Engenharia Genética - P4 semanal

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P4 Semanal - ENGENHARIA GENÉTICA 
 
Engenharia genética de plantas 
O isolamento de DNA de plantas e de material vegetal proveniente de cultura de tecidos é uma 
etapa importante na análise da estrutura e organização do genoma de plantas. Essas análises 
necessitam, frequentemente, do uso de enzimas de restrição, que cortam o DNA em fragmentos. 
Independente do tipo de estudo molecular, as preparações de DNA devem produzir amostras 
puras suficientes para não inibir os tratamentos enzimáticos ou causar interferências nos padrões 
de migração em gel de eletroforese. 
Para obtenção de DNA de boa qualidade, algumas etapas devem ser realizadas. 
 
1ª ETAPA – ROMPIMENTO DAS MEMBRANAS CELULARES 
As paredes celulares devem ser rompidas com o objetivo de liberar os constituintes celulares. 
Esse rompimento pode ser realizado por métodos físicos ou métodos químicos. 
No método físico, isso é realizado geralmente pelo congelamento do tecido vegetal em nitrogênio 
líquido e posterior quebra mecânica, com o auxílio de um pilão e de um almofariz, no caso de 
extração em larga escala. Para produção em pequena escala (ex: para PCR), a maceração pode 
ocorrer somente na presença de tampão de extração, sem a adição de nitrogênio líquido. 
Já no método químico, as membranas celulares são rompidas por meio de detergentes colocados 
no tampão de extração, detergentes laboratoriais como o SDS (dodecil sulfato de sódio) ou CTAB 
(brometo de cetiltrimetilamônio). O CTAB, presente na maior parte dos protocolos de extração 
vegetal, solubiliza membranas, formando um complexo com o DNA que facilita uma posterior 
precipitação diferencial desse complexo. Já o SDS é um detergente iônico forte, cuja função é 
romper as membranas celulares. 
No isolamento de DNA, é importante manter o DNA íntegro, e portanto, deve-se evitar a ação de 
DNAses, que podem degradá-lo. Com esse propósito, os tampões de extração possuem pH por 
volta de 8,0, enquanto o pH ótimo para ação de DNAses endógenas fica por volta de 7,0. O pH do 
tampão é mantido em 8,0 graças a presença de Tris-HCl (na prova passada, é aquela solução de 
Tris com pH ajustado pelo HCl). O Tris HCl (pH 8,0) que é uma solução tampão, cuja finalidade é 
manter o pH constante. 
Outro recurso usado é a adição de EDTA (ácido etileno diamono tetracético) no tampão de 
extração. O EDTA é uma substância quelante de cátions divalentes, como Mg2+ e Ca2+, e, 
portanto, inibe a ação de várias nucleases, como as DNAses, que usam esses metais como 
cofatores. 
 Quelantes, também conhecidos como sequestrantes, são componentes que atuam 
complexando e inativando íons metálicos, como Cálcio, Ferro, Cobre e Magnésio 
provenientes da água e/ou de matérias-primas da formulação. 
 
Para evitar, ainda, os efeitos indesejáveis da oxidação, diferentes produtos antioxidantes podem 
ser incluídos nos tampões de extração, como Bissulfito de Sódio, PVP (polivinilpirrolidona) e/ou 
BSA (albumina de soro bovino). O PVP é um antioxidante que inibe a ação de compostos 
fenólicos. Já a BSA atua absorvendo os polifenóis, e, portanto, evitando a ação dessas 
substancias que tornam o DNA oxidado e inacessível às enzimas de restrição. Outro composto 
que pode ser incluído no tampão de extração para evitar a oxidação de compostos fenólicos é o 
β-mercaptoetanol. Ele é um agente redutor que desnatura as peroxidases e polifenoloxidases, 
impedindo a ação danosa dessas enzimas sobre o DNA. 
 O NaCl também pode ser utilizado no tampão de extração a fim de neutralizar a carga 
negativa do DNA. 
 
