Engenharia Genética - P8 semanal

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P8 Semanal - ENGENHARIA GENÉTICA 
 
MARCADORES MOLECULARES 
Na implantação de um programa de melhoramento, uma das principais necessidades do melhorista 
é a capacidade de identificar genótipos superiores em uma população segregante. De forma empírica, 
desde o inicio da agricultura, os melhoristas identificavam as espécies com alguma característica de 
interesse, e utilizavam essas espécies para dar continuidade à cultura, descartando aquelas com 
caracteres indesejáveis. Isso deixa claro que, baseado em diferenças fenotípicas (polimorfismo), os 
indivíduos eram selecionados. Logo, os marcadores surgiram para facilitar isso. 
Marcadores incluem qualquer característica morfológica ou molecular que diferencie indivíduos, e que seja 
facilmente detectável. 
Primeiro, vamos a um rápido histórico: 
 Anos 1900: descoberta dos princípios genéticos; 
 Anos 1920-1950: melhoramento genético científico; 
 Anos 1970-1980: utilização de marcadores genéticos moleculares; 
Para o sucesso no melhoramento genético, é necessário distinguir quais características são 
herdáveis (passarão de geração em geração), e quais são frutos unicamente do ambiente em que o 
individuo está inserido. Por conta disso, um marcador pode ser dividido em GENÉTICO e NÃO 
GENÉTICO: 
 MARCADORES GENÉTICOS: quando a variação está na sequência de DNA; 
 MARCADORES NÃO GENÉTICOS (ou morfológicos): quando a variação está nas proteínas 
produzidas (mais relacionados às variações fenotípicas); 
Quando falamos de melhoramento genético, o que nos interessa são os marcadores moleculares 
GENÉTICOS. Esses marcadores são unidades herdáveis que podem ou não estar associado a uma 
variação fenotípica. Dentre as vantagens do marcador genético molecular é que o POLIMORFISMO é 
detectado na sequência de DNA, não sendo objeto de influências ambientais. Isso pode permitir o 
estabelecimento de alguma relação fenotípica (ex: se um individuo apresentar um marcador genético x, ele 
vai ser 3 vezes mais produtivo do que aquele que não possuir). 
A única desvantagem desse marcador em comparação com o marcador MORFOLÓGICO é que a 
identificação do polimorfismo envolve analises moleculares mais complexas. 
 
 
1) MARCADORES GENÉTICOS MOLECULARES 
A detecção e a análise de polimorfismos genéticos são de interesse em diversas áreas, pois podem 
nos auxiliar a compreender a base molecular de vários aspectos biológicos. Por conta disso, os 
marcadores moleculares surgiram devido à necessidade da detecção de polimorfismo genético 
diretamente no DNA. Marcadores genéticos moleculares são, portanto, características do DNA que 
diferenciam dois ou mais indivíduos, e são herdados geneticamente. 
Os marcadores moleculares podem ser encontrados em todos os seres vivos, devido às mutações 
ocorridas em sequencias repetidas da molécula de DNA. Eles foram descobertos através do estudo de 
polimorfismos, com a ajuda da biologia molecular, usando técnicas como a de PCR. 
As técnicas para estudos com marcadores moleculares têm sido aprimoradas com os progressos 
fenomenais das metodologias que permitem a identificação de marcadores em escala genômica, tais 
como o surgimento de diferentes plataformas de sequenciamento de alto desempenho (hoje denominadas 
de plataformas de Next Generation Sequencing – NGS). 
 Karl Sax (1923): método de localização de QTL (locos de caracteres quantitativos); 
 Hunter & Market (1957): marcas bioquímicas (desenvolveram isoenzimas em gel de amido); 
 Hubby & Lewontin (1966): isoenzimas polimórficas em Droshophila; 
 1970: surgimento de ferramentas moleculares (enzima de restrição, polimerase, etc). 
O uso de marcadores moleculares permite que a seleção e novos cruzamentos sejam realizados 
em uma mesma geração, o que aumenta consideravelmente a eficiência de um programa de 
melhoramento, por exemplo. Podem ser usados mesmo que não tenham sido mapeados, ou seja, 
associados a um gene, a uma região cromossômica ou a um fenótipo, desde que possam ser 
seguidos em gerações subsequentes, comprovando sua natureza genética. 
Marcadores moleculares de DNA têm sido usados para sinalização de genes de resistência a 
doenças, insetos e pragas; avaliação e caracterização de germoplasma; melhoramento dos pais 
de híbridos; desenvolvimento de mapas genéticos; testes de pureza genética; seleção de 
resistência a patógenos exóticos ainda inexistentes em determinada região; associação com 
caracteres quantitativos; estudos de interação genótipo-ambiente entre outros. 
 
