Ch04_Enzimas

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Enzimas 
– 	
  O que distingue os enzimas de outros catalisadores? 
Ø  Velocidades das reações muito elevadas 
Ø  Condições de catálise suaves 
Ø  Especificidade para as reações e os substratos que catalisam 
Ø  Possibilidade de serem regulados 
 
Caraterísticas dos enzimas 
- Qual a natureza química dos enzimas? 
 
A grande maioria dos enzimas são proteínas. No entanto, foram 
descobertas moléculas de RNA com propriedades catalíticas 
(ribozimas). 
Apoenzima (inativo) + Componente adicional Holoenzima (ativo) 
 
Componente adicional = Cofator, Coenzima ou Grupo Prostético 
Alguns enzimas necessitam para a sua atividade de um componente 
adicional. Estes podem ser : 
●  Cofatores - Iões metálicos que participam na catálise ou conferem 
uma particularidade estrutural ao enzima ( Ex: Fe2+, Mg2+, Zn2+) 
● Coenzimas - Moléculas orgânicas que são essenciais para a catálise 
e estão temporariamente associados com o enzima, funcionando 
como co-substratos (Ex: NADH, FADH) 
● Grupos prostéticos -Moléculas orgânicas fortemente associadas aos 
enzimas (por vezes covalentemente) e indispensáveis à catálise 
(Ex. Heme) 
Atividade Enzimática 
Alguns Cofatores e Coenzimas 
Classificação dos Enzimas 
Constante de velocidade (k) mede a rapidez com que a 
reação ocorre 
A + B C 
k1 
 k-1 
Velocidade	
  (v,	
  y)	
  =	
  (constante	
  de	
  velocidade)	
  (concentração	
  
dos	
  reagentes) 	
   	
   	
  	
  
v=	
  k1	
  [A]	
  	
  	
  
Reação	
  de	
  1ª	
  ordem	
  
	
  
v=	
  k-­‐1[B][C]	
  
 
Reação de 2ª ordem 
v= k	
  
Reação de ordem Zero	
  
	
  (a	
  velocidade	
  é	
  independente	
  da	
  concentração	
  dos	
  reagentes)	
  
Constantes de velocidades e 
Ordens de reação 
E + S ES E + P 
k1 
k-1 
k2 
k-2 
E S + E S E + P 
Velocidades iniciais 
[S] = 1 mM 
D[P]/Dt	
  =	
  Vo1	
  mM	
  
[P] 
time 
Manter [E] constante 
[E]<<<<<[S] 
Velocidades iniciais 
[S] = 1 mM 
[S] = 5 mM 
[S] = 10 mM Δ[P]/ΔT = Vo10 mM 
Δ[P]/ΔT = Vo5 mM 
Δ[P]/ΔT = Vo1 mM 
[P] 
time 
Gráfico Vo vs [S] 
Vo 1 mM 
Vo 5 mM 
Vo 10 mM 
•  Equação de Michaelis-Menton 
•  Descreve um gráfico com uma curva 
hiperbólica retangular 
•  Vo = Vmax [S] 
 Km + [S] 
 
 
Km = [S] que corresponde a 
 ½ Vmax 
(unidades mol/L=M) 
(1/2 enzima ligada ao S) 
Vmax = velocidade em que toda a 
enzima está ligada ao substrato 
(enzima está saturada com S) 
1)  Medições para determinar a velocidade inicial (vo). Na 
vo há muito pouco produto formado. Portanto, a 
velocidade na qual E + P reagem para formar ES é 
negligenciável e k-2 = 0. Portanto 
 
 
 
Velocidade inicial 
E + S ES E + P 
k1 
k-1 
k2 
E S + E S 
k-2 
E + P 
Dados a partir de uma única 
experiência realizada com um 
único [S]. 
(ponto único em Vo vs. [S]) 
Hipótese do Estado Estacionário 
E + S ES E + P 
k1 
k-1 
k2 
Estado estacionário= [ES] é constante. A velocidade de 
formação de ES é igual à velocidade de decomposição de ES 
E S + E S E + P 
E + S ES
 
k1 
E S + E S 
Velocidade de formação de ES 
velocidade = k1 [E] [S] 
 ES E + P 
k2 
E S E + P 
 ES E + S 
k-1 
E S + E S 
Velocidade de decomposição de ES 
Velocidade = (k2 [ES]) + (k-1[ES]) 
Velocidade = [ES](k2 + k-1) 
Portanto ......... se a velocidade de formação de ES 
for igual à velocidade de decomposição ES 
 
