Aula 6 Eletroforese bidimensional (2-D) e

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Disciplina: Plataformas Moleculares para as
Atividades Biológicas
Aula 6: Eletroforese bidimensional (2-D) e
espectrometria de massas (MS)
Apresentação
Após algumas aulas estudando técnicas no nível genômico, aprofundaremos as investigações no nível proteômico.
Conheceremos o conjunto das proteínas que são expressas por uma determinada célula, em resposta a um determinado
estímulo.
Nesta aula, além de conhecermos o per�l de expressão, estudaremos as modi�cações pós-traducionais pelas quais essas
proteínas passam, bem como o mapa de interações entre elas. E, por meio desse tipo de análise, compreenderemos como
as células respondem a determinadas condições.
Bons estudos!
Objetivos
Discutir os princípios da técnica de proteoma;
Enumerar as etapas necessárias para sua execução passo-a-passo;
Correlacionar as informações obtidas a partir da técnica com o processo de tradução.
A tradução nas células
Após a etapa de transcrição, toda a informação genética contida em uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) mensageiro
(RNAm) será traduzida em proteínas, conforme ilustra a �gura a seguir.
 Resumo do dogma central da biologia molecular: replicação, transcrição e tradução.
Fonte: Fancy Tapis, Shutterstock.
Cada trinca de nucleotídeos ou códons do RNAm corresponde a um aminoácido que será incorporado à sequência do
polipeptídio.
Como o processo de tradução começa?
Procariotos
Nos procariotos, o reconhecimento da região
conservada Shine-Delgarno no RNAm pelos
ribossomos determina o início da tradução. Essa
região está posicionada algumas bases antes do
códon de iniciação AUG. Nos procariotos, a
transcrição e tradução ocorrem simultaneamente,
dado que não há separação física entre núcleo e
citoplasma.

Eucariotos
Em eucariotos, próximo à extremidade 5’ do RNAm,
existe o sítio de reconhecimento dos ribossomos
(RBS, do inglês ribosome binding site), local a partir
de onde se inicia a tradução. Nos eucariotos, a
tradução ocorre no citoplasma das células, e nas
organelas mitocôndria e cloroplasto, que possuem
seu próprio material genético.
Além das moléculas de RNAm contendo a informação genética, são necessárias também as moléculas de RNA transportador
(RNAt), as quais possuem os anticódons - com complementariedade para os códons do RNAm -, e ancoram os vinte diferentes
tipos de aminoácidos, conforme ilustra a �gura a seguir.
 O RNA transportador – RNAt | Fonte: Soleil Nordic / Shutterstock
Como existem 64 códons possíveis (4 bases x 4 bases x 4 bases), e apenas 20 aminoácidos, dizemos que o código genético é
degenerado, dado que um mesmo aminoácido pode ser codi�cado por mais de uma trinca, conforme ilustra a �gura a seguir.
 Código genético degenerado. Fonte: Magnetix, Shutterstock.
Nesse cenário de tradução, os ribossomos funcionam como local de síntese proteica. Eles são constituídos por duas
subunidades, uma menor e outra maior, as quais se encaixam no momento da tradução, deixando uma fenda, por onde o RNAm
atravessa, conforme ilustra a �gura a seguir.
 Síntese de proteínas. Fonte: Gritsalak karalak, Shutterstock.
Além do sítio de ligação ao RNAm, os ribossomos possuem os sítios de ligação ao RNAt, conhecidos como:
1
Sítio aminoacil (A)
2
Sítio peptidil (P)
3
Sítio de saída (E, do inglês exit)
Vejamos como acontece esse processo:
1 O RNAt que chega ao local de síntese proteica trazendo o aminoácido a ser incorporado à cadeia acessa inicialmente o sítioA.
2 Com a translocação do ribossomo ao longo do RNAm durante a tradução, o RNAt desliza sucessivamente do sítio A,passando pelo P, até chegar ao E, onde posiciona-se para ser liberado.
3 Em paralelo, ocorre a ligação peptídica entre os aminoácidos que estão ancorados aos tRNAs posicionados nos sítios A e P,cujos anticódons sejam complementares aos códons do RNAm.
