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BIOTERISMO Biotérios Local onde são criados ou mantidos animais para serem usados em ensino ou pesquisa cientifica, que possua controle das condições ambientais, nutricionais e sanitárias. Tipos - Biotério de criação Local destinado à reprodução e manutenção de animais para fins de ensino ou pesquisa - Biotério de manutenção Local destinado a manutenção de animais para fins de ensino ou pesquisa - Biotério de experimentação Local destinado à manutenção de animais em experimentação por tempo superior a 12 horas. - Laboratório de experimentação Local destinado à realização de procedimentos com animais. Lei Arouca (Lei Nº 11.794, de 08.10.08) Regulamenta o inciso VII do § 1o do art. 225 da Constituição Federal, estabelecendo procedimentos para o uso científico de animais; revoga a Lei no 6.638, de 8 de maio de 1979; e dá outras providências. Art. 8o É condição indispensável para o credenciamento das instituições com atividades de ensino ou pesquisa com animais a constituição prévia de Comissões de Ética no Uso de Animais – CEUAs. Art. 9o As CEUAs são integradas por: I – Médicos veterinários e biólogos; II – Docentes e pesquisadores na área específica; III – 1 (um) representante de sociedades protetoras de animais legalmente estabelecidas no País, na forma do Regulamento. Cursos x Aulas Práticas - Biologia - Biomedicina - Medicina - Psicologia - Pós-graduação em anatomia macroscópica e por imagem Art. 1o A criação e a utilização de animais em atividades de ensino e pesquisa científica, em todo o território nacional, obedece aos critérios estabelecidos nesta Lei. § 1o A utilização de animais em atividades educacionais fica restrita a: I - Estabelecimentos de ensino superior; II - Estabelecimentos de educação profissional técnica de nível médio da área biomédica. Modelos animais x aulas práticas - Ratos - Camundongos - Rãs - Suínos - Aves (codornas e pombos) - Peixes Art. 3o Para as finalidades desta Lei entende-se por: I – Filo Chordata: animais que possuem, como características exclusivas, ao menos na fase embrionária, a presença de notocorda, fendas branquiais na faringe e tubo nervoso dorsal único; CEUA - Comissão de Ética no Uso de Animais A CEUA por finalidade analisar à luz dos princípios éticos toda e qualquer proposta de atividade científica ou educacional que envolva a utilização de animais do grupo Chordata, sob a responsabilidade da instituição, seguindo e em conformidade com as diretrizes normativas nacionais e internacionais para pesquisa e ensino envolvendo tais animais. Esta comissão que tem como dever primordial a defesa do bem-estar dos animais em sua integridade, dignidade e vulnerabilidade, assim como zelar pelo desenvolvimento da pesquisa e do ensino segundo elevado padrão ético e acadêmico. Entende-se por uso: manipulação, captura, coleta, criação, experimentação (invasiva ou não-invasiva), realização de exames ou procedimentos cirúrgicos, ou qualquer outro tipo de intervenção que possa causar estresse, dor, sofrimento, mutilação e/ou morte. Antes de qualquer atividade envolvendo um animal, o pesquisador ou professor deverá encaminhar a sua proposta à CEUA de forma que a pesquisa ou atividade educacional envolvendo animais só poderá ser iniciada após ter sido emitida a aprovação da Comissão, apresentada em Parecer. A CEUA não tem por princípio a inibição do uso de animais, mas promover o uso racional deste recurso, buscando sempre o refinamento de técnicas e a substituição de modelos, que permitam a redução no uso de animais. A CEUA também tem como finalidade promover eventos como palestras e fóruns de discussão relacionados ao uso de animais no ensino e na pesquisa. Para solicitar a apreciação de um projeto de pesquisa no CEUA é necessário o preenchimento do protocolo unificado de projetos. Para que um aluno não faça a aula pratica com experimentação animal, é