1) k1[E][S] = [ES](k-1+ k2) 
2) (k-1+ k2) / k1 = [E][S] / [ES] 
3) (k-1+ k2) / k1 = Km (constante deMichaelis) 
 
 
O que significa Km? 
1.  Km = [S] a ½ Vmax 
2.  Km é uma combinação de constantes de 
velocidade que descrevem a formação e 
decomposição do complexo ES 
3.  Km é geralmente um pouco maior do que a 
[S] fisiológica 
O que significa Km? 
4.  Km representa a quantidade de substrato 
necessária para ligar ½ da enzima 
disponível (constante de ligação do 
substrato para o enzima) 
5.  Km pode ser utilizado para avaliar a 
especificidade de uma enzima para um 
substrato (se obedece MM) 
6.  Pequeno Km significa forte ligação; elevada 
Km significa ligação fraca 
Glucose Km = 8 X 10-6 
Allose Km = 8 X 10-3 
Mannose Km = 5 X 10-6 
Hexose Kinase 
Glucose + ATP <-> Glucose-6-P + ADP 
O que significa Kcat? 
1.  kcat é a constante de 1º ordem que descreve ES à E+P 
2.  Também conhecido como o turnover # porque descreve o 
número de reações que uma molécula de enzima pode 
catalisar por segundo, sob condições ideais. 
3.  A maioria das enzimas têm valores kcat entre 102 e 103 s-1 
4.  Para reações simples k2 = kcat , para reações em várias 
etapas kcat = passo limitante 
E + S ES E + P 
k1 
k-1 
kcat 
O que significa Kcat? 
E + S ES E + P 
k1 
k-1 
kcat 
O que significa kcat/Km? 
•  Mede o quanto a enzima executa 
quando [S] é baixa 
•  kcat / Km descreve a preferência de 
uma enzima para substratos 
diferentes = constante de 
especificidade 
•  O limite superior para o kcat/Km é o 
limite de difusão - a taxa na qual E e 
S difundem em (108 - 109 m-1 s-1) 
•  Perfeição catalítica quando kcat / Km 
= taxa de difusão 
•  Mais fisiológicos que kcat 
Michaelis-Menton 
•  Vmax	
  
•  Km	
  	
  
•  Kcat	
  
•  Kcat/Km	
  
 E + S ES E + P 
k1 
k-1 
kcat 
•  Vo = Vmax [S] 
 Km + [S] 
 
• Vmax 
• Km 
• kcat 
• kcat/Km 
Como determinar os valores Vmax, Km e kcat? 
•  Pode determinar-se Km e Vmax 
experimentalmente 
 
•  Km pode ser determinada sem ter uma enzima 
absolutamente pura 
 
•  Kcat pode ser determinada se Vmax for conhecida 
e se a concentração absoluta da enzima for 
conhecida (Vmax = kcat[Etotal] 
Lineweaver-Burke Plots 
(double reciprocal plots) 
• Fazer o gráfico 1/[S] vs 1/Vo 
• L-B equação à linha reta 
• XX-interceção = -1/Km 
• YY-interceção = 1/Vmax 
• Mais fácil para extrapolar 
valores com linha reta vs curva 
hiperbólica 
B
B
B
B
B B
B
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Vo
[S]
[S] Vo
0.5 0.075
0.75 0.09
2 0.152
4 0.196
6 0.21
8 0.214
10 0.23
 
V max 
Km 
Km ~ 1.3 mM 
 
Vmax ~ 0.25 
[S] Vo
2.000 13.333
1.333 11.111
0.500 6.579
0.250 5.102
0.167 4.762
0.125 4.673
0.100 4.348
 
