Laboratório virtual e resistencia bacteriana

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RELATÓRIOS DE AULAS PRÁTICAS VIRTUAIS
	Curso: Medicina Veterinária 
Disciplina: Doenças Infectocontagiosas e Parasitárias dos Animais Domésticos
	Professor: Dr. Ronaldo Alves Pereira Junior
	Aluno (individual):
Sandra Tatiana Brockes (RA: 201821912) 20202-T086-AGROS-N01
RELATÓRIO 1
1.Tema e data da aula:
Laboratório virtual: Semeadura por Esgotamento e Antibiograma (03/09/2020)
2. Objetivo
. Streak Plate
Isolar as colônias de uma cultura de bactérias através do método de plaqueamento por estrias, de forma a possibilitar a obtenção de culturas puras.
. Teste de susceptibilidade a antimicrobianos
Verificar o índice de susceptibilidade de uma cultura bacteriana pura isolada a uma série de antibióticos pré-estabelecidos.
3. Metodologia
. Streak Plate
. Esterilizar a alça de inoculação flambando-a no bico de Bunsen. Aguardar esfriar.
.Escolher colônia isolada e espalhá-la em estrias no primeiro quadrante da placa de Agar.
. Esterilizar novamente a alça.
. Tocar em um a dois pontos das estrias do primeiro quadrante já espalhado e em seguida espalhar em estrias no segundo quadrante.
. Esterilizar novamente a alça.
. Repetir o procedimento no terceiro e quarto quadrantes.
, Incubar a placa a 37℃ por 24 horas.
. Teste de susceptibilidade a antimicrobianos (método de difusão de disco de Kirby-Bauer)
. Preparar uma placa homogeneamente com uma cultura bacteriana pura.
. Aplicar na placa os discos de papel filtro impregnados com o antimicrobiano.
. Observar a formação de um halo de inibição do crescimento bacteriano, cujo diâmetro vai ser inversamente proporcional à concentração mínima necessária para a inibição.
. Medir o diâmetro dos halos de inibição e compará-los a tabela padrão de interpretação de forma a classificar a amostra como suscetível, intermediária ou resistente ao antimicrobiano. 
4. Resultados e Discussão
. Streak Plate (Plaqueamento por esgotamento em estrias)
O método de plaqueamento por estrias permitiu o isolamento de uma cultura pura de uma bactéria específica.
 	É um método de isolamento rápido e qualitativo. Ele é essencialmente um método de diluição, onde a primeira amostra do primeiro quadrante será diluída até se obter colônias puras individuais no quarto quadrante. É o método mais popular para se isolar uma bactéria específica de uma amostra contendo uma mistura de microorganismos. Amostras podem ser retiradas das colônias isoladas resultantes, e uma nova cultura pode ser criada em uma nova placa, de forma a identificar, estudar e testar o microorganismo ali presente. 
O plaqueamento por estrias tem duas principais desvantagens. Primeiramente, ele não permite o crescimento de organismos anaeróbicos. Além disso, apenas organismos que são viáveis na amostra original são capazes de crescer na placa.
Alguns cuidados devem ser tomados para evitar erros. As placas de Petri devem ser identificadas antes de qualquer coisa, evitando confusões futuras. As placas precisam estar livres de umidade condensada. Deve-se evitar o contato da alça com a borda da placa para evitar contaminações. Utilizar sempre pequenas quantidades da amostra inicial. Fazer as estrias com movimentos rápidos e suaves, evitando “erodir” o Agar, um Agar erodido produzirá menos colônias e não terá um bom aspecto. Não esquecer de esterilizar e esfriar a alça antes de estriar cada quadrante, evitando contaminações. Sempre observar as placas a certa distância do rosto, evitando contaminações pela respiração.
Este processo é muito utilizado em análises em laboratórios de microbiologia de alimentos para estudos de verificação da qualidade microbiológica de alimentos. Através do plaqueamento por esgotamento em estrias, feito em meios seletivos, é possível identificar contaminações com patógenos específicos, como Salmonella spp. (TEIXEIRA, 2013).
(a)
(b)
Figura 1: (a) Ilustração simplificada do plaqueamento por estrias; (b) Resultado obtido através do laboratório virtual. 
.Teste de susceptibilidade a antimicrobianos (método de difusão de disco de Kirby-Bauer)
Através do método de difusão de disco de Kirby-Bauer pôde ser verificada a susceptibilidade da cultura de Escherichia coli em questão ao tratamento com Cefalotina, Cloramfenicol, Ciprofloxacina, Streptomicina, Tobramicina e Trimetoprima sulfa. Foi verificada resistência da bactéria à Amoxicilina, Clindamicina, Eritromicina, Oxacilina e Penicilina. Uma resposta intermediária foi verificada para a Tetraciclina.
Figura 2: Medição dos halos no teste de Kirby-Bauer
A resistência que muitos microorganismos estão adquirindo e a velocidade crescente com que isso vem acontecendo faz com que esse tema se torne motivo de preocupação tanto a nível nacional como internacional (através de programas de controle e monitoramento da Anvisa, da OMS e da cooperação entre ambas). Bactérias como E.coli e M. Tuberculosis possuem cepas multi, pluri resistentes que são mundialmente reportadas e são um problema de saúde pública. Amostras de bactérias resistentes já foram verificadas nas mais diversas fontes, desde produtos alimentícios (processados, preparados, ou não), produtos agrícolas a excrementos de animais de produção. Com as possibilidades de troca entre cepas destes genes responsáveis pela expressão da resistência (de uma não patogênica a uma patogênica, por exemplo), e mesmo entre espécies bacterianas distintas, este é um perigo que constantemente ronda a cabeça dos especialistas.
