Gnotobiótico: Estudo de animais livres de parasitas e microbiota

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Gnotobiótico – Palavra de origem grega. 
 (Gnoto = Conhecer + Bioto = Vida)
É o estudo de animais com flora e fauna
completamente conhecidas; 
Algumas definições incluem não existentes ou
não detectável;
Os animais devem ser criados em ambientes de
barreiras sanitárias absolutas.
 
 
Minimiza varáveis associadas a variações entre
indivíduos normais da mesma espécie; 
Não ocorre superpopulação de microrganismos
quando há imunossupressão;
Permite estudos imunobiológicos;
Quanto mais uniforme os animais, maior exatidão e
precisão da resposta biológica, e menos animais
deverão ser utilizados na pesquisa.
A razão desta ciência é a construção de um “modelo
animal”, que permita a avaliação dos fenômenos
naturais e que estes possam ser comparados a biologia
do homem. 
Considerando todas as variantes que podem interferir
na vida do animal, desde as condições do viveiro, do
manejo, da alimentação, até a microbiota e
ectoparasitas associados ao seu corpo, esse modelo
recebe uma classificação sanitária utilizada
ordinariamente como critério para a experimentação.
Animal convencional 
Animal gnotobiótico
São animais totalmente livres de parasitas e
microbiota, internos e externos, com
carrapatos, pulgas, bactérias, fungos,
protozoários, vírus, algas; 
Esses animais normalmente têm achados
anatômicos exclusivos – diminuição de
espessura da parede do intestino, alargamento
do lúmen, crescimento mais rápido, absorvem
mais gordura e vivem mais.
Animais criados num sistema de barreiras sanitárias
para rigor higiênico. Como consequência, sua flora
microbiológica e ectoparasitas são conhecidos, ou
não existentes, ou indetectáveis. 
Tipo axênico (“livre de estranhos”) ou Germ-
free
Classificação dos
animais
 
Gnotobiologia
Vantagens
�1885 – Pasteur – questionava a ausência de organismos
superiores na ausência de “germes”
�1957 – Texler e Reynolds desenvolveram isoladores flexíveis,
transparentes que permitem a visão total no seu interior e pela
flexibilidade facilita a manipulação 
Histórico
Necessidade de isoladores para esse tipo de estudo 
Diferentes materiais rígidos testados – dificuldades técnicas
(acomodação da pressão, etc)
O domínio da tecnologia de construção de isoladores de plásticos,
de purificação do ar e da água, da higienização dos instrumentos e
esterilização dos alimentos oferecidos (basicamente ração),
permitiu o avanço da prática de obter e criar animais “limpos”, que
no conjunto, constitui agora uma ciência importante para a biologia
e a biomedicina. 
Animais intencionalmente associados/contaminados com
parasitas e/ou microbiota específicos.
Animais livres de parasitos ou microbiota específica, podendo
estar associado a outros seres, inclusive vírus. 
Animais livres de resposta imunológica para vírus específicos,
podendo estar associados a outros parasitos e microbiota.
Tipo SPF (Specific Pathogen Free)
Tipo VAF (Vírus Antibody Free)
Derivados de Cesareana 
Em que se retira os animais por cesariana e promove-se a retirada
dos filhotes dentro da câmara estéril, aos antissepsia do útero. 
Tipo Flora Definida
Vantagens
O status sanitário (ou ecológico) dos animais
somente pode ser mantido por meio de seu
isolamento, o que impede o contato com novas
formas de vida;
Tudo aquilo que seja utilizado para isolar os
animais de novas formas de vida, seja por
meios físicos ou químicos, ou até pelas técnicas
de manejo;
Luvas, vestimentas, filtros de ar, autoclavagem,
projeto arquitetônico do biotério, limpeza dos
instrumentos, etc., são as barreiras que
impedem o contato entre as formas de vida;
A água servida aos germ-free é acidificada até
pH 2,0 (tal como no estômago), para evitar a
proliferação de microrganismos;
O ar que entra nas gaiolas passou por um
processo de ultrafiltração. Nenhuma partícula
sólida entra, e alguns gases são retidos no
filtro;
A ração oferecida tem formulação especial,
resistente à autoclavagem necessária para
mantê-la asséptica e não contaminar os
animais;
Barreiras sanitárias:
Animais utilizados
em pesquisa
Manutenção:
Classificação Sanitária dos animais:Acontecimentos da Gnotobiologia: 
Classificação
genética
 Animais outbreds ou heterogênicos:
 Animais inbreds ou homogênicos:
 Característica genética necessária;
 Espaço existente no biotério;
 Número de animais necessário;
 Características do indivíduo:
 O propósito de um sistema de acasalamento é
preservar ou controlar as causas genéticas para
determinada características. 
 A combinação da consanguinidade com
sistemas de seleção deu aos genecistas métodos
de controle das características herdáveis dos
animais de laboratório.
Classsificação genética:
 99% de heterozigose – diversidade genética
Reprodução de populações naturais
99% de homozigose
Acasalamentos consanguíneos 
Sistemas de acasalamento:
A escolha do tipo de acasalamento depende,
principalmente:
Ambientais e genéticas 
Inbreeding – subdivide a população em
subpopulações, nas quais a média das
características quantitativas aumenta ou diminui e a
variação genética se reduz;
Outbreeding - (acasalamento entre diversas
populações) faz a variação genética aumentar e
muda a média de características quantitativas;
Mutação induzida
Trangênenicos - mutantes
Híbridos
Sistema de
acasalamento
Monogâmica;
Fechada, sem introdução de novos pares
reprodutivos;
Com uma população tão grande quanto
possível: mínimo 200 casais;
Acasalamento randômico para que todos
os indivíduos tenha igual chance de
participação;
Sem critério de seleção, para não fixar
alelos;
Usar esquemas com métodos
reprodutivos como: Poiley, Han-rotation,
Robertson’s, Falkoner, etc. 
Aumentar os intervalos entre gerações o
máximo possível (usar a quinta ninhada);
Fixar o tempo reprodutivo dos pares
acasalados (ex. 30 semanas).
A colônia fundação deve ser:
 