B
B
B
BBBB
B0
2
4
6
8
10
12
14
-1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2
Vo
[S]
-1/Km = -0.8 
Km = 1.23 mM 
1/Vmax = 4.0 
Vmax = 0.25 
Cinética das reações 
Multi-substrato 
E + A + B <-> E + P + Q 
•  Reações sequenciais 
a)  ordenada 
b)  acaso 
•  Reações Ping-pong 
•  Notação Cleland 
Reacções enzimáticas com dois substratos 
Mecanismo Sequencial	
  
	
  
Ordenado 
 
Aleatório 
 
Mecanismo de Ping-Pong 
 
Reações Sequenciais 
E EA (EAB) (EPQ) EQ E 
A B P Q 
A B P Q 
 
 
A B 
E 
EA 
EB 
(EAB)(EPQ) 
P Q 
EQ 
EP 
E 
Ordered 
Random 
Reações Ping-Pong 
E (EA)(FP) (F) (FB)(EQ) E 
A B P Q 
• Em reações pingue-pongue, o primeiro produto é 
libertado antes de se ligar o segundo substrato 
• Quando E se liga a A, E altera para F 
• Quando F se liga a B, F muda de volta para E 
Gráficos de Lineweaver-Burke em 
Reações Multi-substrato 
Increasing 
[B] 
Increasing 
[B] 
Sequential Ping-Pong 
Vmax doesn’t change 
Km changes 
Both Vmax & Km change 
1/Vo 
1/[S] 
1/Vo 
1/[S] 
Inibição de Enzimas 
•  Inibidor - substância que se liga a uma enzima e 
interfere com a sua atividade 
•  Pode evitar a formação de complexo ES ou prevenir a 
decomposição de ES a E + P. 
•  Inibidores irreversíveis e reversíveis 
•  Inibidor irreversível liga-se à enzima através de 
ligações covalentes (liga-se irreversivelmente) 
•  Inibidores reversíveis ligam-se através de interações 
não covalentes (desassocia-se a partir da enzima) 
•  Por que é importante? 
Inibidores reversíveis 
E + S <-> ES -> E + P 
E + I <-> EI 
Ki = [E][I]/[EI] 
•  Competitivos 
•  Incompetitivos 
•  Não-competitivos 
Tipos de Inibidores Enzimáticos 
reversíveis 
Inibidorcompetitivo (IC) 
• IC liga-se à enzima livre 
• Compete com o substrato para a ligação à enzima. 
• Aumenta Km sem afetar Vmax 
• Pode reverter-se a inibição aumentando [S] 
Inibidores competitivos assemelham-se ao 
substrato 
NH2C
O
HO NH2S
O
H2N
O
PABA Sulfanilamide 
PABA precursor do ácido fólico em bactérias 
O2C-CH2-CH2-CO2 -------> O2C-CH=CH-CO2 
succinate fumarate 
 