necessário que o mesmo preencha a declaração de escusa de consciência. CONCEA - Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal É o órgão destinado ao registro das instituições que criam ou utilizam animais com finalidade de ensino e pesquisa científica; dos protocolos experimentais ou pedagógicos, aplicáveis aos procedimentos de ensino e projetos de pesquisa científicos realizados ou em andamento no país. Biotério: Micro e Macroambiente Macroambiente Instalações Sua arquitetura e manutenção adequadas influenciam diretamente no manejo. As áreas destinadas aos animais devem ser isoladas fisicamente de laboratórios de controle ou experimentação e áreas administrativas; além disso, devem possuir estrutura que as torne à prova de agentes infecciosos e vetores, como insetos e roedores silvestres. Elas compreendem as salas para as colônias de animais e as áreas de apoio, como as áreas de higienização e esterilização, salas de estoque de materiais limpos e insumos, corredores de acesso etc. Iluminação O fotoperíodo (ciclo de luz/escuridão) é, sem dúvida, um dos mais importantes itens que influenciam o ritmo biológico do animal de laboratório, atuando no seu comportamento e na reprodução. Sendo a maioria dos roedores animais noturnos, a luz fria lhes é menos irritante do que a luz incandescente e a iluminação natural é contraindicada, já que não pode ser controlada. Períodos de luz de 12-14 horas/24 horas parecem ser os mais adequados à reprodução dos animais e a sua manutenção. Ruído O ruído, apesar de inevitável, deve ser controlado para que não afete os animais, tendo em vista que, quando atinge níveis acima do tolerado, principalmente em roedores, provoca estresse, podendo levar a convulsões e até à morte. Os ruídos também podem afetar o operador, sendo aconselhável o uso de protetores em ambientes como as áreas de higienização e esterilização. O nível aceitável de ruídos é de até 85 decibéis. Gaiolas Para roedores, temos basicamente dois tipos de gaiolas: as de fundo sólido e as de fundo perfurado. As primeiras são mais utilizadas por animais pequenos (camundongos, ratos, hamsters, gerbis, cobaias etc.); as de fundo perfurado são destinadas a coelhos. Geralmente, são fabricadas em metal ou plástico (policarbonato ou polipropileno) resistentes à autoclavação. Atualmente, as gaiolas mais utilizadas são feitas de plástico, por serem mais baratas, mais leves, bastante duráveis e resistirem aos métodos de esterilização. Fatores Controlados no Macroambiente - Temperatura na faixa de 22 com uma variação de 2 graus - Ventilação Suprir o ambiente com oxigênio, remover calor, diluir gases e remover partículas em suspensão, por exemplo, remover a amônia. - Umidade relativa do ar (UR) em torno de 55 com variação de 5% - Luz Recomenda-se 12/12 ou 10/14 horas de período de luz/escuridão - Ruídos Microambiente Cama A ‘cama’ é usada no fundo das gaiolas ou em bandejas, por baixo das gaiolas de fundo perfurado. Sua principal função é absorver a urina dos animais e aquecê-los, além de prover as fêmeas com material para a construção de ninhos para abrigar as ninhadas, quando em contato direto com os animais. As características de uma boa ‘cama’ são: alta capacidade de absorção de umidade, sem desidratar ou machucar os recém-natos; não conter poeira; não ser abrasiva; estar livre de agentes químicos ou patogênicos; ser de baixo custo e de fácil aquisição. O material para cama mais utilizado é a maravalha (raspas de madeira) de pínus. A ‘cama’ se constitui uma das mais importantes fontes de contaminação para os animais; por isso, deve ser sempre autoclavada antes de ser utilizada. Seu fornecedor deve ser idôneo e garantir que não houve contato do material com roedores silvestres e/ou pássaros – vetores das principais doenças que acometem os animais de laboratório –, além de produtos químicos como agrotóxicos e resinas. Densidade PopulacionalO espaço