Resumo de Cromatografia em Camada Delgada

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Resumo das práticas de farmacognosia 
 
• Cromatografia em camada delgada: 
Tem como base e objetivo a pesquisa de marcadores ativos e analíticos em extratos de Amburana 
cearensis e de anetol em extratos de Foeniculum vulgare. 
 
• Materiais utilizados: 
Acetato de etila PA Anetol (padrão de trabalho) 
Béquer Cumarina (padrão de trabalho) 
Borrifador Extratos de cumaru (amostra) 
Capilares OEFV- óleo essencial (amostra) 
Cuba Papel de filtro 
Diclorometano PA Pinça 
Funil Placa de alumínio com S 
Hexano PA Sílica gel 60. Tamanho 20x20 cm 
Hidróxido de potássio PA Proveta 
Iodo P Régua 
KOH 5% ETOH- pesquisa 
Luz UV 
 
• Procedimento experimental: análise por CCD referente aos extratos de Amburana cearensis 
 
Neste procedimento foi escolhida como fase 
estacionária a sílica gel em forma de placa sendo de 
fase normal e por isso, possui caráter polar em 
decorrência das hidroxilas livres que conferem tal 
caráter químico. Já a fase móvel utilizada é composta 
por dois solventes orgânicos, isto porque é muito 
comum a utilização da combinação de solventes 
orgânicos para obter sucesso no procedimento. Além 
das fases citadas acima, uma cuba é utilizada e dentro 
da cuba está a fase móvel, bem como também são 
utilizadas placas de sílica que compõem a 
cromatoplaca que contém a fase estacionária. Em sequência a amostra é aplicada na cromatoplaca e é 
realizada a eluição pela fase móvel, nesta parte o sistema se localiza na cuba cromatográfica. 
Posteriormente tem-se a revelação para que seja possível identificar a separação das espécies de 
interesse das amostras. 
 
Mais especificamente sobre o procedimento realizado foi utilizada uma fina placa de alumínio onde a 
fase estacionária é depositada, sendo esta caracterizada como sílica de fase normal e polar. 
Ao lado tem-se uma exemplificação da placa de alumínio 
utilizada como placa cromatográfica onde a fase estacionária é 
depositada. O aspecto geral é semelhante ao de folhas e estas são 
uniformes e é possível realizar recortes de tamanhos desejados 
para a análise, dependendo da quantidade de amostras a serem 
identificadas. Como vantagens é possível destacar a sua 
padronização, justificada pela distribuição uniforme realizada 
sobre a placa. 
 
Quanto ao solvente utilizado para a determinação e presença de Cumarina nos extratos de Cumaru 
analisados, foram escolhidos para o ensaio a fase móvel composta por hexano e acetato de etila nas 
proporções 65:35 respectivamente. Vale salientar que ambos os solventes que constituem a fase móvel 
são depositados na cuba cromatográfica e constituem a fase de preparação dela. 
Em seguida se realiza a preparação da cromatoplaca e a aplicação da amostra e padrão, sendo este 
padrão a Cumarina, caracterizada por seu grau de pureza maior que 99%, proveniente da indústria 
Sigma-Aldrich dos Estados Unidos e que possui como CAS (número criado pela sociedade americana 
de química) 91-64-5, e que funciona como nomenclatura de uma substância que funciona como código 
mundial. 
 
Na figura ao lado é possível observar na porção superior o padrão utilizado 
para determinar a presença de Cumarina nos extratos de Cumaru, que tem 
como pureza 99% e que serve de objetivo de comparação, para que a espécie 
possa ser identificada na amostra. 
Já na porção inferior, tem-se o extrato de Cumaru a ser analisado visando a 
identificação e segregação da espécie de interesse, definida como Cumarina. 
Ambos são aplicados na placa cromatográfica e constituem a seguinte de 
preparação da suba cromatográfica, após a aplicação destes, a placa 
cromatográfica é depositada na cuba e a amostra, tal como o padrão, elui em 
torno do comprimento da placa que contém a fase estacionária. 
 