Succinate dehydrogenase 
 
O2C-CH2-CO2 
Malonato 
Inibidor Incompetitivo (II) 
• II liga-se ao complexo ES 
• Impede ES de prosseguir para E + P ou de voltar para E + 
S. 
• Diminui Km e Vmax, mas a relação de Km / Vmax 
permanece a mesma 
• Ocorre com enzimas multi-substrato 
Inibidor não-competitivo (INC) 
• INC pode ligar-se à E livre ou ao complexo ES 
• Diminui Vmax, mas Km permanece a mesma 
• INCs não se ligam ao sítio de ligação de S, portanto, não 
afetam Km 
• Altera conformação do enzima que efetua a catálise, e não a 
ligação do substrato 
Parâmetros cinéticos para diferentes tipos de inibição 
Competitiva Incompetitiva Mista 
Estrutura de alguns inibidores 
Inibidores da transcriptase reversa do HIV 
Inibidores da protease do HIV 
Inibidores Irreversíveis 
H3C O P
O
S C
C
H
O
O CH2CH3
C O CH2CH3
O
S
CH3
CH2
H C
CH3
O
CH3
P
F
O
O C
CH3
H
CH3
Diisopropyl fluorophosphate 
(nerve gas) 
H3C O P
O
S
S
CH3
NO2
parathion 
malathion 
• Organofosforados 
• Inibem a serina hidrolases 
• Os inibidores da acetilcolinesterase 
Como atuam os enzimas? 
 ln k = ln A - Ea/RT 
Os enzimas estabilizam o estado de transição 
Mecanismos catalíticos 
– 	
  A estabilização do estado de transição pode ser efetuada por 
diversos modos, que podem coexistir no mesmo processo 
catalítico. Os principais são: 
●  Catálise ácido-base 
●  Catálise covalente 
●  Catálise de ião metálico 
●  Catálise eletrostática 
●  Efeito de proximidade e orientação 
●  Ligação preferencial ao complexo do estado de transição 
Catálise ácido-base 
Dependência da velocidade 
 enzimática com o pH 
FIGURE 6–17 The pH-activity profiles of two enzymes. These curves are constructed from measurements of 
initial velocities when the reaction is carried out in buffers of different pH. Because pH is a logarithmic scale 
reflecting tenfold changes in [H], the changes in V0 are also plotted on a logarithmic scale. The pH optimum for 
the activity of an enzyme is generally close to the pH of the environment in which the enzyme is normally found. 
(a) Pepsin, which hydrolyzes certain peptide bonds of proteins during digestion in the stomach, has a pH 
optimum of about 1.6. The pH of gastric juice is between 1 and 2. (b) Glucose 6-phosphatase of hepatocytes 
(liver cells), with a pH optimum of about 7.8, is responsible for releasing glucose into the blood. The normal pH 
of the cytosol of hepatocytes is about 7.2. 
Mecanismo catalítico da RNase A 
Catálise covalente 
Nucleófilos e eletrófilos importantes 
 a nível biológico 
Catálise de ião metálico 
	
  
– Os iões metálicos podem participar no processo catalítico de três maneiras 
diferentes: 
 
l  Por ligação ao substrato de modo a o orientarem adequadamente para 
a reação; 
l  Por mediação de reações de oxidação-redução através de mudanças 
reversíveis no estado de oxidação do metal; 
l  Por estabilização eletrostática de cargas negativas. 
Catálise de ião metálico 
 
– Os iões metálicos também tornam as moléculas de água ligadas mais acidícas 
– Um exemplo paradigmático é a anidrase carbónica 
 
Efeito de proximidade e orientação 
A ligação dos enzimas aos substratos facilita a catálise de três formas: 
l  Aproximam os substratos e estes dos seus grupos catalíticos. v > 5x 
l  Orientam os substratos apropriadamente. v > 100x 
l  Imobilizam os substratos diminuindo o seu movimento translacional e 
rotacional. v > 107x 
As Proteases de Serina 
– 	
  Conjunto de enzimas proteolíticos que tem um mecanismo catalítico comum 
envolvendo um resíduo de Serina; 
– Incluem enzimas digestivas de procariotas e eucariotas e outras mais 
especializadas na coagulação sanguínea, inflamação e outros processos; 
– As melhor estudadas são a Quimiotripsina, a Tripsina e a Elastase; 
– A estrutura de raios X destas três enzimas é muito semelhante e partilham 
cerca de 40% de homologia a nível da sequência de aminoácidos; 
– O centro ativo de todas estas enzimas contém a denominada tríade 
catalítica constituída por resíduos de Serina, Histidina e Ácido Aspártico. 
Estrutura de Raios X de algumas Proteases de Serina 
Quimiotripsina	
   Tripsina	
  
Elastase	
  
Centro	
  acMvo	
  da	
  Quimiotripsina	
  
FIGURE 6–18 Structure 
of chymotrypsin. 
Mecanismo catalítico da Quimiotripsina 
Estabilização do estado de transição nas 
proteases de serina 
FIGURE 6–22 Induced fit in hexokinase. 
(a) Hexokinase has a U-shaped structure 
(PDB ID 2YHX). (b) The ends pinch toward 
each other in a conformational change 
induced by binding of D-glucose (red) 
(derived from PDB ID 1HKG and PDB ID 
1GLK).