requerido é aquele onde os animais possam apresentar postura adequada e movimentação ou comportamento padrão da espécie. Animais mantidos isolados ou superpopulados, por longos períodos, desenvolvem estresse. Odores O odor é muito importante para os animais de laboratório, uma vez que a identificação e o reconhecimento dos indivíduos se fazem pelo cheiro inato de cada espécie e é através dos feromônios que machos e fêmeas se encontram para a reprodução e delimitam os seus territórios. A esses odores, juntam-se a amônia da urina e outros odores, como o da ração, o dos técnicos da sala etc. A troca dos animais das gaiolas sujas para as limpas interfere diretamente nesse universo. Deve ser observada cuidadosamente, pois devemos eliminar os odores irritantes (amônia) e os alheios à espécie, mas não os feromônios, pois cada vez que o animal é trocado, fábrica nova quantidade de feromônios e de outras substâncias, para marcar seu território e atrair parceiros. A troca demasiada estressa o animal, que acaba produzindo essas substâncias em excesso. Água e Ração A água oferecida aos animais deve ser microbiologicamente pura (esterilizada e acidificada), uma vez que se constitui importante fonte de contaminação. Deve ser trocada com frequência, para evitar que se transforme em meio propício à proliferação de microrganismos existentes na boca do animal e que são passados aos bicos, juntamente com restos de ração, quando este bebe. Deve ser oferecida ad libitum em frascos bebedouros apropriados. A ração ideal é a industrializada, na qual o requerimento nutricional de cada espécie é levado em conta na formulação, o que garante uma alimentação balanceada. A ração deve ser autoclavável para evitar contaminações. Também é oferecida ad libitum, e a quantidade não consumida deve ser desprezada. Biossegurança - Treinamento Básico para início de atividade experimental - Vacinação Recomendada, por exemplo, para raiva e febre amarela. Deve ser vacinado por tétano. - Autorização De acesso as instalações pelo responsável do biotério Para uso de animais em experimentação autorizado pela comissão ética - Fluxos Operacionais Entrada das instalações mantidas trancadas, liberado somente entrada para autorizados - Fluxo na introdução de materiais Sala própria Modelos Animais Por que roedores? - Facilidade de cuidar e manusear - Curto tempo de geração e de vida - Grande número de linhagens bem definidas - Riqueza de informações - Alta capacidade reprodutiva Camundongos Espécie: Mus musculus Ordem: Rodentia Características gerais - Dócil e de fácil manipulação - Nascem sem pelos (crescimento de pelos em uma semana), corpo avermelhado, olhos fechados (abertura em 10 dias), com peso médio de 1 a 2 g (adulto = 30 a 60g). - Com duas semanas alimentam-se de ração e desmame de 3 a 4 semanas. - Audição e olfato desenvolvidos (altamente sensíveis a ultra som e barulhos agudos), - Visão pouco desenvolvida (retina com poucos cones, o que não lhes permite distinguir cores. - Períodos de vida: Neonatal - do nascimento até 3a semana de vida Puberdade - 3a semana aos dois meses completos Adulto - aqueles com 3 a 12 meses Idoso - fase dos 13 a 24 meses - Ciclo estral – 4 a 5 dias - Período gestacional – 19 a 21 dias - Tamanho da ninhada – 5 a 20 filhotes Identificação dos Animais - Uso de cartões nas gaiolas (linhagem, sexo, número, pesquisador, protocolo experimental). - Identificação temporária (canetas marcadoras na cauda ou cortes no pelo). - Identificação permanente com furos nas orelhas (pode ser mascarada por sinais de luta) Sexagem de Camundongos Machos e fêmeas podem ser diferenciados através da observação da distância entre o ânus e a papila genital (distância anogenital): maior nos machos. Manuseio e contenção de camundongos Ratos Espécie: Rattus norvegicus Ordem: Rodentia Comportamento São geralmente curiosos, dóceis e, se manipulados com frequência e gentilmente, tornam