Acasalamento ao acaso
 
O principal objetivo é o de evitar o
acasalamento de parentes próximos e
assegurar que a próxima geração venha de
um espectro mais amplo de pais do que
ocorreria se fosse ao acaso;
Utilização de sistemas rotacionais;
MÉTODO POLEY
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MÉTODO DE FALKONER
A escolha do tipo de acasalamento
depende, principalmente:
Características do indivíduo:
O propósito de um sistema de
acasalamento é preservar ou controlar
as causas genéticas para determinada
característica.
Sistema de acasalamento 
Característica genética necessária;
Espaço existente no biotério;
Número de animais necessários;
Ambientais e genéticas.
Permitir que a população se mantenha
constante em todas as suas características
pelo maior número de gerações possíveis;
Manter o alto nível de heterozigose;
Preservar a estabilidade da população inicial
de alelos e suas frequências, o máximo possível
durante as gerações;
O principal acasalamento de um biotério é
sempre a Colônia Fundação.
Cruzamento
heterogênico
Preservar a isogenicidade e alto
coeficiente de consanguinidade;
Evitar ao máximo contaminações
genéticas, mutações e heterozigose
residual;
Método mais fácil... cruzamento entre
irmãos da mesma ninhada.
Acasalamento consanguíneo
 
Separação física das colônias de diferentes
linhagens;
Se não for possível, distribuir por cor de
pelagem;
O sistema de identificação deve ser
extremamente bem controlado;
Qualquer variação fenotípica deve ser
observada como possível contaminação ou
mutação, devendo ser investigada;
O núcleo da fundação deve descender de
um ancestral e deve ter um número restrito
de caixas (10 a 20);
Sistema de hárem (poligamia) 
 Sistema monogâmico
 1 macho para 2 fêmeas.
1 macho para 1 fêmea.
A PARTIR DOS ISOGÊNICOS --- HÍBRIDOS
50% de um com 50% de outro
 Derivadas pela introdução de um cromossomo inteiro
por meio de retrocruzamento (backcross);
 Possui um gene artificialmente introduzido em seu
genoma;
 Possui, em um gene pré-selecionado artificialmente,
uma mutação específica que leva à sua inativação;
ANIMAIS CONGÊNICOS
 