2ª ETAPA – DIGESTÃO DE PROTEÍNAS 
Os ácidos nucleicos devem ser separados das proteínas. Para isso, realiza-se de uma a várias 
extrações com solventes orgânicos, como fenol, clorofórmio e álcool isoamílico, que desnaturam 
as proteínas tornando-as insolúveis à fase aquosa, onde se encontram os ácidos nucleicos. No 
geral, é adicionada uma proporção de fenol – clorofórmio – álcool isoamílico na proporção 
(25:24:1). 
 FENOL: atua na desnaturação das proteínas de maneira eficiente. Ele inverte a carga 
elétrica do DNA para promover a sua solubilização na fase aquosa (as moléculas de DNA 
têm carga negativa devido aos grupos fosfatos). 
 A mistura de fenol e de clorofórmio é muito eficiente para desproteinizar e sua ação se 
fundamenta na propriedade hidrófoba das proteínas que apresentam afinidade por solventes 
orgânicos. 
 O álcool isoamílico previne a formação de espuma quando a mistura é agitada, o que 
torna mais fácil a separação da fase orgânica e da fase aquosa. 
 Uma alternativa à utilização dos solventes orgânicos como o fenol é fazer a separação 
das proteínas utilizando altas concentrações de sal (salting-out). O efeito “salting out” é a 
precipitação de proteína em solução por altas concentrações de sais. Os sais atraem as 
moléculas de água do meio, de modo a ficar menos água disponível para as moléculas 
protéicas o que acarreta na diminuição da solubilidade e precipitação. O NaCl, por exemplo, 
ajuda a precipitar proteínas. 
Após a extração com esses solventes orgânicos, é realizada a centrifugação para separar a fase 
orgânica da fase aquosa. Esses solventes desnaturam proteínas que ficam na interface, enquanto 
o DNA e outros contaminantes, como carboidratos e RNAs, se mantêm na fase aquosa. Alguns 
protocolos incorporam proteases antes da extração com solventes orgânicos, o que facilita a 
separação do DNA das proteínas da cromatina. 
 
3ª ETAPA – PRECIPITAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS 
Após a “desproteinização”, o DNA pode ser precipitado ou sofrer diferentes tratamentos que o 
separam de outros contaminantes para garantir a máxima pureza do material. Para precipitá-lo, 
eu transfiro a fase aquosa para um novo tubo, adiciono álcool (isopropanol ou etanol) e NaCl, que 
“reinverte” as cargas elétricas do DNA, fazendo-o precipitar a partir de inversões leves (formação 
de massa branca). Utiliza-se álcool porque ele, em presença de cátions monovalentes, promove 
uma transição estrutural na molécula de ácido nucleico, resultando em agregação e precipitação. 
Em seguida, incubo a -20ºC por pelo menos 1 hora (pode ficar overnight). 
 O álcool torna o meio muito hidrofóbico para o DNA, fazendo com que ele precipite sobre 
sua própria estrutura. 
 Fenol = inverte carga elétrica do DNA (solubiliza DNA, mantendo-o na fase aquosa); 
 Álcool + sal = reinverte a carga (precipita o DNA). 
 
 
4ª ETAPA – LAVAGEM DO PELLET (DO PRECIPITADO) 
Após a precipitação, deve-se lavar pellet (precipitado) com etanol 70% a fim de remover resíduos 
(sais, contaminantes,...). Por fim, deve-se secar o precipitado. 
 O precipitado não deve ter resíduos de isopropanol ou secar demais, o que pode dificultar 
a ressuspensão do DNA. 
 O álcool 100% faz com que precipitem muitos sais juntamente com o DNA, além de 
dificultar a ressuspensão do DNA, por isso utiliza-se uma “lavagem” com álcool 70% 
5ª ETAPA – RESSUSPENSÃO DO PELLET FORMADO 
O pellet (precipitado) é dissolvido em solução de Tris-EDTA (solução TE), onde Tris é para 
manter o pH estável (tampão) e o EDTA para retirar íons cofatores. Nesse momento, pode-se 
adicionar RNAse (enzima que degrada RNA), e manter incubado a 37ºC por 1 hora para a 
completa degradação do RNA. Por fim, deve-se armazenar em freezer a -20ºC. 
 Este protocolo isola juntamente com o DNA uma quantidade considerável de RNA, por 
isso o tratamento com RNase se faz necessário para remover este contaminante. 
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Os protocolos de extração de DNA podem sofrer alterações dependendo do tecido que será 
utilizado. Em geral, seguem as etapas descritas, de rompimento da membrana, digestão de 
proteínas, precipitação, lavagem do pellet e ressuspensão. 
Existem kits comerciais para a extração de DNA de tecidos específicos (extração por colunas, 
breads magnéticas). 
 