2) MARCADORES DOMINANTES x MARCADORES CODOMINANTES 
Antes de analisarmos os tipos de marcadores, vamos entender as diferenças entre marcadores 
dominantes e codominantes. Para facilitar a visualização, vamos usar o exemplo de CODOMINÂNCIA de 
uma rosa. 
Nesse caso, a rosa com alelos codominantes apresentam 3 fenótipos possíveis: 
 AA: rosa vermelha; 
 Aa: rosa cor-de-rosa; 
 aa: rosa branca. 
Quando eu uso um MARCADOR CODOMINANTE, eu consigo distinguir os indivíduos heterozigotos dos 
homozigotos. Nesse caso, ao usar um marcador dominante nessa flor, as ROSAS VERMELHAS 
apresentarão UMA banda, as ROSAS BRANCAS terão, também, UMA banda em uma posição um pouco 
diferente da enterior (ou mais acima ou mais abaixo que a banda da rosa vermelha), e as ROSAS COR-
DE-ROSA apresentarão DUAS BANDAS (uma por conta do alelo A, e outra por conta do alelo a). 
Quando eu uso um MARCADOR DOMINANTE, não é possível diferenciar o homozigoto do heterozigoto. 
Nesse caso, se o genótipo da flor apresentar, ao menos, uma alelo “A”, a banda aparece. Caso não tenha 
nenhum alelo “A”, só “a”, a banda NÃO APARECE. Nesse caso, temos uma banda tanto no AA quanto no 
Aa, enquanto que no aa eu não tenho nada. Com isso, torna-se impossível distinguir quem é AA de quem 
é Aa. De uma forma geral, o AA apresenta uma banda em uma tonalidade mais forte do que a banda do 
Aa, mas como isso é muito subjetivo, não é considerado. 
 Ele fica mais escuro porque cada alelo A gera uma sequencia de dado tamanho. Logo, em um individuo 
AA 
Por conta disso, é sempre mais vantajoso usar um MARCADOR CODOMINANTE! 
 
 
3) TIPOS DE MARCADORES MOLECULARES 
Existem vários tipos, e dentre eles podemos citar: 
 RFLP 
 Microssatélites; 
 RAPD; 
 AFLP; 
 SCAR; 
 SNPs. 
 
