Resumo MBI 100

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Recombinação Genética
É o cruzamento de linhagens com genótipo (fenótipo) diferentes para possivelmente observar a ocorrência de recombinantes. Em procariotos existem 3 mecanismos de trocas genética. O DNA captado pela célula pode seguir 3 caminhos:
- Degradado por enzimas de restrição
- Replicado Per Se (se possuir sua própria origem de replicação=plasmídeo ou genoma de um fago)
- Sofrer recombinação com o cromossomo de hospedeiro
Recombinação= troca física de DNA
Recombinaçãohomóloga (entre sequências de homólogas de DNA, – que apresentam sequência quase identica paraq o pareamento de bases – mas de origem distintas)
EVENTOS MOLECULARES NA RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA
Proténa RecA = uma das reguladoras do sistema de reparação de erros na fita do DNA. Ativa o Sistema SOS, participando da recombinação homóloga
Sistema SOS= reparo do DNA na ausência de um molde (sem pareamento de bases) resultando na introdução de muitos erros = muita mutação.
Moléculas de DNA homólogos pareiam-se e permutam porções de DNA. O mecanismo envolve a quebra e reunião das regiões pareadas.
Endonuclease cliva uma fita da molécula de DNA doador e helicase afasta esse seguimento clivado (fita simples) da outra fita.
Proteínas SSB se ligam ao segmento de fita simples de DNA doador.
Proteína RecA se liga a região de fita simples para facilitar seu anelamento com uma outra fita de sequência complementar para fazer a invasão da fita de DNA homólogo receptor para o pareamento das bases formando regiões de heteroduples.
As moléculas são separadas gerando duas moléculas de DNA recombinado
*Efeitos da recombinação homólogas
Após a transferência, quando o fragmento de DNA da célula doadora se encontra na célula receptora, pode ocorrer a recombinação homóloga.
Em procariotos, apenas um fragmento cormossomal é transferido e será perdido se não houver recombinação pois não pode se replicar de forma independente. Por isso, a tranferência é apenas a primeira etapa da geração de organismos recombinantes.
*Detecção da recombinação
Células resultantes da recombinação devem apresentar fenótipo diferente das células parentais.
Linhagens receptoras que faltam alguma característica selecionável que será adquirida pelas células recombinantes são escolhidas.
Somente algumas poucas células recombinantes são detectadas por causa da grande sensibilidade do processo de seleção.
Se a taxa de mutação reversa for baixa será mais fácil observar a recombinação, por isso é preciso uma boa escolha de mutantes e de meios seletivos.
MECANISMOS DE TROCAS GENÉTICAS
TRANSFORMAÇÃO
Transferência onde o DNA livre é incorporado em uma célula receptora podendo promover alterações genéticas.
Procariotos são naturalmente transformáveis por possuírem uma única grande molécula de DNA que ao sofrer lise é extravasada.
*Frederick Griffith (1928)
Primeira evidência de transformação bacteriana.
A bactéria Streptococcus pneumoniae consegue invadir nosso corpo principalmente por causa da presença de uma cápsula polissacarídea e originam colônias lisas em meio de cultura (são virulentas) – Linhagem S.
Mutantes se a cápsula podem ser isolados e em meio de cultura apresentam aspecto rugoso – Linhagem R.
Camundongos infectados com a linhagem S morriam em um ou dois dias após a inoculação. Quando infectados com linhagem R não morriam. Quando células S mortas pelo calor eram injetadas com as células vivas de linhagem R ocorria morte do animal e isolando as células do organismo morto era possível observar células da linhagem S pois apresentavam cápsula. Griffith concluiu que células de linhagem R tinham sido transformadas dentro do indivíduo.
*Competência na transformação
Competente é a célula capaz de captar uma molécula de DNA e ser transformada.
Para isso é necessário a síntese de proteínas específicas para captar e receber o DNA de outras bactérias. Esse tipo de célula consegue se ligar a uma maior quantidade muito maior de DNA que células não competentes.
Ex: Acinetobacter, Bacillus, Streptococcus, Haemophilus, Neisseria e Thermus
Eletroporação: técnica física de introduzir DNA em organismos dificilmente transformáveis. Células são misturadas ao DNA e submetidas a pulsos elétricos curtos de alta voltagem, o envoltório nuclear fica permeável.
* Captação do DNA na transformação
O tamanho do fragmento competente é muito menor que o genoma da célula, além de serem degradados durante o processo de captação.