Esse processo está ilustrado na �gura a seguir.
 Esquema da interação entre RNAm, RNAt e ribossomo. Fonte: Designua / Shutterstock.
O �nal da tradução é sinalizado pelos códons UAG, UGA e UAA, para os quais não há aminoácido correspondente.
Atividade
1 - PC-PI (2012) - A informação genética presente no DNA está armazenada na forma de um código decifrado durante a tradução
de proteínas. A esse respeito, é correto a�rmar que:
a) Códons formados por diferentes nucleotídeos podem codificar um mesmo aminoácido.
b) Códons formados por uma dada trinca de nucleotídeos especificam diferentes tipos de aminoácidos.
c) Códons que não especificam nenhum aminoácido induzem a síntese de proteínas sem função.
d) O códon AUG especifica o aminoácido fenilalanina, que dá início à cadeia proteica.
e) A terminação da síntese proteica depende da adição de metionina à cadeia proteica.
Regulação da tradução
Após a tradução, e em organismos eucariotos, algumas proteínas podem passar por um processo de modi�cação pós-
traducional.
Trata-se de um mecanismo enzimático pelo qual podem ser adicionados alguns
radicais aos aminoácidos, in�uenciando na atividade biológica das proteínas, em sua
localização celular, hidrofobicidade e na taxa de degradação.
Exemplo
Alguns exemplos de adição de mecanismo enzimático a aminoácidos:
Fosforilação;
Glicosilação;
Metilação etc.
Os mecanismos que in�uenciam ou inibem a degradação de proteínas afetam a estabilidade dessas moléculas e são
considerados uma forma de controle da expressão gênica.
A técnica de proteoma
Imagine que você esteja interessado em pesquisar o padrão de expressão proteica diferencial de células neoplásicas, isto é, o que
essas células expressam de forma diferente das células saudáveis.
Isso quer dizer que você gostaria de pesquisar para quais vias metabólicas as células neoplásicas podem estar polarizando, o que
permitiria uma visão mais ampla dos processos patológicos pelos quais elas atravessam e, quem sabe, a revelação de um
possível biomarcador.
Para dar início a essa análise, é necessário acessar o repertório de proteínas da sua célula de estudo. Observe esse processo na
imagem a seguir.
 Célula eucariótica e localização de alguns dos conjuntos de biomoléculas | Fonte:
MENCK, C. F. M.; SLUYS, M-A. V. Genética Molecular Básica: dos Genes aos Genomas. 1.ed.
Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2017.
De modo semelhante ao que você aprendeu para o ácido nucleico, é necessário isolar o conjunto de proteínas de um dado tipo
celular ou tecido, que permitirão elucidar os caminhos e sinalizações que levaram a uma determinada condição. Vejamos como
ocorre esse processo:
Clique nos botões para ver as informações.
Como selecionar essas proteínas? Inicialmente, é necessário lisar as células do tecido ou órgão de interesse, para a
obtenção do extrato proteico total.
Mas, como o objetivo é conhecer o per�l proteico, é necessário padronizar essa lise de modo a obter a maior quantidade e
variabilidade possível de exemplares de proteínas na sua preparação, contemplando núcleo, citoplasma e membrana.
Para isso, a extração de proteínas deve ser realizada na presença de inibidores de proteases – ou seja, inibidores das
enzimas que clivam as ligações peptídicas entre os aminoácidos que compõem as proteínas.
Você já pode imaginar porque é necessário um inibidor de proteases, não é? Não basta apenas isolar as proteínas, elas
devem ser mantidas íntegras, e preservadas, para o sucesso das etapas subsequentes.
Existem diferentes formas de se promover a lise, na dependência do tipo celular que é o alvo. Você pode realizar a lise em
uma solução hipo-osmótica, por ciclos de congelamento em nitrogênio líquido/descongelamento, por meio da ação de
detergentes, de enzimas em solução iso-osmótica, de ondas ultrassom (sonicadores), uso de pressão, processos
mecânicos, beads de vidro, entre outros.