 
a) SSR 
Os marcadores microssatélites são MULTIALÉLICOS, CODOMINANTES e ALTAMENTE 
REPRODUTÍVEIS. Esse marcador consiste em pequenas sequências de 1 a 6 pares de bases, que se 
encontram repetidas em tandem no genoma de eucariotos ou procariotos (tandem é quando a sequencia é 
repetida várias e várias vezes. EX: ATCATCATCATCATC  sequência ATC repetida em tandem). Essas 
sequências são distribuídas ao acaso no genoma, tanto em regiões codificantes quanto em não 
codificantes, constituindo a classe de marcador mais polimórfica hoje disponível. As repetições mais 
comuns são de di, tri e tetranucleotídeos (2, 3 e 4 nucleotídeos, respectivamente). 
 MOTIVO: numero de repetições da sequencia de nucleotídeos. EX: sequência com 3 
nucleotídeos, e 8 motivos indica que a sequência que se repete tem 3 bases, e essa sequência se 
repete 8 vezes (ATCATCATCATCATCATCATCATC). O limite de 6 bases é para a SEQUÊNCIA; o 
número de motivos é bastante variável, podendo variar de dezenas a centenas. 
Os microssatélites possuem um alto polimorfismo, visto que podem existir diferenças no número de 
repetições para um mesmo marcador, decorrente das altas taxas de mutação nestes locos. Existem 
alguns fatores que explicam essas taxas, como: 
- Escorregamento da DNA polimerase durante a replicação; 
- Crossing-over desigual entre cromátides irmãs. 
O alto polimorfismo característico desse tipo de marcador leva à possibilidade de identificar perfis 
característicos de cada indivíduo de uma mesma espécie, de acordo com a variação no número das 
repetições. 
 O que me faz enxergar diferenças entre indivíduos é o NÚMERO DE REPETIÇÕES DOS 
MOTIVOS, e é o numero de motivos quedetermina o meu ALELO. Lembra lá no inicio quando 
falamos de marcadores codominantes? Lá, a gente comentou que a banda do AA era em uma 
posição, e a banda do aa era em outra posição, ou mais acima, ou mais abaixo que o anterior. Isso 
acontece porque o alelo A possui um marcador com um número de motivos, e o alelo a tem outro 
número de motivos. Quando há poucos motivos, isso significa que a sequência corre mais no gel, e 
quando há muitos motivos, a sequência corre menos. É importante deixar claro que não há relação 
entre o número de motivos e o fato de o individuo ser AA ou aa. Isso também explica o porquê dos 
Aa apresentarem duas bandas: é porque cada alelo apresenta um determinado numero de motivos, 
e como nesse genótipo temos os dois alelos, um corre mais e outro corre menos (não vemos duas 
bandas no homozigoto porque como só há um alelo, só há um número de motivos, e por isso, eles 
percorrem a mesma distância no gel, se sobrepondo um ao outro). 
 Cada segmento amplificado de tamanho diferente representa um alelo diferente do mesmo loco! 
Os polimorfismos individuais são identificados a partir da amplificação por PCR da região contendo a 
repetição, usando iniciadores ancorados em regiões que flanqueiam o microssatélite. As regiões 
flanqueadoras são conservadas dentro e entre espécies ao longo da evolução, e muitas vezes entre 
gêneros ou até em níveis taxonômicos mais elevados. São ideais para estudos populacionais em 
diferentes níveis, podem trazer informações sobre padrões filogeográficos, contribuem para responder a 
questões como o grau de mistura genética entre as populações e diferentes níveis de parentesco e fluxo 
gênico. 
a.1) Processo de análise microssatélite 
Os marcadores microssatélites são obtidos a partir da amplificação via PCR, utilizando-se primers 
específicos (geralmente de 20 a 25 pares de bases) para as regiões do DNA que flanqueiam os 
microssatélites. Nesse sentido, para se conseguir marcadores microssatélites, é necessário primeiramente 
o desenvolvimento de primers específicos para a espécie em estudo. Esse desenvolvimento, portanto, 
requer a construção de bibliotecas genômicas enriquecidas a partir do uso de enzimas de restrição, 
seleção, sequenciamento e desenho dos primers. 
Mas, por que construir uma biblioteca? Porque a biblioteca é mais específica, diferente do sequenciamento 
total do genoma do organismo. Além disso, geralmente as bibliotecas de microssatélites são feitas de 
cDNA, porque como queremos analisar, geralmente, caracteres expressos, eu extraio o RNA (produtor da 
proteína expressa), e a partir dele, eu monto o meu cDNA (DNA complementar). 
PROCESSO: Extração do DNA genômico total  digestão do DNA (por meio de enzimas de restrição)  
anelamento de primers  amplificação  enriquecimento  seleção  amplificação após o 
enriquecimento. 
Após a construção dos primers a partir da biblioteca genômica, é feita a amplificação do microssatélite via 
PCR. Após a amplificação, a genotipagem dos indivíduos será feita por eletroforese, em géis de agarose 
ou poliacrilamida. Quanto mais motivos a região de microssatélite amplificada possuir, mais pesada vai ser 
a sequencia, e menos ela vai correr no gel. Já quanto menos motivos a região microssatélite possuir, mais 
leve ela será, e mais ela correrá no gel. Logo, quando estamos falando de dois alelos possíveis (A/a), um 
correrá mais (porque terá menos motivos), e o outro correrá menos (porque terá mais motivos), permitindo 
que seja possivel diferenciar os AA, Aa e aa. Lembrando que não existe relação entre número de motivos 
e o alelo referente (ex: o alelo A pode ter maior número de motivos que o a, ou vive-versa) 
 Em microssatélites, o uso da enzima de restrição serve apenas para a montagem da biblioteca. A 
identificação do marcador se dá, apenas, via PCR. 
VANTAGENS SSR 
- Codominância; 
- Altamente reprodutível; 
- Apresentam-se flanqueados por sequências únicas, podendo ser amplificados individualmente 
através de PCR; 
- Devido a sua natureza altamente repetitiva (e da pequena extensão da unidade de repetição), eles 
apresentam alto grau de polimorfismo. 
- São muito frequentes e encontram-se distribuídos ao acaso, apresentando ampla cobertura no 
genoma. 
- Ideais para mapeamento genético, identificação de genomas, discriminação de genótipos e estudo 
de genética de populações. 
 