Essa pequena quantia de DNA fita dupla competente é reduzida pela conversão em segmentos de fita simples a medida que os fragmentos competentes são captados. Essa fita complementar é degradada.
OS fragmentos competem entre sí no momento da captação, por isso, se houver um aumento em excesso de DNA desprovido de marcador genético, há redução no número de transformantes.
*Integração do DNA transformantes
O DNA liga-se a superfície da célula por meio de uma proteína de ligação, há a captação do fragmento e o DNA se liga a uma proteína específica de competência. Ocorre recombinação do DNA com o genoma da célula receptora.
*Transfecação
Trasformação de bactérias por um vírus bacteriano (bacteriófago) e não DNA de bactéria.
 TRANSDUÇÃO
vírus bacteriano transfere DNA de uma célula para outra.
- Transdução generalizada: DNA de qualquer região do genoma do hospedeiro é empacotado no interior do vírion maduro, substituindo o genoma viral. Genes da célula doadora não possuem capacidade de replicação independente, por isso precisam fazer recombinação com o cromossomo da bactéria para não serem perdidos.
Quando uma célula bacteriana é infectada por um fago, um ciclo lítico pode ser iniciado e se ocorre, as enzimas responsáveis pelo empacotamento do DNA viral no bacteriófago podem acidentalmente empacotar o DNA da célula hospedeira.
Por não terem DNA viral não são capazes de promover infecção viral.
Quando a célula pe lisada, essas partículas transdutoras (vírion resultante) são liberadas junto com a de vírion normais (com DNA viral). Se forem usadas para contaminar uma população, essa parcela de partículas transdutoras vão infectar as células e liberar o DNA que receberam da bactéria, que sofrem recombinação com o DNA da nova célula hospedeira.
Ocorre em baixa frequência e não seletiva
* Transdução especializada: DNA de uma região específica encontra-se diretamente integrado ao genoma viral. Recombinação homóloga pode ocorrer também.
Primeiro caso de transdução especializada – genes de galactose foram transduzidos pelo fago lambda, de E. coli.
Quando o fago lambda faz lise de uma célula hospedeira, o genoma viral integra-se ap DNA do hospedeiro em um sítio específico. Esse sítio específico em E. coli está adjacente ao grupamento de genes que codificam enzimas envolvidas na utilização da galactose. Por isso a replicação do DNA viral passa a ser controlada ela célula bacteriana hospedeira.
Após a indução, o DNA do virus separa-se do DNA do hospedeiro. As vezes nessa separação vem uma parte do DNA do hospedeiro (ex: parte do genoma do operon da galactose da bactéria), assim como uma parte do DNA viral fica ligada ao DNA da bactéria. (EVENTO RARO)
EVENTO NORMAL – separação correta das partes de DNA do hospedeiro e do vírus.
Quando ocorre o evento raro em E. coli (parte do genoma do operon da galactose da bactéria é separada junto com o DNA viral), o DNA separado do vírus sofre replicação, a sintese dos fagos é completa e a célula sofre lise e libera fagos defectivos capazes de transduzir os genes de lactose. Para que esse processo seja viável para os fagos, há um limite de quantidade de DNA viral que pode ser substituido pelo da célula hospedeira; uma quantidade de DNA viral tem que ser mantida, afim de codificar o capsídeo proteico e outras proteínas necessárias à lise.
*Conversão fágica
Alteração do fenótipo de uma célula hospedeira decorrente da lisogenização. A lisogenia provavelemte traz um grande valor seletivo à célula hospedeira pois confere resistência à infecção por vírus do mesmo tipo. Gera também alterações genéticas eficientes nas células hospedeiras, tendo importância evolutiva considerável.*Ciclo lítico e Ciclo lisogênico
Ciclo lisogênico - O DNA do vírus incorpora no DNA da bactéria mas não interfere no metabolismo da bactéria, que continua reproduzindo normalmente, transmitindo o DNA viral às bactérias descendentes. 
Ciclo lítico - O DNA viral passa a comandar o metabolismo bacteriano e a fazer várias cópias que se transcrevem em RNAm virais. Com essa reprodução exagerada ocorre uma lise na célula, liberando os novos vírus que podem infectar outras bactérias e assim sucessivamente.
CONJUGAÇÃO
Envolve contato entre as células. Mecanismo codificado por plasmídeos.