se domesticados e treinados contanto que não sejam perturbados durante esta operação. Os ratos mordem sem aviso, porém não repetidamente. Diferentemente dos camundongos, grupos do mesmo sexo podem ser alojados na mesma gaiola sem luta. São ativos primariamente durante a noite quando se alimentam. O ciclo claro é utilizado para repouso, dormida e digestão. A manipulação do animal durante a noite é mais difícil. Identificação dos Ratos Mesmo que os camundongos Características gerais: - Ratos sadios vivem de 24 a 36 meses - Peso de um rato adulto = 250 a 800g. Ao nascimento pesam por volta de 5 g. - Desmame aproximadamente no 21o dia. - Possuem alta sensibilidade olfativa - Audição acentuada - Visão pobre, incapazes de detectar cores - Ciclo estral – 4 a 5 dias - Período gestacional – 20 a 23 dias (podendo prolongar-se até 30 dias) - Tamanho da ninhada – 8 a 15 filhotes Sexagem dos Ratos Machos e fêmeas podem ser diferenciados através da observação da distância entre o ânus e a papila genital: maior nos machos. Esta diferença também é observada no rato neonatal. Manuseio e contenção do rato Cobaias Classe: Mamífera Ordem: Rodentia Família: Cavidae Gênero: Cavia Espécie: Porcellus A cobaia é conhecida, por muitos, como símbolo representativo dos animais de laboratório. Atualmente, as cobaias são muito utilizadas em experimentações ligadas à nutrição, farmacologia, imunologia, alergia, radiologia etc. Esses animais são bastante utilizados nos testes de reativos biológicos. Período médio de gestação = 63 dias Número médio de filhotes/parto = 2,75 Taxa de mortalidade de lactente = 10% Número de filhotes desmamados/parto = 2,5 Desmame = 21 dias de idade Acasalamento = média de 90 dias de idade Características gerais: - Mamífero nativo da América do Sul com habitat em florestas - Dócil, de fácil manipulação e raramente mordem - Nascem com pelos, olhos abertos, e capazes de comer alimentos sólidos em poucas horas após o nascimento. Cobaias como modelos animais de experimentação - Modelo de estudo em audiologia (apresenta grande bolha timpânica e fácil visualização de estruturas internas das orelhas - Estudos nutricionais - Estudos imunológicos, incluindo reações de hipersensibilidade e doenças infeccionas - Estudo dos efeitos hormonais na gestação (pode ser feito a ovariectomia. Alojamento dos Animais Gaiolas de aço inox de fundo sólido ou de plástico. Podem ser criados em gaiolas não cobertas com 25 cm de altura Identificação dos Animais - Uso de cartões nas gaiolas ou descrição de um padrão de cor do animal - Identificação temporária (canetas marcadoras) - Identificação permanente nas orelhas Desmame e Sexagem Independente do sistema de produção, os filhotes devem ser desmamados com três semanas de idade. O melhor critério quando não existe registro, é provavelmente quando alcançam mais 180 g de peso. Os animais devem ser separados por sexo e tamanho. Tanto os machos quanto as fêmeas apresentam o orifício genital em igual distância do ânus, então a identificação é feita pela bolsa escrotal do macho. Manuseio e contenção da Cobaia Coelhos Espécie de laboratório: Oryctolagus cuniculus Comportamento: - São herbívoros, excelentes animais de estimação e raramente mordem - Os coelhos toleram mais as temperaturas frias do que quente. O alojamento deve ser mantido à temperatura entre 17 e 21oC - Tamanho da ninhada – 4 a 12 filhotes. - Nascem cegos e sem pelos - O desmame acontece entre 5 a 12 semanas Alojamento dos Animais Gaiolas de aço inox ou plástico. Coelhos como modelos animais de experimentação - Modelo de estudo para aterosclerose induzida pela dieta - Estudos dos olhos Em razão de sua hipersensibilidade,os coelhos são muito utilizados na prova de irritantes cutâneos primários, fotossensibilizadores, irritantes dos olhos e outros alérgicos. Período médio de gestação = 30 dias Número médio de filhotes/parto = 6,67 Taxa de mortalidade de