ANIMAIS TRANSGÊNICOS
 
 ANIMAIS NOCAUTES
 
 
Manejo das colônias
Métodos de
acasalamento
EXEMPLO DE MUTANTES
Reduzir o número de animais utilizadosdiminuindo as variações dentro/entre
grupos;
Garantir a manutenção de colônias de
produção fechadas...;
Uniformidade fenotípica: variedade
nos experimentos não se deve a
fatores genéticos e sim ambientais ou
metodológicos;
Estabilidade genética: comparação de
resultados experimentais ao longo do
tempo e entre laboratórios;
CONDIÇÕES GENÉTICAS 
CONTROLADAS PERMITEM...
O coelho de laboratório é um dos poucos animais que mantém o conceito de
raça como unidade de manejo;
NOVA ZELÂNDIA – peso entre 4 kg a 6 kg, de reconhecida docilidade, fácil
reprodução e manejo, e com uniformidade de reações nas provas experimentais;
GIGANTES DE FLANDES – atinge mais de 6 kg, preferindo para a obtenção do
soro imunológico;
CALIFÓRNIA – peso de 3 kg a 5 kg, apresenta diversas zonas pigmentadas em
negro sobre o fundo branco. Sua principal característica é rusticidade;
HOLANDÊS – com menos de 2,5 kg, é bastante utilizado como animal de
experimentação em virtude de seu pequeno porte e resistência às contaminações
ambientais.
Origem: norte da África e Península
Ibérica - Espanha
Domesticação na Idade Média –
alimentação
Dóceis e de fácil manejo
Experimentação animal – Pasteur,
em 1884, demonstrou que os cães
podiam ser protegidos contra o
vírus da raiva, mediante a
inoculação de suspensões da
medula espinhal, dissecada de
coelhos infectados
experimentalmente com o vírus
dessa enfermidade.
Melhor modelo – provas pirógenas
e de hipersensibilidade 
COELHOS
Oryctolagus cuniculus O sangue representa Cerca de 10% do
peso corporal do indivíduo;
Pode retirar cerca de 10% do volume
do sangue circulante.
Dóceis, podendo morder ou arranhar
da contenção incorreta;
Susceptíveis ao estresse, assustando-
se facilmente;
Não se deve manter machos adultos
em uma mesma gaiola para evitar
brigar (disputa de território);
As fêmeas adultas também não devem
ser mantidas na mesma gaiola por
apresentarem pseudogestação;
Temperatura recomendável – 17 °C a
21 °C;
Umidade relativa – 40% a 60%.
Curiosidade
 