DESVANTAGENS SSR 
- Necessidade de se conhecer a sequência de DNA com que se está trabalhando, a partir de bancos 
de dados de genoma ou cDNA; 
- Processo longo para a construção de bibliotecas; 
- Processo longo para a triagem dos melhores primers. 
 
b) AFLP 
Os marcadores AFLPs (Amplified Fragment Length Polymorphism - "Polimorfismo de Comprimento de 
Fragmentos Amplificados") são marcadores que se encontram distribuídos por todo o genoma de 
procariotos e eucariotos. São marcadores DOMINANTES (diferente do microssatélite). 
Os marcadores AFLPs resultam em padrões informativos. Esses marcadores possuem grande poder de 
detecção de variabilidade genética, mas para isso requerem uma DNA de boa qualidade. 
b.1) Processo de análise AFLP 
Os AFLPs são fragmentos de DNA (de 80 a 500 pares de bases) obtidos a partir da digestão do 
DNA a partir de enzimas de restrição. 
A técnica dos AFLP consiste primeiramente na clivagem do DNA genômico do indivíduo usando 
duas enzimas de restrição. Aqui, vamos usar como exemplo as enzimas MseI e EcoRI. Cada 
uma dessas duas enzimas possui um sítio de restrição (ou sítio de reconhecimento) específico, 
lembrando que toda vez que a enzima encontrar a sua sequência de restrição específica, ela cliva 
a molécula de DNA.O sítio de restrição da enzima MseI ocorre com maior frequência da molécula 
de DNA, e portanto, quando a MseI cliva o fragmento nas suas duas extremidades, esse fragmento é 
MENOR, e corre mais no gel. 
Já o sítio de restrição da EcoRI é mais difícil de ser encontrado na molécula de DNA, e por isso, quando 
essa enzima cliva o fragmento nas suas duas extremidades, o fragmento resultante é MAIOR, e corre 
menos no gel. Às vezes pode acontecer de o fragmento ser clivado pela EcoRI em uma extremidade, e 
pela MseI em outra, originando um fragmento NEM TÃO GRANDE, e NEM TÃO PEQUENO. 
Depois da digestão do DNA pelas duas enzimas de restrição, ocorre o anelamento de adaptadores 
específicos (2 adaptadores, um para cada extremidade clivada por cada uma das duas enzimas) e o uso 
de primers específicos, que atuam na seleção dos fragmentos. A seleção dos fragmentos é uma etapa de 
extrema importância quando se usa o marcador AFLP, pois esses marcadores geram um grande número 
de fragmentos, o que tornaria inviável utilizar TODOS esses fragmentos em uma reação de PCR, porque 
senão a leitura seria impossível. Então, para reverter essa situação, eu utilizo PRIMERS COM BASES 
SELETIVAS. 
Mas como isso funciona? Eu construo primers contendo de 1 a 3 bases seletivas arbitrárias (A/T/C/G), 
como no exemplo abaixo. 
 
Isso significa que apenas os fragmentos que possuírem uma sequência complementar a essas bases 
seletivas, serão selecionados para a amplificação final. 
Após o anelamento de primers com bases seletivas, eu realizo um pré-amplificação e realizo a seleção 
dos fragmentos. Em seguida, faço minha amplificação final (também chamada de amplificação seletiva). 
Após a amplificação, eu corro meus fragmentos em eletroforese, e para que as bandas se tornem visíveis, 
eu posso: 
 Marcar meus primers com fósforo radioativo; 
 Marcar meus primers com fluorescência; 
 Colorir meu gel com prata. 
Como já dito, o AFLP é um marcador DOMINANTE. Logo, quando um alelo A está presente no genótipo, 
uma banda aparece. Quando há apenas alelos a (recessivo), a banda não aparece. 
 