Figura 4: Estudo feito na India relata a contaminação de restaurantes por cepas resistentes de E.coli.
A transmissibilidade da resistência acontece por diversos meios, podendo ocorrer tanto dentro da mesma população hospedeira, como de animal para homem e vice versa (BACCARO,2002). Dessa forma, o uso incorreto (no que diz respeito a escolha do antimicrobiano e ao prazo do tratamento), desnecessário ou abusivo (como o uso profilático ou de promotores de crescimento em animais de produção) é um problema tanto para a medicina veterinária como para a humana, já que o contato dos homens com os animais e seus subprodutos, manuseando ou ingerindo, pode aumentar a ocorrência de resistência de microorganismos patogênicos para ambos, tanto através do consumo indireto de antimicrobianos como pelo contato ou ingestão de cepas resistentes (FREITAS, 2005). Além disso, a ingestão pode não levar à infecção da pessoa contaminada, visto que pode acontecer de a bactéria passar pelo TGI transitoriamente, protegido pela flora residente. No entanto, se a carga de bactérias for alta, esta flora fecal pode ser um forte foco de resistência bacteriana (AHAMED, 2014).
Fonte: BACCARO, M.R. et al. RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA DE AMOSTRAS DE ESCHERICHIA COLI ISOLADAS DE FEZES DE LEITÕES COM DIARRÉIA. Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.69, n.2, p.15-18, abr./jun., 2002.
Existem alguns mecanismos que possibilitam às bactérias adquirir resistência aos antimicrobianos. A Echerichia coli, surpreendentemente, pode apresentar todos estes processos.
. Alterações na permeabilidade – As bactérias gram negativas possuem uma permeabilidade da membrana externa de lipopolissacarídeos limitada, possibilitada por porinas. Este fato, por si só, já as torna resistentes a penicilina, eritromicina, clindamicina e vancomicina. Alterações na estrutura destas porinas podem resultar em bactérias com novas resistências.
. Alteração no sítio de ação – Alterações genéticas podem modificar o local-alvo de atuação do antimicrobiano, inativando-o ou alterando seu sítio de ligação.
. Algumas bactérias são capazes de bombear ativamente o antimicrobiano do meio intracelular para o extracelular (efluxo ativo). É o caso da resistência às tetraciclinas em Escherichia coli. 
. O mecanismo de resitência mais comum se dá através da degradação do antimicrobiano por enzimas.
 (Retirado do site da Anvisa: http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/rm_controle/opas_web/modulo3)
5. Considerações finais
O uso de antibióticos de forma indiscriminada e/ou errônea atua no aumento e na manutenção da resitência bacteriana. O uso destes
medicamentos exige uma escolha criteriosa para indicação e duração da terapia. O monitoramento e controle da disseminação da resistência bacteriana envolve um trabalho tanto epidemiológico quanto de treinamento, capacitação e conscientização individual de cada profissional da saúde, da manutenção hospitalar, e de todos os outros setores envolvidos, e dos próprios doentes e seus familiarres (SERUFO, 2007), ou no caso dos animais, dos tutores.
A aula no laboratório virtual foi bastante proveitosa. O programa explica detalhadamente o processo e, além disso, corrige e “dá dicas” sobre erros cometidos (experiência tornada ainda mais prazerosa com a tradução do professor Ronaldo), tornando a experiência ativa e didática. Infelizmente não temos como praticar a habilidade do procedimento em si (como a força e a destreza com que se deve pressionar a haste no Agar, ou como colocar os discos de papel filtro do antibiograma), mas diante das atuais circunstâncias, é uma ótima maneira de se familiarizar com os procedimentos.
6. Referências Bibliográficas
. AHAMED, P.K. et al. ANTIMICROBIAL DRUG RESISTANCE IN STRAINS OF Escherichia coli ISOLATED FROM FOOD SOURCES. Rev Inst Med Trop, Sao Paulo. Jul-Aug; 56(4): 341–346, 2014.
. BACCARO, M.R. et al. RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA DE AMOSTRAS DE ESCHERICHIA COLI ISOLADAS DE FEZES DE LEITÕES COM DIARRÉIA. Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.69, n.2, p.15-18, abr./jun., 2002.
. FREITAS de, M. F. L. Utilização indiscriminada de antimicrobianos e sua contribuição a multirresitência bacteriana. Braz J vet Res anim Sci, São Paulo, v. 42, n. 6, p. 465-470, 2005.
. SERUFO J. C. Relatório - Avaliação da dinâmica de contaminação extrínseca de sabonetes líquidos e anti-sépticos no processo de uso em hospitais brasileiros da rede sentinela. Convênio 017/2003 entre a Fundação de Desenvolvimento da Pesquisa – FUNDEP e a Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA (Gerência Geral de Tecnologia em Serviços de Saúde – GGTES), Belo Horizonte, Minas Gerais, 2007.
. TEIXEIRA, L. E. B. et al. Qualidade microbiológica de frutas e hortaliças comercializadas na cidade de Juazeiro do Norte – CE. Revista Verde de Agroecologia e Desenvolvimento Sustentável, Mossoró – RN, v. 8, n. 3, p. 23 - 26 , jul – set , 2013.
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