Lise celular 
Após optar pelo método de lise mais adequado as suas amostras, é necessário remover os contaminantes que são liberados
com o rompimento, como por exemplo, os lipídeos, polissacarídeos, ácidos nucleicos e sais e, por �m, solubilizar as
proteínas, que são o produto de interesse.
Para a inativação desses interferentes,existem kits comerciais disponíveis, que facilitam a execução dessa etapa. Mesmo
que a aquisição do kit não seja viável, é possível realizá-la no laboratório, com reagentes que permitam a precipitação das
proteínas, e deixam os interferentes em solução.
Desse modo, você pode utilizar protocolos de precipitação baseados exclusivamente em acetona ou ácido tricloroacético
(TCA), acetona e TCA simultaneamente ou, sulfato de amônio.  
No caso do sulfato de amônio, o processo também é conhecido como salting out; e baseia-se na agregação das proteínas na
presença de altas concentrações de sal, fazendo com que as mesmas precipitem da solução.  
Independentemente do reagente escolhido, sua associação a etapas subsequentes de centrifugação, permite a formação de
um pellet ou agregado de proteínas.
Remoção de interferentes e precipitação das proteínas 
Ao �nal desse procedimento, basta solubilizar esse pellet de proteínas em um tampão de hidratação, o qual mantenha as
proteínas desnaturadas e reduzidas, visando às próximas etapas.  
Para isso, podem ser usados compostos caotrópicos, que rompem as interações não covalentes, e desnaturam as proteínas
por interferirem na sua estabilidade em solução.  
Esses compostos podem ser baseados em:
Ureia – rompendo as ligações de hidrogênio e iônicas entre os resíduos de aminoácidos;
Tioureia – rompendo as ligações hidrofóbicas; provocando a desnaturação e a solubilização das proteínas,
respectivamente.
Detergentes não iônicos e surfactantes, como sulfonato de 3-[(3-cloroamidopropil) dimetilamonio] -1-propano (CHAPS) e o
Triton X-100 são utilizados para a solubilização de proteínas hidrofóbicas, uma vez que rompem as interações hidrofóbicas
entre os resíduos dessas proteínas.  
Agentes redutores como 1,4 ditiotreitol (DTT) e β-mercaptoetanol devem ser utilizados para o desdobramento da proteína,
através do rompimento das pontes dissulfeto, e impedindo sua reoxidação.
Solubilização das proteínas 
Quanti�cação de proteínas totais
Após a extração de proteínas totais, é necessário avaliar se o rendimento do método está su�ciente para dar continuidade ao
protocolo. Existem diferentes técnicas baseadas em espectrofotometria que podem ser utilizadas para a mensuração do extrato
proteico total, dentre elas o método de biureto, de Lowry e de Bradford.
Método de Bradford
Em função de sua sensibilidade e praticidade, o método de Bradford tem sido a técnica escolhida em muitos laboratórios de
pesquisa, podendo ser aplicado em uma grande variedade de espécimes clínicos, como plasma, soro, líquor, saliva, leite humano,
suspensões de células e urina.
Vejamos como ocorre esse processo:
1 Por esse método, utiliza-se um corante chamado Coomassie Brilliant blue G-250, o qual interage com as proteínas de altopeso molecular.
2 Essa interação provoca o deslocamento do equilíbrio do corante para a forma aniônica, a qual absorve luz no comprimentode onda (λ) de 595nm.
3 Desse modo, basta misturar um determinado volume da sua amostra a esse corante, e quanti�car em espectrofotômetro.
4
Para saber a quantidade exata em µg/µL, você pode comparar os valores de densidade óptica (DO) obtidos para a amostra
com aqueles obtidos para uma curva padrão de concentração conhecida, normalmente preparada com albumina de soro
bovina (BSA).
5 Utilizando alguns programas estatísticos, é possível construir um grá�co a partir dos pontos da curva padrão, e gerar umaequação da reta.
6 Com essa equação, é possível quanti�car a concentração de qualquer amostra, desde que você tenha os valores de DOobtidos por um espectrofotômetro, e estimados da mesma forma como estimou a curva padrão original.