Plasmídeos = moléculas de DNA circular de replicação autônoma e pode carregar genes que podem ser essenciais para as bactérias dependendo das condições. Pode ser transferidos de uma para outra por processo de conjugação (plasmídeos conjugativos). Esses plasmídeos usam esse processo para transferir cópia de seu DNA para novas células hospedeiras.
Assim, o processo de conjugação envolve uma célula doadora (contém plasmídeo conjugativo) e uma célula receptora (não contém). A transferência conjugativa pode ser diferente dependendo do plasmídeo envolvido. Maioria das bacterias gram-negativas tem mecanismo similar àquele utilizado pelo plasmídeo F.
*Plasmídeo F
Tem uma região que contém genes que regulam a replicação do DNA. Esse também apresenta elementos de transposição que permitem a integração do plasmídeo no cromossomo hospedeiro.
-Região tra do plasmídeo F: contém genes que codificam funções envolvidas na transferência. Muitos genes envolvidos na formação do par de acasalamento (participando da formação do pilus sexual – presente apenas em células doadoras). Essa região pode ser um pouco diferentes entre os plasmídeos F e produzirem pili com algumas diferenças.
O pilus estabelece contato especifico com um receptor na célula receptora, aproximando as duas células. Depois da conexão, as células continuam unidas por meio de proteínas de ligação, então o DNA é transferido.
*Mecanismo de transferência de DNA durante a conjugação
DNA transferido por esse mecanismo não é sintetizado por replicação semi conservativa e sim pela replicação por circulo volante.
Célula doadora com mecanismo conjugativo F entra em contato (através da pili) com uma célula receptora; há retração do pilus e as proteínas de ligação mantém as duas células ligadas. Enzima TraI (codificada pelo operon tra do plasmídeo) cliva uma das fitas do plasmídeo que é transferido para a célula receptora e ao mesmo tempo uma fita complementar está sendo formada nas duas células (através do mecanismo do círculo rolante). Resultando em duas células com plasmídeo F, então as células e separam. Se os genes plasmídeos puderem ser expressos na célula receptora ela torna-se doadora.
Plasmídeos conjugativos tem capacidade de disseminar em células bacterianas agindo como agentes infecciosos.
Os plasmídeos podem ser perdidos pelas células por um processo de cura. Ex: plasmídeos com resistência a antibióticos podem perder essa resistência se o ambienteonde as células se encontrar não tiver antibiótico.
FORMAÇÃO DE LINHAGENS Hfr E MOBILIZAÇÃO DO CRS.
*Transferência de DNA em Bactérias
O plasmídeo F é capaz de se integrar ao CRS da célula hospedeira e quando está integrado, genes cromossomais podem ser transferidos. A transferência lateral por esse processo pela conjugação, seguido de recombinação pode ser bastante extensa (nº e diferentes tipos de genes que podem ser transferidos).
Plasmídeo F+: não integrado; Plasmídeo Hfr: integrado ao CRS (alta frequência de recombinação entre os genes do doador com os do receptor). 
Hrf x F- = Hfr + F- recombinante (com novo genótipo).
*Integração de F e mobilização cromossomal
Plasmídeo F e CRS de E. coli possuem várias cópias de sequências (IS) de inserção. (IS: regiões de homologia dessas sequências de inserção resultam na integração do plasmídeo ao CRS do hospedeiro. Quando integrado, o plasmídeo deixa de controlar sua replicação e a linhagem e capaz de sintetizar pili, podendo ocorrer a conjugação com uma célula receptora como ocorre com F+. Porém após a transferência ocorre a replicação, então a linhagem Hfr permanece Hfr, pois retém uma cópia do plasmídeo F integrado; porém, a receptora não se torna Hrf pois somente uma parte do plasmídeo F integrado é transferido. Assim como somente uma parte do CRS, durante a excisão, genes cromossomais podem ser incorporados ao plasmídeo F liberado (por causa das várias sequencias de inserção idênticas).
Plasmídeo F’: plasmídeos livres, mas que carregam genes cromossomais.
F’ x F- = F’ + F”
A transferência assemelha-se a transdução especializada (pois apenas um grupo restrito de genes cromossomais ser transferido por um determinado plasmídeo F’.
DNA MÓVEL: ELEMENTOS TRANSPONÍVEIS
Maioria dos DNAs móveis (segmento distinto de DNA que se move como unidades, de um local para o outro, no interior de outras moléculas de DNA.
ET: encontrados em plasmídeos, CRS ou genoma viral. Não possuem própria origem de replicação. São replicados quando a molécula do DNA do seu hospedeiro realiza sua replicação.