lactente = 10% Número de filhote/desmamados/partos = 6,0 Desmame = 42 dias de idade Acasalamento = 30 dias após o parto e/ou no final do segundo ciclo ovariano Comportamento Os coelhos, de uma maneira geral, são dóceis, podendo morder ou arranhar em razão do manuseio incorreto. São susceptíveis ao estresse, assustando-se facilmente. Não se deve manter machos adultos em uma mesma gaiola para evitar brigas (disputa de território). As fêmeas adultas também não devem ser mantidas na mesma gaiola por apresentarem pseudogestação. Esses animais são mais sensíveis ao calor que ao frio. A temperatura recomendável varia de 17 ºC a 21 ºC e a umidade relativa de 40% a 60%. Sexagem dos Coelhos Pode ser efetuada aplicando-se suave pressão digital ao longo da abertura genital. A pressão expõe a superfície da mucosa da vulva Identificação dos Animais - Uso de cartões nas gaiolas - Identificação temporária (canetas marcadoras) - Identificação permanente nas orelhas Manuseio e contenção do Coelho O Princípio dos 3 R’s Os princípios éticos (3R’s) postulados por Russell e Burch 5 em 1959, determinaram um marco para o desenvolvimento de práticas humanitárias no tratamento de animais envolvidos em experimentos e serviram de base para maioria das leis e regulamentações que surgiram nas últimas décadas do século XX para protegê-los de abusos e maus-tratos1, 2, 8. · Replacement (Substituição) fundamenta-se na busca de alternativas para substituir animais vertebrados vivos por qualquer sistema experimental que forneça resultados válidos como modelos computadorizados, organismos inferiores e estágios embrionários, cultivos celulares, voluntários humanos e outros modelos in vitro. Reduction (Redução) baseia-se no emprego de métodos ou estratégias que resultem na diminuição do número de animais utilizados para atingir resultados válidos ou maximizar as informações obtidas por animal e, desta forma, evitar o uso de animais adicionais. Neste sentido, é importante que o delineamento da pesquisa seja criterioso e conte com um planejamento estatístico adequado para que não se desperdicem os recursos e animais a ela destinados. Refinement (Aprimoramento) refere-se aos métodos que aprimoram a experimentação animal, aliviando ou minimizando a dor, desconforto e outros efeitos adversos sofridos pelo animal, ou implementam ações para alcançar seu bem – estar. Relacionam-se com o ambiente, saúde, cuidados, transporte, manejo, alimentação, procedimentos e práticas experimentais, entre outros. O pesquisador deve considerar que este princípio não só contribui para o bem-estar dos animais como para a qualidade do experimento. Classificação dos animais quanto ao status genotípico Grau de definição genética Animais heterogênicos Não consanguíneos Heterocruzados Heterogâmicos Outbred ▪ Camundongos Swiss e rato Wistar É realizado o cruzamento ao acaso Mantém a variação genética Animais Isogênicos Consanguíneos Endocruzados Isogâmicos Inbred ▪ Camundongo Balb/C, rato Zucker Obtidos a partir de cruzamento entre os animais por no mínimo 20 gerações Índice de 99% de homozigose entre os genes alelos Animais Mutantes Espontâneos: camundongos NUDE, SCID Provocados: camundongos Knock-out (KO) Animais Transgênicos Realiza-se o acréscimo de genes de interesse Classificação dos animais quanto ao estado microbiológico Status sanitário Animais Gnotobióticos O termo “gnotobiótico” pode ser utilizado tanto para animais livres de germes como para aqueles contaminados com um ou mais organismos detectáveis. São classificados como: Germ free Animal isento de qualquer organismo interno e externo. Obtido por histerectomia, criado e mantido em isolamento. Utilizados como modelos em experimentos, por exemplo, nas áreas de oncologia, imunologia e nutrição. Flora definida: Animais intencionalmente inoculados com microrganismos específicos. A primeira etapa para a sua produção é obter animais germfree. Animais