Quanto maior a concentração de proteína na amostra, maior o valor de DO.
Eletroforese em gel bidimensional (2-D)
Após veri�car se o rendimento obtido a partir da técnica de extração de proteínas totais está su�ciente para atender o objetivo,
você pode dar início à técnica de proteoma propriamente dita, por meio de análise em gel bidimensional (2-D).
Isoeletrofocalização (IEF)
A técnica se inicia com a etapa conhecida como isoeletrofocalização (IEF), procedimento a partir do qual as proteínas são
separadas através do seu ponto isoelétrico (pI).
Você já ouviu falar nesse termo nas aulas de Bioquímica?
Nesse processo uma proteína apresenta carga elétrica igual a zero, ou seja, o valor de equilíbrio de
cargas negativas e positivas dos grupamentos iônicos dos aminoácidos que a compõem.

Para isso, são utilizadas tiras com gradiente de pH imobilizado (IPG, do inglês immobilized pH gel), as quais se apresentam de
forma linear, e cujo comprimento varia normalmente de 11 a 18cm, contemplando valores de pH no intervalo de 4 a 7.  
Essas tiras disponíveis comercialmente são formadas por polímeros de acrilamida com agentes tamponantes ácidos e básicos.
Hidratação das tiras IPG
As tiras IPG devem ser hidratadas com o extrato proteico total, e submetidas, em seguida, a corrente elétrica, para que ocorra
migração das proteínas no plano horizontal de acordo com o pI.  
As proteínas migram até que a carga elétrica sobre elas seja nula, conforme ilustra a �gura a seguir.
 Primeira dimensão da eletroforese bidimensional | Fonte: BIANCO, B; LIPAY, M.V.N.
Biologia Molecular – Métodos e Interpretação: 1.ed. São Paulo: Editora Roca, 2015.
Nesse momento, a migração é interrompida, e a primeira etapa de separação por pI é concluída. A programação de voltagem e
tempo na etapa de IEF depende do tamanho da tira IPG e do intervalo de pH.
Segunda dimensão
Após serem separadas na primeira dimensão de acordo com seu pI, as proteínas são separadas em uma segunda dimensão, de
acordo seu peso molecular, por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS-
PAGE), o qual confere ao gel um caráter desnaturante, conforme ilustra a �gura a seguir.
 Segunda dimensão da eletroforese bidimensional | Fonte: BIANCO, B; LIPAY, M.V.N.
Biologia Molecular – Métodos e Interpretação: 1.ed. São Paulo: Editora Roca, 2015.
Esse gel corresponde a um polímero de acrilamida com bis-acrilamida, cuja porosidade pode ser regulada. Ele também pode ser
comercialmente adquirido em gradientes de 8-18% e 12-14%.
O SDS não só auxilia na ruptura da estrutura molecular das proteínas, linearizando-as, como também confere a elas carga elétrica
negativa. Com isso, a única forma de separar as proteínas a partir desse tratamento é através de seus respectivos pesos
moleculares.  
Desse modo, tal como na eletroforese de ácidos nucleicos em gel de agarose, ocorrerá a migração das partículas dotadas de
carga negativa do polo negativo para o polo positivo. Observe esse processo na �gura a seguir.
 Representação esquemática de separação de
proteínas com gel de poliacrilamida com SDS | Fonte:
MENCK, C. F. M.; SLUYS, M-A. V. Genética Molecular Básica:
dos Genes aos Genomas. 1.ed. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, 2017.
Nessa etapa, as tiras utilizadas na etapa anterior de IEF são apoiadas sobre esse gel e submetidas a nova voltagem, para que
ocorra a migração das proteínas em plano vertical, de acordo com o seu peso molecular, conforme ilustra a �gura a seguir.
 Esquema da separação de proteínas por meio da técnica de
eletroforese bidimensional | Fonte: MENCK, C. F. M.; SLUYS, M-A. V.
Genética Molecular Básica: dos Genes aos Genomas. 1.ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2017.
