Eletroforese em Gel de Agarose

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Eletroforese em Gel de Agarose 
A eletroforese em gel de agarose é usada como método analítico e preparativo, pois, 
uma vez resolvidas, isto é, separadas as moléculas de DNA, um fragmento de tamanho 
específico pode ser excisado do gel e purificado para, posteriormente ser usado em 
uma gama de procedimentos utilizando técnicas de manipulação genética. 
 
Os géis de agarose comumente preparados na rotina de laboratórios são indicados 
para separar fragmentos de DNA que variam entre poucas centenas de pares de bases 
até cerca de 40-50 kb. Para fragmentos com tamanhos menores, é indicada a 
eletroforese em gel de poliacrilamida ou a utilização de agaroses especiais, 
quimicamente modificadas. 
 
A agarose é um polímero linear extraído de algas marinhas, e o gel é formado por uma 
complexa rede desse polímero. O polímero é fundido na presença da solução tampão 
adequada até que se obtenha uma preparação transparente e homogênea. 
 
Com temperatura próxima de 60ºC, a solução é transferida para um molde utilizado 
para o preparo do gel. Após a gelificação, o diâmetro dos poros da matriz formada é 
diretamente proporcional à concentração do polímero utilizada. 
 
Em razão da presença de grupamentos fosfato, a molécula de DNA possui carga 
negativa em pH neutro ou alcalino. Consequentemente, quando aplicada a um gel e 
submetida a um campo elétrico, essa macromolécula migrará em direção ao anodo, ou 
seja, pólo positivo. 
 
A velocidade da migração bem como o poder de resolução de um gel dependem do 
tamanho e da forma da molécula. Para a visualização e a interpretação dos resultados, 
são necessárias a incorporação de um agente intercalante de DNA (brometo de etídeo) 
e a utilização de marcadores de massa molecular apropriados, de maneira que migrem 
em paralelo às amostras de interesse. 
 
Assim, pode-se definir um parâmetro padrão envolvendo as seguintes etapas: 
 
1) Preparar uma solução de agarose (a concentração dependerá do tamanho da 
molécula de DNA a ser visualizada) em tampão TAE ou TBE (diluído). Aquecer no 
microondas até a total dissolução da agarose. Esperar a solução esfriar; 
 
2) Esperar esfriar e adicionar Brometo de etídeo (10 mg/mL); 
 
3) Colocar a solução, no suporte (“cama”) de eletroforese; 
 
4) Colocar o pente de modo que não forme bolhas. Aguardar o gel endurecer e retirar 
o pente; 
 
5) Colocar o conjunto na cuba de eletroforese, cobrindo com o tampão; 
 
6) Colocar nos poços o DNA (diluído) e misturado com solução azul de bromofenol. 
 
7) Encaixar a tampa da cuba e os eletrodos de modo que o DNA migre do pólo 
negativo para o positivo; 
 
8) Ajustar a voltagem e o tempo; 
 
9) Visualizar as bandas obtidas com auxílio de luz ultravioleta. 
 
Fatores que Afetam a Migração do DNA no Gel 
 
• Tamanho da molécula de DNA e concentração do gel – As moléculas maiores migram 
mais lentamente em razão de um maior efeito friccional de arraste e porque as 
mesmas promovem menor aquecimento em seu trajeto de migração através dos poros 
do gel. O tamanho da molécula de DNA, dado em número de pares de bases (pb), é 
diretamente proporcional à massa molecular que é dada em Daltons (Da). A densidade 
do gel determina o intervalo de tamanho das moléculas que podem ser 
adequadamente separadas. 
 
Existem diferentes tipos de marcadores com massa molecular variando desde poucos 
pares de bases até dezenas de kb. O tamanho de uma molécula de DNA pode ser 
determinado com precisão razoável se um marcador de massa molecular adequado 
migra em paralelo com as moléculas que estão sendo fracionadas. 
 