ATIVIDADE PRÁTICA – EXTRAÇÃO DE DNA DE CANA-DE-AÇÚCAR 
1) O colmo da cana foi descascado atéatingir o tecido meristemático (o meristema é o primeiro 
entre-nó da cana). O tecido meristemático (“folhas jovens”), por estar em constante divisão 
celular, tem alta quantidade de DNA, gerando uma extração mais eficaz. 
 Alguns procedimentos de extração (mas não foi o que a gente fez em aula) consistem em 
capturar folhas jovens e colocá-las, imediatamente, em nitrogênio liquido onde serão 
conservadas até o momento de uso. Como o uso do meristema foi imediato, não houve 
necessidade. 
2) Ao atingir o meristema (parte mais mole do colmo), este foi cortado em rodelas (igual salsinha) 
com o auxílio de um bisturi, e foi colocado, imediatamente após o corte, em um almofariz 
contendo 5 mL de solução tampão, sem que o meristema tivesse contato com a mão do 
operador. Além disso, era importante que as rodelas de meristema caíssem dentro da solução 
para inibir processos oxidativos que poderia prejudicar a amostra. 
CTAB 2% (detergente) 
Bissulfito de sódio (antioxidante) 
  Solução tampão: Tris-HCl (solução tampão, que mantém o pH estável) 
EDTA (quelante) 
NaCl (neutraliza a carga negativa do DNA) 
 
3) As rodelas de meristema foram maceradas no almofariz (contendo a solução tampão) com o 
auxilio do pistilo. 
4) Transferimos 3 mL da amostra macerada para um tubo Falcon 15 mL, e 
acrescentamos 3 mL do Mix. O tubo foi levado a banho-maria por 30 minutos, sendo que 
a cada 10 minutos, a amostra do tubo deveria ser homogeneizada. 
CTAB 20% (detergente) 
  Solução MIX: PVP (antioxidante) 
N-Lauroyl-Sarcosine (surfactantes aniônicos – ou tensoativos – 
diminuem a tensão superficial) 
 
5) As amostras foram resfriadas em temperatura ambiente, e em seguida, foi adicionado Fenol : 
Clorofómio : Álcool isoamílico, na proporção 25:24:1, e a solução foi misturada por inversão (vira 
de ponta cabeça e volta) vigorosa durante 2 minutos. 
6) Os tubos foram centrifugados a 12000 rpm durante 10 minutos, a fim de que as fases orgânica 
e líquida fossem distinguidas (DNA está na fase líquida). 
7) O sobrenadante (fase líquida) é transferido para um novo tubo Falcon, e foi acrescentado 
isopropanol gelado (800μL) e NaCl 5M (200μL) por mL de amostra, sempre respeitando essa 
proporção. 
8) Os tubos foram invertidos levemente de duas a três vezes, onde foi possível 
verificar a formação de uma massa branca. Essa massa nada mais é do que o 
DNA precipitado (pellet). 
9) O tubo foi incubado a -20ºC por pelo menos 1 hora (ou overnight). O tubo foi 
centrifugado a 12000 rpm por 10 minutos. 
10) O sobrenadante é descartado, e o pellet é lavado duas vezes com 500μL 
de etanol 70%. Ele é, então, secado a temperatura ambiente. 
11) Então, é feita a ressuspensão do pellet em 50 μL de TE + RNAse (1000 μL TE: 5 μL de 
RNAse) a fim de degradar o RNA da amostra. 
12) Por fim, incubar em banho-maria a 37ºC por no mínimo 1 hora. 
 
