propriedades de coloração não são 
suficientes para identificar o agente bacteriano e, por esse motivo, os pesquisadores de alguns ramos da biologia recorrem 
 
 
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à cultura, com o objetivo de melhorar o desempenho dos processos envolvidos, estudando as características culturais da 
bactéria como a capacidade de crescer em meio seletivo. 
O crescimento dos micro-organismos nos diferentes meios de cultura fornecerá as primeiras informações para a 
sua identificação. O potencial de crescimento de cada meio de cultura deve ser conhecido, fazendo com que seja possível 
adequar ao perfil bacteriano esperado para cada material. 
O meio de cultura consiste em substância líquida ou gelificada, simples ou complexa, que permite a nutrição, o 
crescimento e a multiplicação dos micro-organismos. Alguns procedimentos são fundamentais na hora de preparar cada 
meio de cultura, a fim de obter melhores resultados e evitar contaminações. Os meios de cultura podem ser classificados 
de acordo com o seu estado físico, pela sua composição e a sua utilização. No que se refere ao seu estado físico, os meios 
podem ser líquidos ou gelificados; em relação à composição do meio, podem ser classificados como naturais, sintéticos e 
semi-sintéticos. Já em relação à sua prática laboratorial, pode-se considerar os meios de base, os meios enriquecidos e os 
meios seletivos. 
Os meios gelificados permitem o crescimento das células formando colônias e são obtidos a partir de um meio 
líquido ao qual é adicionada uma substância gelificante que, no princípio, era a gelatina, mas passou a ser o ágar-ágar. A 
cultura bacteriana utiliza diferentes tipos de gel ágar, sendo que cada um deles tem uma especificidade. Confira a seguir 
as características de alguns deles: 
 
 
Ágar nutriente (AN) 
 
Trata-se de um meio relativamente simples e muito usado nos procedimentos do 
laboratório de microbiologia. As suas finalidades incluem a análise de água, alimentos e leite 
como meio para cultivo preliminar das amostras submetidas à exames bacteriológicos. 
 
 
 
 
 
Ágar sangue (AS) 
O meio oferece excelentes condições de crescimentos para a maioria dos micro-organismos. 
Dentre as suas finalidades estão o isolamento de micro-organismos não fastidiosos e verificação de 
hemólise dos Streptococcus spp. e Staphylococcus spp. 
 
 
 
 
 
Ágar chocolate (CHOC) 
É amplamente utilizado para o cultivo de micro-organismos exigentes . 
 
 
 
 
 
 
O processo de identificação propriamente dito começa com a observação das características das colônias isoladas 
(a olho nu, com lupa ou microscópio, usando a objetiva de menor aumento). Os seguintes critérios são utilizados para a 
caracterização colonial: 
 
• Forma - punctiforme (até 1 mm de diâmetro); circular, com mais de 1 mm de diâmetro; irregular; 
filamentosa; radiada, dentre outras; 
• Tamanho - em milímetros; 
 
 
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• Elevação - achatada (alta, baixa), espraiada, convexa, umbilicada ou umbonada, mamilonada, papilífera, 
etc.; 
• Bordos - inteiros, ondulados, lobados, denticulados, franjados, etc.; 
• Superfície - lisa, rugosa; 
• Estrutura - amorfa, granulosa, filamentosa; 
• Caracteres ópticos - opaca, translúcida e transparente; 
• Pigmentação - amarela, branca, preta, rósea, etc.; 
 
 
 
As características culturais podem ser observadas também em meios líquidos e sólidos inclinados (em tubos). 
As principais características observadas em meio líquido são: 
• Tipo de crescimento na superfície - sem crescimento, película, grumosa, membranosa, anel (circular); 
• Opacidade ou turvação - nula, ligeira ou suave, regular, intensa, transitória, persistente; 
• Cheiro - nenhum, pronunciado, semelhante a ...; 
• Sedimento - compacto, grumoso, viscoso, granular, escamoso, quantidade do sedimento (abundante, es 
casso, nulo); 
• Pigmentação. 
 
Após a observação dessas características devem ser feitos esfregaços para colorações especiais, para observação 
da morfologia microscópica (forma, arranjos, tamanho e reação ao Gram), presença ou ausência de esporos (forma e 
localização, com deformação ou não do corpo bacteriano), flagelos (número e localização), cápsulas. 
 
