Resumo sobre métodos de clonagem - Gateway, Gibson Assembly, recombinação in vivo e métodos de transformação

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Métodos de clonagem 
Gateway 
Slide 1 
-> Não se usa enzimas de restrição nem DNA ligase 
-> Faz-se uma PCR pra adicionar as sequências attB no nosso gene de interesse. 
-> Também vamos ter o nosso vetor de doação, que é onde queremos colocar o nosso gene. 
-> A enzima BP vai fazer a reação BP, o que significa que ela passa esse gene pro vetor, e o 
gene que tava nele antes, o ccdB, ele cai fora. 
-> As bactérias que recebem o ccdB vão morrer por toxicidade 
-> Também tem gene de resistência a antibiótico, assim só vão sobreviver aquelas que 
receberem o plasmídio. 
 
Slide 2 
-> O nosso vetor de entrada então contém o nosso gene de interesse, agora entre as regiões 
attL 1 e 2. 
-> Se quisermos passar esse gene para outro vetor, talvez porque queremos colocar em outro 
organismo etc, podemos pegar um vetor de destino que tenha as sequências attR 1 e 2, e 
então a LR clonase faz essa troca entre os vetores. 
-> Novamente, só sobrevivem aquelas células que receberam o vetor clone de expressão, as 
demais morrem porque ou receberam ccdB que é tóxico ou porque não tem resistência a 
antibiótico. 
 
 
Gibson Assembly 
● Região de homologia entre as extremidades do vetor e da tua sequência -> amplificar 
vetor e gene de interesse com primers que vão deixar essa sequência de 20pb de 
homologia. 
● Pega as sequências de fragmento do PCR e coloca num eppendorf com mix de 
enzimas 
Exonuclease 
DNA polimerase 
DNA ligase 
-> Anelamento das regiões de homologia vetor e gene de interesse 
Exonuclease retira os nucleotídios em 5’ e permite que anelem 
DNA polimerase completa lacunas 
DNA ligase vem e liga o plasmídio no gene de interesse. 
Depois faz a transformação das bactérias 
 
 
Recombinação in vivo 
Faz a PCR que nem Gibson, 
Amplificando tanto gene de interesse como o vetor com um primer que vão anelar e construir 
regiões de homologia 
Pega os fragmentos do PCR e em vez de colocar enzimas, transforma isso direto na bactéria 
As bactérias têm as enzimas para fazer a clonagem, a eficiência e um pouco menor mas é 
barato pq enzimas são caras. 
 
 
Transformação 
Eletroporação​: A eletroporação utiliza a ação da corrente elétrica de alta voltagem, sobre os 
componentes da membrana citoplasmática, polarizando a célula e gerando uma diferença de 
potencial. Quando este potencial ultrapassa um limiar de voltagem, ocorre micro rupturas 
(abertura dos poros) provisórias na membrana celular, promovendo um fluxo de íons e 
moléculas através das membranas, como exemplo, a entrada intracelular de um plasmídeo. A 
remoção do campo elétrico resulta no fechamento espontâneo dos poros bacterianos 
Choque térmico: o aumento repentino de temperatura criando diferença de pressão entre o 
exterior e o interior da célula induzindo a formação de poros na membrana plasmática da 
bactéria e permitindo que o plasmídeo entre intracelularmente na célula hospedeira e/ou 
bacteriana. A técnica por choque térmico é considerada acessível por mostrar-se teoricamente 
uma metodologia simples e de baixo custo. 
Resumo: Coloca a bacteria a 45 graus e depois coloca no gelo (choque termico) e no caso da 
eletroporação tu ta um choque eletrico e isso vai abrir os poros da membrana permitindo a 
entrada do plasmídeo. 
 
Pos transformação: deixar as bacterias crescerem, ai vai depender do que tu quer, tu pode 
extrair o plasmideo da bactéria e expressar a proteina em outro organismo ou na propria 
bacteria mesmo.