As proteínas podem ser identi�cadas em um eixo cartesiano, após coloração com Coomassie Blue ou nitrato de prata, e uso de
padrões de peso molecular.
Atividade
2 - FIOCRUZ (2010) – Na análise proteômica empregando eletroforese bidimensional, a focalização isoelétrica é realizada para:
a) Separar as proteínas pelo peso molecular.
b) Agrupar as proteínas pela quantidade total de cargas positivas.
c) Separar as proteínas pela quantidade total de cargas negativas.
d) Separar as proteínas de acordo com o ph onde a carga total de uma determinada proteína é nula.
e) Agrupar as proteínas de pi diferentes.
3 - FIOCRUZ (2010) –Com relação às limitações da técnica de eletroforese bidimensional, assinale a alternativa incorreta:
a) É impossível analisar todas as proteínas de uma amostra biológica em um único gel, devido à tremenda variação em abundância das
proteínas.
b) Caso seja aumentada a quantidade proteínas visando a detecção de proteínas menos abundantes, o gel é sobrecarregado pelas
proteínas de maior abundância e a resolução é perdida.
c) É necessário encontrar uma estratégia de solubilização e separação que atenda a todas as proteínas de uma amostra.
d) Proteínas de alto peso molecular (maiores que 200kDa) podem não migrar eficientemente no gel.
e) Proteínas muito pequenas (menores que 10kDa) se sobrepõem, devido à alta mobilidade no gel da primeira dimensão, o que resulta
em perda de resolução.
Análise dos padrões proteômicos
Após a eletroforese bidimensional e coloração, os géis são digitalizados, analisados e comparados em software adequado. A
partir daí, as proteínas podem ser diferenciadas quanto a seu ponto isoelétrico e peso molecular, bem como podem ser estimados
o número de spots, e avaliados os níveis de expressão. Observe esse processo a �gura a seguir.
 Gel bidimensional após a coloração | Fonte: ZAHA, A.; FERREIRA, H. B.;
PASSAGLIA, L. M. P. (Org.). Biologia Molecular Básica. 5.ed. Porto Alegre:
Editora ArtMed, 2014.
Normalmente, os géis são comparados em pares. Após análise das proteínas diferencialmente expressas, aquelas consideradas
especí�cas de cada amostra podem ser retiradas para identi�cação.
Espectrometria de massas
Vejamos o processo para a identi�cação das proteínas de interesse:
1
Os spots selecionados para extração do gel são digeridos por
hidrólise, utilizando a enzima tripsina.
2
Posteriormente, a amostra contendo a proteína extraída é
cristalizada na presença de uma matriz.
3
A amostra então é encaminhada para um equipamento
conhecido como espectrômetro de massas (MS, do inglês
mass spectrometry), para avaliação da medida da sua razão
massa/carga e abundância.
Um dos equipamentos mais utilizados é conhecido como MALDI-ToF-ToF (do inglês, Matrix Assisted Laser Desorption Ionization),
o qual baseia-se na ionização/dessorção das proteínas via laser assistida por uma matriz, seguido da análise da massa através
do tempo de voo (ToF, do inglês, time of �ight) dos íons no tubo de análise.
Isso quer dizer que, no equipamento, os peptídeos podem ser ionizados e acelerados após excitados e absorção da energia dos
pulsos de laser. Ocorre a vaporização da matriz, assim como ejeção do analito para a fase gasosa, o que faz com que os íons
protonados possam ser analisados e detectados.
Desse modo, além de uma fonte de ionização, o espectrômetro de massas também possui um analisador e um detector. Seus
componentes estão situados em um sistema a vácuo, evitando o movimento indesejado dos íons, conforme ilustra a imagem a
seguir.
 Espectrômetro de massas | Fonte: ZAHA, A.; FERREIRA, H. B.; PASSAGLIA, L. M. P. (Org.). Biologia Molecular Básica. 5.ed.
Porto Alegre: Editora ArtMed, 2014.
Os resultados do padrão de massas obtido (�ngerprint) após hidrólise proteolítica e de MS são avaliados utilizando o programa
especí�co e o Banco de Dados Humano IPI (International Protein Index), no qual se encontram as proteínas já anotadas.