 
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Técnicas bioquímicas 
 
A investigação das atividades metabólicas das bactérias “in vitro” é chamada de Provas Bioquímicas e servem para 
auxiliar o microbiologista a identificar grupos ou espécies de bactérias ou leveduras através da verificação das transfor-
mações químicas, que ocorrem num determinado substrato, pela ação das enzimas de um dado microrganismo. Como 
muitas vezes um determinado microrganismo possui um sistema enzimático específico, promovendo transformação bio-
química específica, as provas bioquímicas podem ser utilizadas na prática para a sua caracterização. 
Para a realização das provas bioquímicas é necessário utilizar meios de cultivo especiais contendo o substrato a ser 
analisado e fornecer ao microrganismo as condições nutritivas e ambientais necessárias ao seu desenvolvimento. 
 
 Para bactérias gram positivas: 
 
Catalase: A catalaseé uma enzima produzida por certas bactérias, que converte o peróxido de hidrogênio (água 
oxigenada) (H2O2) em água (H2O) e oxigênio (O2). Para pesquisá-la, basta colocar algumas gotas de água oxigenada sobre 
a cultura. Estando a catalase presente, haverá o desprendimento de bolhas, indicando a presença de oxigênio no meio. 
 
Teste positivo: bolhas/ Sthaphylococcus sp 
Teste negativo: sem bolhas/ Streptococcus sp 
 
 
 
 
 
Coagulase: Verifica a capacidade de micoorganismos reagirem com o plasma e 
formarem um coágulo. A bactéria produz a enzima coagulase que na presença do plasma 
provoca sua coagulação. Demora 4 horas. As bactérias quebram fibrinogênio em fibrina e 
ela fica coberta de fibrina, tornando-se invisível para o sistema imune. Separa a espécie de 
Staphylococcus Aureus, que é coagulase positiva, das demais que são negativas. 
 
Teste positivo: coagula o plasma/ Staphylococcus Aureus 
Teste negativo: não coagula/ Staphylococcus sp 
 
 
 
 
 
 
 
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Para bactérias gram negativas 
 
 
TSI (Tríplice Açúcar e Ferro): é utilizado para a diferenciação e identificação de bacilos gram-negativos, com base 
na fermentação de carboidratos e produção de Sulfeto de hidrogênio (H2S) e gás. Na sua composição contém três tipos 
de açúcar – glicose, lactose e sacarose, a substância Vermelho de fenol responsável por indicar o pH, para identificação 
da fermentação dos açucares e o tiossulfato de ferro, que detecta a produção de H2S pelo aparecimento de um precipitado 
preto (sulfato ferroso). 
A fermentação é indicada pela mudança da cor do indicador de PH de vermelho para amarelo e a produção de 
sulfato ferroso enegrece a base do meio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fermentação da glicose: Envolve a utilização de um meio com glicose ou outro açúcar e um corante, como o azul 
de bromitol. Com a fermentação do açúcar pelas bactérias, o verde do corante se torna amarelo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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SIM (Sulfato/Indol/Motilidade): Determina a habilidade do microrganismo de produzirem indol pela degradação 
do triptofano. O triptofano é um aminoácido que pode ser degradado por certas bactérias resultando na produção de 
indol, que é evidenciado após a adição do reagente de Kovacs. Se Goteja Kovacs-amarelo no tubo e se ficar rosa é porque 
coexiste esta bactéria. E pelo caminho da agulhada no tubo identifica-se a motilidade da bactéria. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Citrato: Se a bactéria é capaz de utilizar o citrato sódio como única fonte de 
carbono para crescer. Para positivo o meio fica azul ocorrendo a alcalinização. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Oxidase: A citocromo-oxidase é a enzima que oxida o citocromo C. A 
presença do citocromo C é demonstrada tratando-se a cultura com uma solução 
de p-fenileno-diamina. Quando presente, a p-fenileno-diamina é oxidada e há o 
surgimento de cor vermelha que muda gradativamente para azul, pelo contato 
com a luz. Quando ausente, a cor do crescimento não se altera. 
 
 
 
 
 
Motilidade 
 
 
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Soroaglutinação 
 
A soroaglutinação é um método simples e barato utilizado para identificar bactérias ou anticorpos em soro 
sanguíneos de animais. O teste é realizado adicionado uma gota do antígeno e uma do soro sanguieno, seguido de 
homogeneização. A presença de grumos determina a presença de anticorpos para uma determinada bactéria. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Identificação de fungos 
 
 
 
 
Os fungos são microrganismos que constituem um grupo diversificado e abundante na natureza, fazendo parte de 
vários nichos no ambiente, incluindo a microbiota de homens e animais. São caracterizados por estruturas unicelulares 
ou multicelulares e classificados de acordo com sua morfologia em filamentosos, leveduras e dimórficos. Na clínica 
veterinária de pequenos animais, os fungos patogênicos mais frequentemente isolados são os filamentosos, 
especialmente os dermatófitos, seguidos das leveduras do gênero Malassezia, particularmente a M. pachydermatis. 
 