QUANTIFICAÇÃO DO DNA 
1) ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 
A eletroforese é uma técnica laboratorial simples que utiliza a corrente elétrica para promover a 
separação de moléculas carregadas, como proteínas e ácidos nucleicos. A migração das 
partículas ocorre por diferença de carga elétrica e por peso molecular, de forma que moléculas 
menores migram mais rapidamente que as maiores. 
Esse método não necessita de aparelhos sofisticados e fornece estimativas de concentrações do 
DNA com aproximação suficientemente precisa. Consiste basicamente na comparação visual de 
um gradiente de concentração conhecida de DNA, com sua amostra analisada, tudo isso em um 
gel de agarose corado com brometo de etídio. Vamos descrever o passo a passo do método. 
O gel de agarose é a matriz na qual é aplicada a amostra e que permite realizar a separação das 
moléculas de DNA. O gel é preparado a partir da mistura de TBE (Tris/Borato/EDTA – solução 
tampão) + agarose. A solução é diluída, e colocada para derreter. Quando a solução esfriar a 
uma temperatura tolerável (por volta de 30°C), ela adquire seu aspecto de gel. A concentração do 
gel pode mudar de acordo com o tamanho da molécula que será estudada, mas geralmente é de 
1%. 
O gel de agarose é, então colocado em um suporte. Para isso, o gel (ainda em estado liquido) é 
adicionado no suporte, e um pente é colocado dentro do gel, na borda do suporte. Ao solidificar, o 
pente é retirado, e os seus dentes formam poços no gel de agarose. O suporte contendo o gel de 
agarose é colocado no interior da cuba de eletroforese horizontal, imerso em uma solução 
tampão (ex: TBE 1x). 
Em seguida, as amostras são pipetadas nos pequenos poços feitos com o pente no gel. Um 
exemplo de método seria: em dois poços, eu aplico a minha amostra de DNA (que eu quero 
conhecer), mas em um poçoo eu aplico 2μL e em outro, aplico 4μL, já que o de 4 μL vai ter um 
brilho de maior intensidade. Nos outros 3 poços, eu posso aplicar meu DNA padrão (DNA de fago 
lambda). O DNA padrão (DNA de fago lambda) deve ser de alto peso molecular, pois DNAs de 
baixo peso molecular são de difícil comparação com DNAs genômicos, e preferencialmente 
comercial, por possuírem concentração precisa. Os DNA padrão geralmente vem em tubos na 
concentração de 300 ng / μL. Eu, portanto, posso fazer uma diluição 1/10 para produzir uma 
solução de 30 ng / μL. Nisso, em um poço eu aplico 1 μL do DNA lambda (30 ng), no outro 2 μL 
(60 ng) e no outro 3 μL (90 ng). A partir disso, eu comparo as corridas. 
 Para que aconteça a visualização de maneira correta, os géis são corados a partir da 
adição de brometo de etídio, por exemplo. O brometo de etídio é uma forma de “acender” o 
DNA do gel sob luz UV. 
A cuba é conectada a uma fonte de alimentação e a voltagem, corrente e tempo de corrida são 
definidos. Como o DNA é negativamente carregado, ele é atraído pelo eletrodo 
positivo. Entretanto, para chegar ao eletrodo positivo, o DNA deve migrar através do gel de 
agarose. Os fragmentos de DNA menores podem migrar através de um gel de agarose mais 
rapidamente que os fragmentos de DNA maiores. A velocidade de migração de fragmentos de 
DNA lineares através da agarose é inversamente proporcional a log10 de seus pesos 
moleculares. Após o tempo estipulado, abro a cuba e faço a “revelação” do gel. Os fragmentos de 
DNA podem, então, ser isolados e purificados a partir dos géis de agarose. 
 As bandas de DNA precisam ser bem definidas. Se aparecer um arraste a partir da 
banda, é sinal de contaminação. Se ocorrer um arraste total, indica que o DNA está 
totalmente degradado. 
 Como na aula prática o DNA não foi fragmentado, espera-se obter uma única banda. Se 
houver mais, isso pode indicar contaminantes, DNA fragmentado, etc. 
 
 
 
 
1) ESPECTROFOTOMETRIA 
Uma das desvantagens do método anterior é que ele é muito subjetivo na análise, pois trata-se 
de uma análise por comparação visual. Além disso, no método de eletroforese não é possível 
verificar a presença de contaminantes. 
Já no método de espectrofotometria, o DNA é quantificado a partir dos espectrofotômetros. 
Funciona da seguinte maneira: eu adiciono de 1 a 2 μL de DNA na cubeta do aparelho, e regulo o 
meu equipamento para comprimentos de onda de 260 nm, que é a faixa de absorbância dos 
nucleotídeos (DNA/RNA). Ligo o aparelho, e por meio de um software, ele cria um gráfico de 
absorbância de lê a área de baixo da curva, e te dá uma resposta quantitativa, automaticamente, 
em ng/μL. 
Para verificar se há presença de contaminantes na amostra (ex: proteína), ou seja, para 
determinar a pureza da amostra de DNA, o aparelho fornece a relação entre as leituras de 
absorbância 260/280 nm (280 nm é o comprimento de onda absorvido por proteínas). Se a razão 
estiver entre 1,8 e 2,0 (ou, nos extremos, maior que 1,4 e menor que 2,2), isso indica que a 
amostra de DNA apresenta uma pureza adequada. Um valor inferior indica contaminação com 
proteínas e um valor superior indica contaminação com fenol. 
Um dos problemas aqui é quepara quantificar o DNA eu preciso dispor de amostras SEM RNA, 
visto que o RNA tem a mesma faixa de absorbância de 260 nm.