livres de germes patogênicos (SPF) Animais SPF originam-se de animais germ free e não apresentam microrganismos patogênicos, ou seja, possuem somente microbiota. Animais convencionais A maioria dos animais de experimentação usada ainda é criada em colônias de acasalamento convencionais. São animais com microbiota indefinida por serem mantidos em ambiente sem barreiras sanitárias rigorosas Vias de administração Via oral (VO) e Gavage A substância é introduzida na cavidade oral ou no aparelho digestório por meio de um tubo esofágico ou estomacal. Para a maioria das espécies, um tubo flexível (ou agulha) com a ponta arredondada é introduzido na boca do animal e gentilmente empurrado pelo esôfago até o estômago. Pequenos volumes devem ser administrados no início do período claro (fase de repouso). Subcutânea (SC) É a injeção de solução sob a pele do animal, a qual deve ser levantada antes da aplicação. As áreas dorsolaterais do pescoço, ombro e flancos são as regiões de escolha. É uma via que raramente induz dor e é realizada em animais conscientes. Antes de injetar a substância, deve-se aspirar exercendo uma leve pressão no êmbolo da seringa para assegurar que a agulha não esteja penetrando em um vaso sanguíneo. Intramuscular (IM) A substância é injetada no músculo esquelético na forma de soluções oleosas ou suspensões. Os músculos de grande superfície são as regiões mais utilizadas. Estruturas ósseas, nervos e vasos sanguíneos devem ser evitados. Antes de injetar deve-se assegurar que a agulha não está em um vaso sanguíneo, exercendo uma leve pressão de retirada no êmbolo da seringa. Endovenosa (EV) A administração é feita diretamente na corrente sanguínea, por meio de vasos superficiais. A veia da cauda é o vaso sanguíneo de escolha em camundongos não anestesiados. O movimento do animal também pode ser contido dentro de um pequeno recipiente para facilitar a administração. Nunca se deve aplicar medicamentos diluídos em veículo oleoso, sob pena de causar êmbolos no animal com a consequente morte do mesmo. Vários dispositivos foram desenvolvidos para facilitar injeções endovenosas junto à veia lateral da cauda, basicamente, estes dispositivos consistem em um cilindro transparente, de diâmetro apropriado. Intraperitoneal (IP) A via intraperitoneal é normalmente a mais utilizada na experimentação com roedores. A substância é injetada na cavidade peritoneal entre os órgãos abdominais. A imobilização adequada é pré-requisito básico para o sucesso deste tipo de aplicação. Eutanásia Termo usado para descrever o processo pelo qual o animal é sacrificado, utilizando técnicas humanitárias reconhecidamente aceitas. Implica em morte sem sofrimento, medo ou ansiedade. Critério mais importante para a aceitação de um método: Possuir ação depressora inicial do sistema nervoso central para assegurar insensibilidade imediata à dor. Métodos indicados e não aceitos: DIRETRIZES SOBRE EUTANÁSIA – CONCEA 2013 Métodos para eutanásia - Métodos físicos: Devem causar perda de consciência imediata. São indicados quando outros métodos podem invalidar uma determinada informação de interesse, principalmente aquelas relacionadas com a bioquímica do animal. Quando substâncias químicas no sangue e enzimas teciduais são o objetivo de uma investigação, frequentemente os animais precisarão ser sacrificados por um método físico. Os métodos físicos para eutanásia incluem (dependendo do modelo animal e aprovados pela diretriz 2013 de eutanásia do CONCEA): Deslocamento cervical Decapitação Exsanguinação(com anestesia prévia) - Métodos químicos: A. Agentes farmacológicos não-inalantes A administração de fármacos é um procedimento rápido e confiável. ▪ Barbitúricos. B. Agentes farmacológicos inalantes O Éter não pode mais ser utilizado DEVEMOS CONSULTAR SEMPRE A DIRETRIZ DE EUTANASIA 2013 DO CONCEA PARA A ESCOLHA DO MÉTODO
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