A colheita pode ser por meio de: 
 
Raspado, onde se usa um agente não perfurante, como uma gilete, para fazer escarificação da pele no limite da 
borda da lesão, colocar o raspado em placas estéreis e acondicionar em envelopes para o envio ao laboratório. 
Abcessos, a secreção é colhida com seringa, acondicionada em um frasco estéril, pode ser refrigerado por até 24 h 
Fita adesiva, onde se coloca a fita adesiva na pele lesionada e depois acondiciona em placas de vidro e cora com o 
corante Azul de algodão. 
 
Há dois principais tipos morfológicos principais: fungos filamentosos (bolores ou mofos) e leveduras. Os bolores 
crescem como filamentos ramificados chamados hifas, enquanto as leveduras unicelulares são células Globosas, ovais, 
em brotamento. 
 
 
 
As espécies fúngicas podem ser saprofíticas, parasitas ou mutualistas. Os fungos mutualistas têm associação obri-
gatória com outros microrganismos e não são patogênicos. Os saprofíticos, que estão amplamente distribuídos no ambi-
ente e envolvidos na decomposição de matéria orgânica, algumas vezes causam infecções oportunísticas em animais. Os 
dermatófitos parasitas são patógenos, causando a infecção cutânea denominada tinha em animais. O crescimento exces-
sivo de leveduras, que frequentemente são comensais na pele e nas membranas mucosas, pode causar lesões localizadas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Características da colônia dos fungos: 
 
O aspecto pode ser: Aveludado, algodonoso, pulvurulento, úmido. 
Na coloração da colônia deve-se observar a cor da superfície e a cor do fundo da colônia. 
 
 
 
 
 
Identificação de vírus 
 
 
O termo “vírus” refere-se a membros de uma classe única de agentes infecciosos que são extremamente pequenos, 
contendo somente um único tipo de ácido nucléico e tendo uma dependência absoluta de células vivas para replicação. 
A presença de vírus nos tecidos pode ser confirmada pelo isolamento de vírus vivo, pela demonstração de partículas 
virais ou de antígenos virais e pela detecção do ácido nucléico viral. 
 
A colheita dos vírus pode ser feita por: 
 
Método direto: O vírus vivo é retirado do tecido do hospedeiro infectado e é isolado. 
Método indireto: Sangue é coletado do hospedeiro infectado em busca dos anticorpos para o vírus. 
 
No método direto ocorre o isolamento de vírus usando-se culturas celulares, ovos embrionados ou animais experi-
mentais. 
 
A propagação viral em animais de laboratório com a finalidade de diagnóstico não vem sendo muito utilizada após 
o advento das culturas celulares, que fornecem uma opção mais simples e prática. Os camundongos estão limitados em 
seu uso no diagnóstico de arbovírus, e o vírus da raiva. Eles são inoculados por via intracerebral ou intraperitoneal e 
observados por cerca de duas semanas para verificar o desenvolvimento dos sintomas clínicos antes de serem sacrificados 
para a realização de exames histopatológicos dos órgãos afetados e/ou de testes sorológicos para a identificação do vírus 
isolado. 
 
 
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Até a década de 1950, os ovos embrionados constituíam no sistema hospedeiro de escolha para a propagação de 
muitos vírus. Ainda hoje são utilizados para isolamento de vírus aviários, vírus da influenza e para a produção de alguns 
tipos de vacinas. Como o ovo de galinha apresenta vários tipos de tecido em ambiente estéril, antes do surgimento das 
culturas celulares este tinha um papel importante no isolamento e identificação de vírus. O cultivo de vírus em ovos 
embrionados é um método útil no diagnóstico das infecções virais, na produção de vacinas, na manutenção de vírus em 
condições laboratoriais para o preparo de antígenos utilizados em reações sorológicas e para outras finalidades de pes-quisa. 
A inoculação em ovos embrionados ocorre por quatro vias: cavidade amniótica, cavidade alantoica, membrana 
cório-alantoica e saco vitelínico. A escolha do tipo de via de inoculação depende da especificidade do vírus que se quer 
isolar, a uma dada membrana, ou pelo estágio de desenvolvimento do embrião. No isolamento primário utiliza-se a 
cavidade amniótica, o que aumenta as chances de isolamento viral pela presença do embrião que representa muitos 
tecidos celulares diferentes. Na adaptação do vírus ao ovo, para a produção de reagentes ou vírus vacinais, utiliza-se a 
cavidade alantoica, cujo volume de material obtido é maior. 
 