Comportamento
Corpo arredondado;
Cabeça grande provida de largas orelhas;
Audição e olfato bem desenvolvidos;
Amplo campo de visão;
Dente de crescimento contínuo - É importante desgastar os dentes, por isso
eles roem muito;
Crescimento excessivo – má oclusão;
Patas posteriores – mais compridas que as anteriores;
Temperatura média do corpo é 38,3 °C, podendo chegas a 39 °C;
Urina muita alcalina – alto teor de cristais de fosfato e carbonatos - Mancha
o local o qual eles urinam, chegando a tirar o esmalte do piso;
Sensíveis à penicilina e toxidade para ampicilina;
Fêmea é poliéstrica, podendo ser coberta a qualquer época do ano;
Ovulação provocado, ovula somente após a cópula e/ou uma forte
excitação sexual;
Puberdade ocorre entre 150 – 180 dias;
Relação machos/fêmea – 1 macho para cada 10-12 fêmeas reprodutoras (3
a 4 machos – evitar consanguinidade) - Não colocar todas as fêmeas juntas,
no máximo 4 fêmeas por vez com o macho;
Com 4 anos – queda da reprodução;
Fêmea – gaiola macho;
Observar cópula;
Ovulação ocorre, aproximadamente, 10 horas após a cópula;
Nova cópula após 30 a 40 dias após o nascimento dos filhotes
Gestação – duração de 30 a 32 dias;
Observar pseudogestação – 18 a 21 dias após a cobertura;
Constroem ninhos – arrancam pelos do abdômen;
Parto noturno;
Evitar manipulação do ninho – rejeição;
Láparos nascem com 60g a 80g, com ausência de pelos com olhos e orelhas
fechados e com dentes incisivos;
Olhos abertos no 10° dia;
Filhotes iniciam alimentação sólida 15 dias após o nascimento;
Média de ninhada é de 6-8 láparos;
Desmame – 40 dias.
Principais características anatômicas e fisiológicas
Fundamentalmente herbívoro;
Ceco grande, o qual produz uma
fermentação bacteriana considerável;
Pratica a coprofagia noturna, coletando
fezes diretamente do ânus;
Síntese da vitamina ocorre no ceco;
Ração fornecida uma vez ao dia – evitar
excesso de peso.
Nutrição
Orelha (veia e artéria);
Cardíaca;
Intraperitoneal;
Subcutânea;
Intramuscular.
Contenção e punção
Camundongos e ratos – junto ao homem
há 4 mil anos;
Origem – continente asiático;
Animal de laboratórios:
Manejo e criação de ratos e
camundongos 
Pequeno;
Muito prolífero;
Período de gestação curto; 
Fácil domesticação; 
Fácil manutenção.
Colônia de fundação ou produtora
de matrizes ou piloto;
Colônia de expansão;
Colônia de produção.
Repor matrizes logo após a
performance reprodutiva cair;
Manter pares de matrizes de várias
idades por meio da reposição
semanal ou mensal, e assim manter o
número constante de ninhadas;
Quando repor matrizes? 
O estabelecimento de uma colônia em
um biotério obedece a várias
considerações. Se mantivermos colônias
únicas ou pretendermos a
autossuficiência, teremos de estabelecer
três diferentes colônias para cada
linhagem instalada. 
Não produzem ninhada em 60 dias após
acasalamento;
Não produzem ninhadas 60 dias após a
última ninhada;
Produzem três a quatro ninhadas que
não desmamam no tempo correto.
Reproduzir cedo – entre 6 a 8 semanas.
Jovens são mais produtivos;
Usar machos com experiência com
fêmeas mais novas e fêmeas mais
velhas com machos mais novos;
Sempre manter dados de acasalamento
meticulosos e acurados, e atualizá-los
regularmente para que se tenha um
diagnóstico precoce dos problemas e
estes sejam solucionados.
Respeitar o ritmo circadiano;
Luz vermelha – observar animais no
ciclo escuro;
Agir com calma;
Manter limpo;
Silêncio.
Manejo de colônias
Manejo básico
Classe: Mammalia;
Ordem: Rodentia;
Família: Muridae;
Gênero: Mus;
Espécie: Mus musculus.
Corpo fusiforme;
Cauda pode atingir comprimento
maior do que o corpo;
Coloração natural é marrom escura
no dorso, com um ventre mais claro e
cinzento;
Não possui glândulas sudoríparas;
Patas anteriores como posteriores
possuem cinco dedos;
Todo cromossomo é telocêntrico.
Taxonomia
Características
Ciclo estral – 4 a 5 dias (proestro,
estro, metaestro e diestro) - Período
da fase reprodutiva do animal;
Anestro - Período de completa
inatividade sexual;
Expostas aos machos ou a seus
feromônios, começam a ciclar em 48
horas (Efeito de Whitten);
Efeito Bruce – volta a ciclar nas
primeiras 24 horas de gestação; 
Período de gestação – 19 a 21 dias;
Número de filhotes/ninhada:
Outbred – 8 a 10
Inbred – 4 a 5
Podem ser agrupados logo após o
desmame, podendo co-existir
pacificamente;
Algumas linhagens (BALB/cJ, SJL/J,
HRS/J) começarão a lutar mesmo
quando agrupados logo após o
desmame;
Os machos reprodutores que foram
colocados juntos normalmente lutam;
Ferimentos na cauda são sinal de
agressão entre os indivíduos de uma
gaiola;
Canibalismo por stress.
CAMUNDONGOS
ReproduçãoIdentificação
DADOS BIOLÓGICOS
Comportamento
Via oral:
Via intraperitoneal:
Via intramuscular:
Via subcutânea: Via intradérmica:
Ter material sempre a mão;
Pesar sempre o animal;
Puncionar apenas 10% do volume
sanguíneo.
Punções
Via intracraniana:
Via intraqueal:
Vias de
administração
Contenção
Ciclo estral 4 a 5 dias;
Tempo de gestação – 19 a 22
dias;
Média de filhotes/ parto – 8,
pode ser até 16;
Nasce desprovido de pêlos, com
exceção das vibrissas – 4 a 6 g;
Pêlos começam a despontar por
volta do 3o ao 4o dia de vida;
16 dias - começam a se alimentar
de forma independente;
18 aos 24 dias – desmame – 35 a
40g;
Sexagem;
Puberdade - 30 dias;
Maturidade sexual - 50 aos 60
dias.
Punção retro-orbital:
Punção caudal:
Aquecer a cauda a 38° - 39° C
Punção intracardíaca:
Ângulo de 15 a 20°
Rattus novergicus e R. rattus;
Derivados de colônias dos EUA –
laboratório; 
Originário de regiões da Ásia
Central;
Primeira espécie de mamífero
domesticada para fins científicos; 
Henry H. Donaldson – padronizou
colônias;
Características semelhantes aos
camundongos;
137 espécies.
Reprodução
RATOS
Taxonomia
É o ato anestésico reversível que
produz:
É a insensibilidade à dor, sem
perda da consciência.
Anestesia
Perda de consciência (narcose);
Supressão da percepção dolorosa
(analgesia);
Proteção neurovegetativa;
Relaxamento muscular.
Analgesia
Espécie/linhagem em questão;
Grau de invasividadedo
procedimento;
Se o animal sobreviverá após o
procedimento;
Necessidades específicas do
estudo, como relaxamento
muscular, pouca depressão
cardiorrespiratória, etc.
Estado físico do animal;
Disponibilidade de
equipamentos e fármacos ($),
bem como treinamento da
equipe.
A escolha do protocolo depende...
No mínimo 24-72hrs para roedores;
No mínimo 72hrs para coelhos;
Reduz o estresse do transporte e
do novo ambiente.
Roedores e coelhos não vomitam;
Predispõe a hipoglicemia;
Se necessário o jejum, este não
deve ser prolongado;
O jejum hídrico não deve ser
realizado.
Em geral, não são realizados em
animais de laboratório.
Preparo de todo o material;
Minimização do estresse animal:
Sala de espera --> Sala de
anestesia --> Sala de cirurgia -->
Sala de recuperação
Aclimatação
Jejum
Exames clínicos
Auditivo
Olfativo
Manipulação/Contenção
Medicação Pré-anestésica;
Anestesia (geral, local,
dissociativa);
Recuperação anestésica.
ETAPAS DA ANESTESIA
ANESTESIA E ANALGESIA DE
ANIMAIS DE LABORATÓRIO 
Escolha do
protocolo...
Preparação para a
anestesia
Ajuda a reduzir o estresse da
manipulação;
Facilita o preparo para a cirurgia e
a indução anestésica;
Reduz a dose anestésica;
Os fármacos mais utilizados são:
ANTICOLINÉRGICOS
Atropina e glicopirrolato;
TRANQUILIZANTES E SEDATIVOS
Fenotiazínicos, benzodiazepínicos e
agonistas a-2 - maior uso em coelhos
OPIÓIDES
Morfina, meperidina.
Indução --> Manutenção --> Recuperação
Injetável
Intramuscular e intravenosa;
Barbitúrica;
Não-Barbitúrica - Dissociativa
Inalatória
ANESTESIA GERAL 
 