Desse modo, além de uma fonte de ionização, o espectrômetro de massas também possui um analisador e um detector. Seus
componentes estão situados em um sistema a vácuo, evitando o movimento indesejado dos íons.
Atividade
4 - FIOCRUZ (2010) – Com relação à espectrometria de massa, assinale a alternativa incorreta:
a) A fragmentação dos peptídeos na célula de colisão ocorre de maneira imprevisível e aleatória, causando, em geral, fragmentos de
aminoácidos que não são utilizados para a identificação das proteínas.
b) No analisador, os peptídeos são separados em função da razão massa/carga (m/z).
c) Diferentes componentes do espectrômetro são mantidos a vácuo para evitar o movimento indesejado de íons.
d) Um espectrômetro de massa contém três unidades básicas, uma fonte de ionização, um analisador e um detector.
e) Na célula de colisão, os íons colidem com um gás (em geral He, Ar ou Ne), resultando na fragmentação do íon.
Um pouco mais de conhecimento
A resolução da técnica de eletroforese bidimensional e sua respectiva coloração para revelação do resultado apresenta
limitações, como:
1
Para proteínas presentes em baixas concentrações nas
células.
2
Para proteínas com pesos moleculares muito baixos ou altos.
3
Para proteínas hidrofóbicas e alcalinas.
Em função disso, diferentes estratégias podem ser assumidas, como a realização do proteoma para frações celulares e organelas
especí�cas, bem como a restrição do intervalo de pH na primeira dimensão para um grupo de proteínas, e o uso de colorações
especí�cas. 
Além dessas limitações, os mapas proteicos obtidos podem não representar a totalidade de proteínas expressas por uma célula,
em função de uma expressão por alterada por condições patológicas, ou fases do ciclo celular, por exemplo. 
Apesar disso, a técnica de proteoma vem sendo muito utilizada no estudo das doenças humanas, principalmente no estudo de
neoplasias. Pesquisadores estão engajados na busca de forma especí�ca e sensível por biomarcadores que permitam o
diagnóstico, prognóstico e acompanhamento do tratamento para muitos tipos de câncer.
Atividade
5 - Analise as a�rmativas e marque verdadeiro (V) ou falso (F):
a) A eletroforese em gel é uma técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas em um determinado gel durante a
aplicação de uma diferença de potencial.
b) A eletroforese em gel é utilizada para separar proteínas e moléculas de DNA e RNA.
c) Existem vários tipos de eletroforese em gel para analisar proteínas durante o processo de puri�cação. Entre elas, estão a eletroforese em gel
de poliacrilamida contendo dodecil de sódio sulfatado (SDS-PAGE), a eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante (Native PAGE) e o
gel em duas dimensões.
Referências
ALBERTS, B; JOHNSON, A; LEWIS, J.; RAFF, M.; WALTER, P.; ROBERTS, K.; MORGAN, D. Biologia Molecular da Célula. 6.ed. Porto
Alegre: Editora ArtMed, 2017.
BIANCO, B.; LIPAY, M.V.N. Biologia Molecular – Métodos e Interpretação. 1.ed. São Paulo: Roca, 2015.
MENCK, C. F. M.; SLUYS, M-A. V. Genética Molecular Básica: dos Genes aos Genomas. 1.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,
2017.
WATSON, J. D.; BAKER, T. A.; STEPHEN, P. B.; GANN, A.; LEVINE, M.; LOSICK, R. Biologia Molecular do Gene. 7.ed. Porto Alegre:
Editora ArtMed, 2015.
ZAHA, A.; FERREIRA, H. B.; PASSAGLIA, L. M. P. (Org.). Biologia Molecular Básica. 5.ed. Porto Alegre: Editora ArtMed, 2014.
Próxima aula
Mutação;
Método de Sanger;
Interferências e variações na/da técnica.
Explore mais
Assista ao vídeo:
Tradução (ARNm de proteína) <https://www.youtube.com/watch?v=cSCQ1NW3DrI> .
https://www.youtube.com/watch?v=cSCQ1NW3DrI