 
A utilização das técnicas de cultivo celular para isolamento viral teve início após quatro importantes fatos: o em-
prego das técnicas assépticas cirúrgicas; a descoberta dos antibióticos; o desenvolvimento de um meio de cultura para a 
manutenção de células in vitro e técnicas de cultura celular em monocamada. 
Os vírus podem ser demonstrados por microscopia eletrônica em espécimes diagnósticos. Esse método pode ser 
usado não somente para reconhecimento de infecções virais mistas, mas também para detecção de vírus incapazes de 
crescimento in vitro. 
No método indireto, a identificação dos vírus é feita por imunofluorescência, ELISA, imunodifusão e fixação de 
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A técnica de imunofluorescência utiliza anticorpos marcados com corantes fluorescentes para revelar a formação 
de imunocomplexos vírus-anticorpo. Os anticorpos marcados são chamados de conjugados. O corante fluorescente usado 
mais frequentemente em virologia é o isotiocianato de fluoresceína, o qual produz uma fluorescência verde-amare-
lada. Pode ser direta ou indireta. 
 
 
 
Imunofluorescência Direta 
 
 
É um método utilizado para identificar muitos antígenos virais. Na IF direta, um conjugado de especificidade 
conhecido é adicionado a células infectadas por vírus, fixados em uma lâmina de microscópio. Se o anticorpo é específico 
para o antígeno, ocorre a formação do complexo que é visualizado pela fluorescência, observado ao microscópio de 
fluorescência. Se o conjugado não é específico para o antígeno, não há formação de imunocomplexos, logo não há 
fluorescência. 
 
Imunofluorescência Indireta 
 
Esta técnica é usada para identificar antígeno ou anticorpos. O teste é realizado em duas etapas. Na primeira etapa, 
anticorpos não-marcados são adicionados a células infectadas fixadas a uma lâmina de microscópio. Após incubação, as 
lâminas são lavadas para remover anticorpos não-ligados. Na segunda etapa, um anticorpo anti-imunoglobulina 
conjugado com fluoresceína é adicionado. O tipo de conjugado é determinado pela espécie do anticorpo usado na 
primeira etapa. Por exemplo, se uma imunoglobulina humana é utilizada na primeira etapa, o conjugado anti-
imunoglobulina humana é empregado na segunda etapa. 
 
 
 
 
ELISA 
 
O teste de ELISA baseia-se em reações antígeno-anticorpo detectáveis por meio de reações enzimáticas. 
A enzima mais comumente usada nesta prova á a peroxidase, responsável por catalisar a reação de desdobramento 
da água oxigenada (H2O2) em H2O mais O2. 
 
 
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Existem diversos tipos de testes de ELISA. O modelo mais simples é conhecido como ELISA indireto, onde um antí-
geno que se encontra aderido a um suporte sólido (placa de ELISA) é preparado e, em seguida, colocado sobre os soros 
que estão sendo testados, em busca de anticorpos contra o antígeno. Caso estejam presentes anticorpos no soro, espe-
cíficos para o antígeno em questão, haverá a formação da ligação antígeno-anticorpo que, por conseguinte, é detectada 
pela adição de um segundo anticorpo dirigido contra imunoglobulinas da espécie que está sendo pesquisada. Este anti-
corpo anti-IgG, ligado à enzima recebe o nome de conjugado. Quando adiciona-se o substrato apropriado para a enzima, 
os locais onde ocorre a reação antígeno-anticorpo, que apresentam uma coloração característica, sendo que esta colora-
ção varia de acordo com o substrato. 
 
 
 
Imunodifusão 
 
 
A Imunodifusão é realizado em ágar. A técnica envolve a aplicação de uma amostra fluida, contendo o vírus sob 
teste, em um poço oposto a outro que contém anti-soro. Quando o fluido se difunde para fora dos poços, forma-se linha 
de precipitação caso a amostra sob teste contenha antígeno viral. Embora esse teste seja barato e fácil de ser realizado, 
é relativamente insensível. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Antígeno Antígeno 
Antícorpo 
Linhas de precipitação