Utilização das vias intraperitoneal.
Utilização das vias respiratórias
Halonegados: Halotano,
isoflurano;
Circuitos:
ANESTESIA INALATÓRIA
Aberto;
Semi-aberto;
Semi-fechado;
Fechado.
Insensibilização pontual ou
regional sem alteração de
nível de consciência;
Desvantagem: ausência de
contenção química;
Uso associado com sedação.
ANESTESIA LOCAL
Escolha depende do tipo de
procedimento e duração;
Pode ser usado combinação de
medicamento;
Ex: quetamina e xilasina.
tiletamina e zolazepan.
INJETÁVEL 
Medicação Pré-Anestésica
Doses para
roedores
Alterações de comportamento;
uma vez que não há
comunicação verbal;
Vocalização; - não rato e
camundongos;
Perca de peso;
Piloerecção (pelo arrepiado) e
postura alterada (encurvada);
Cromodacriorreia (ratos) –
parece que o animal esta
chorando sangue (lágrima rica
em ferro);
Imobilidade, que pode ser o
único sinal de dor; 
AVALIAÇÃO DA DOR EM ANIMAIS
Pesquisador tem que aceitar
que o animal sente dor;
O pesquisador deve testar o
estimulo em si próprio antes, e
sempre procurar usar o estímulo
menos invasivo possível;
O experimento deve ser o mais
breve possível e o número de
animais o menor possível;
Nunca devem ser usados animais
unicamente sob o efeito de
bloqueadores neuromusculares.
RECOMENDAÇÕES
Medicamentos pós-operatório:
Analgesia, Opioides, Morfina,
Bruprenorfina, Butorfanol, AINE’s,
Carprofeno, Cetoprofeno,
Meloxican, Paracetamol e
Ibuprofeno.
Acompanhar até a recuperação
completa;
 Vias áreas patentes;
Temperatura corporal;
Analgésicos;
Antibióticos profiláticos;
Ingestão
Apresentação 
CUIDADOS PÓS-OPERATÓRIOS
Alimentar/Híbrida
Clínica/comportamental
Monitoramento
anestésico
Adequada perfusão tissular com
sangue oxigenado;
 Variáveis analisadas:
 Circulatórias;
 Respiratórias;
 Profundidade de anestesia;
 Reflexos;
 Temperatura corporal.
SEMI-ABERTO
ABERTO
Os animais sofrem dor;
Permitir o estresse e a dor reflete
na qualidade ética e científica do
investigados;
O estresse e a dor determinam a
qualidade científica de um estudo;
Não existem desculpas para
permitir a presença de estresse ou
dor em animais de
experimentação. 
CONCLUSÃO