PROCESSO AFLP: Extração do DNA genômico  digestão com duas enzimas de restrição, ao mesmo 
tempo  geração de extremidades coesivas  anelamento de adaptadores  primers com basesseletivas  pré-amplificação seleção dos fragmentos  amplificação seletiva (amplificação final dos 
fragmentos selecionados). 
Como o AFLP é um marcador dominante: 
 Fragmentos de tamanho grande (raro/raro) marcados com radiosporos não são adequadamente 
separados e visualizados na eletroforese. 
 Fragmentos de tamanho médio (raro/frequente) marcados com radiosporos são adequadamente 
separados e visualizados na eletroforese. 
 Fragmentos menores (frequente/frequente) não são visualizados na eletroforese pois somente o primer 
para o adaptador do terminal de corte raro é marcado com radiosporo. 
 
VANTAGENS AFLP 
- Grande quantidade de fragmentos são gerados; 
- Esse marcador possui grande poder de detecção de variabilidade genética; 
- Não requer conhecimento prévio da sequência de DNA; 
 
DESVANTAGENS AFLP 
- Marcadores dominantes; 
- Varias etapas são necessárias para a obtenção dos marcadores; 
- Marcadores dominantes, baixo conteúdo de informação genética por loco, por apenas um alelo ser 
detectado. 
 
 
c) SNPs 
O polimorfismo de nucleotídeo único, ou SNPs, são as variações mais frequentes no genoma de qualquer 
organismo (humanos, plantas e animais), e que se mantém nas gerações futuras. Consiste na diferença 
de um ÚNICO nucleotídeo em determinada posição no genoma. É importante lembrar que a técnica de 
análise de SNPs se dá a partir da COMPARAÇÃO entre genomas de diferentes indivíduos (de mesma 
espécie ou não). 
 Quando uma alteração de base no genoma é considerada uma mutação, e quando é considerado um 
SNP? 
> 1% de alteração de base: SNPs 
<1% de alteração de base: mutação 
Essa alteração de única base no genoma pode ocorrer por: 
- TRANSIÇÃO: quando uma pirimidina é substituída por outra pirimidina (T por C, ou C por T), ou quando 
uma purina é substituída por outra purina (A por G, ou G por A). 
- TRANSVERSÃO: quando uma pirimidina é substituída por uma purina, ou vice-versa; 
- DELEÇÃO: quando uma base é deletada, alterando o códon de leitura na tradução; 
- INSERÇÃO: quando uma base é inserida, alterando o códon de leitura na tradução. 
 Os SNPs tem relação com alguns tipos de câncer; isso significa que apresentar um SNP faz com 
que a pessoa tenha mais chances de desenvolver a doença. 
 
Além disso: 
 Em regiões não decodificadoras: ocorrência de SNP a cada 31 pb; e 1 deleção a cada 85 pb. 
 Em regiões decodificadoras: ocorrência de SNP a cada 124 pb. 
Um SNP pode ser classificado em: 
 SNP sinônimo: quando a troca de bases não altera o aminoácido produzido na tradução; 
 SNP não sinônimo 
 CONSERVATIVO: quando ocorre a troca de base, alterando o tipo de aminoácido produzido, mas 
a proteína final produzida continua exercendo suas mesmas funções; 
 NÃO CONSERVATIVO: quando ocorre a troca de base, alterando o tipo de aminoácido 
produzido, e alterando as funções da proteína final produzida. 
Os SNPs são fontes abundantes de variação genética, sendo gerados por substituição de uma única base 
ou pequenos eventos de inserção e deleção. Esse tipo de marcador genético é muito interessante para: 
- Estudos filogenéticos de evolução dentro da espécie; 
- Conservação e caracterização de germoplasma; 
- Mapeamento genético; 
- Diferenciação de alelos do mesmo gene. 
 
4) CONSTRUÇÃO DE MAPAS GENÉTICOS 
Mapa genético nada mais é do que a representação de ordem e distância entre diferentes locos. Para que 
ocorra a construção de mapas genéticos, basta avaliar uma população segregante (de F2, por exemplo) 
por meio de locos marcadores. 
Vamos a um exercício. Vamos considerar uma avaliação de 20 diferentes indivíduos, com 3 diferentes 
marcadores, visto que cada marcador está situado em um locus diferente.