Quando a concentração desses marcadores é conhecida, pode-se fazer uma estimativa 
visual de concentrações desconhecidas das amostras por comparação direta da 
intensidade das bandas. Quantificações mais acuradas devem ser feitas por 
densitometria. No entanto, onde houver necessidade de determinar concentrações 
desconhecidas com alta precisão, a espectrofotometria é a metodologia mais indicada. 
 
• Conformação do DNA – O DNA apresenta três formas distintas que migram em 
velocidades diferentes no gel de agarose. As formas são: circular superenovelada 
(forma 1), circular relaxada (forma 2) e linear (forma 3). A motilidade das diferentes 
formas pode variar de acordo com o tamanho da molécula de DNA e também depende 
do diâmetro dos poros do gel, voltagem e força iônica do tampão de corrida. A forma 1 
migra mais rapidamente que a forma 3, e a forma 2 é a mais lenta. A forma 1 é a mais 
rápida, em razão do seu menor diâmetro. 
 
• Agentes intercalantes – O brometo de etídeo é um análogo de base que se intercala 
na molécula de DNA e emite fluorescência quando exposto à luz ultravioleta (UV). As 
moléculas de DNA fracionadas em géis de agarose contendo brometo de etídeo são 
diretamente visualizadas na presença da luz UV, e o limite de detecção é cerca de 10 
ng/banda de ácido nucléico. 
 
A intensidade de fluorescência é diretamente proporcional à massa molecular do 
fragmento de ácido nucléico. Apesar de ser bastante ampla a faixa de UV, geralmente, 
o comprimento de onda mais utilizado para detecção de ácidos nucléicos é de 300-360 
nm (nanômetros). O brometo de etídeo diminui a motilidade do DNA, e esse 
retardamento na corrida se deve ao aumento no tamanho e na rigidez das formas 
linear e circular relaxada. 
 
O efeito intercalante retarda a corrida da forma linear cerca de 15% e é mais 
pronunciado no DNA relaxado, pois nesse tipo de conformação a presença de brometo 
de etídeo induz à formação de superenovelamento positivo, que acarreta aumento na 
motilidade eletroforética. 
• Voltagem – As moléculas de DNA migram através do gel com velocidade diretamente 
proporcional à voltagem aplicada, essa correlação acontece até o limite de 5V/cm, que 
é a distância entre os eletrodos. A linearidade é perdida quando se aplica uma 
voltagem maior, então as moléculas maiores migram mais rapidamente que as 
menores. 
 
• Tampão de corrida - A composição e a força iônica do tampão de corrida influenciam 
na migração e na qualidade de resultado da eletroforese. Os tampões mais usados são 
o TAE (Tris-Acetato-EDTA) e TBE (Tris-Borato-EDTA). O TBE tem um custo mais alto 
que o TAE, porém apresenta maior capacidade tamponante, enquanto o TAE promove 
uma corrida cerca de 10% mais rápida quando o DNA apresenta-se sob forma linear. 
Entretanto, a capacidade de resolução de DNA de fita dupla é semelhante nos dois 
tampões. A baixa força iônica promove uma migração muito lenta, e a alta força iônica 
provoca alta condutividade elétrica, gerando calor e podendo desnaturar o DNA. 
 
Cuidados Importantes na Utilização da Técnica 
 
Essa técnica exige o uso de materiais perigosos e mutagênicos (luz UV e brometo de 
etídeo), portanto é necessário cuidados importantes na sua manipulação e 
desenvolvimento, como: 
 
- usar luvas para manipular géis ou soluções contendo brometo de etídeo, que é um 
potente agente mutagênico; 
 
- usar óculos e outros equipamentos de proteção ao trabalhar com a luz UV, já que a 
mesma é mutagênica; 
 
- a agarose fundida pode eventualmente borbulhar, por isso não se deve agitar o 
erlenmeyer logo após a fusão, para evitar queimaduras. 
 
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