Para a aplicação tem-se o auxílio de um capilar que é mergulhado sobre as soluções padrão e amostra 
e em seguida, em pontos de mesma altura, é realizado o toque na placa cromatográfica para que 
obtenhamos uma padronização da eluição de ambos, cada toque realizado é chamado de spots. São 
feitos vários toques na placa cromatográfica para que o capilar que contém a solução libere o conteúdo 
que este possui e em seguida ocorre a dispersão dentro da placa de sílica visando o não acúmulo de 
líquido. É importante frisar que quando se têm uma solução pura, o número de toques (spots) realizados 
na placa cromatográfica contendo a fase estacionária é consideravelmente menor do que o número de 
spots realizados com a amostra advinda de extratos. No total foram realizados 10 spots referentes ao 
extrato da casca do caule do Cumaru e spots da solução padrão de Cumarina. 
Na figura ao lado, se observa a fase de eluição da fase móvel contida 
na cuba cromatográfica composta pelos solventes envolvidos na 
preparação de tal recipiente pela fase estacionária, defina como a placa 
cromatográfica que foi depositada na cuba para que o procedimento 
experimental ocorresse. Como característica podemos salientar que a 
placa contida na cuba se encontra em posição diagonal e possui como 
aspecto importante que quando a placa for depositada, o ponto de 
aplicação do extrato e padrão deve ficar um pouco acima do nível da 
fase móvel, para que somente depois que a placa estiver acomodada o 
local onde a amostra proveniente do extrato e o padrão de Cumarina 
utilizado sejam atingidos e a eluição inicie. A partir desse momento a 
cuba não pode ser deslocada e o sistema não deve sofrer quaisquer 
movimentações para que não ocorram interferências. 
O processo de eluição não é de fato rápido, contudo a passagem do solvente através da fase estacionária 
ocorre em tempo hábil, até que a fase móvel atinja uma marcação imaginária na fase estacionária, 
sendo esta um pouco antes do final da placa cromatográfica, para que nenhum dado seja perdido e haja 
uma dificuldade na visualização das bandas separadas durante a eluição. 
 
Na imagem acima são representados os materiais e reagentes utilizados na revelação do cromatograma 
com KOH (hidróxido de potássio) etanólico, possuindo como objetivo de revelar a segregação da 
Cumarina presente na amostra proveniente do extrato do Cumaru e compará-la com o padrão utilizado. 
O KOH etanólico é utilizado por sua capacidade de abrir o anel da Cumarina, transformando no ácido 
cis-hidróxicinâmico e este quando exposto à luz ultravioleta sobre uma reação de isomerização, se 
transformando na forma trans-hidróxicinâmico, que possui como característica a fluorescência. 
A aplicação do KOH etanólico acontece por jatos sutis sobre a placa cromatográfica de maneira suave, 
em seguida a placa é direcionada para a luz ultravioleta e a leitura dos resultados já pode ser realizada. 
 
Ao lado podemos visualizar a placa cromatográfica 
após a exposição à luz ultravioleta e a identificação das 
espécies contidas na fase estacionária pós eluição da 
fase móvel na cuba cromatográfica. A banda 
localizada à direita denominada como “P” consiste no 
padrão utilizado para Cumarina, já a banda 
identificada como “I” consiste na amostra referente ao 
extrato da casca do caule do Cumaru obtido por 
infusão e de forma análoga, a banda denominada “D” 
faz alusão ao extrato proveniente da casca do caule do 
Cumaru pelo método de decocção. 
Após a visualização da presença de Cumarina mesmo 
que fracamente obtida e demonstrada na placa ao lado, 
se fazem necessários cálculos para determinação de 
valores numérico através do valor de referência para o 
padrão e para substâncias identificadas na amostra. 
 
Vale salientar a importância do emprego do padrão de Cumarina visando a determinação da presença 
e as bandas separadas na análise, e assim, utilizar das informações obtidas para calcular o valor de 
referências de ambos em associação ao entendimento à cerca dos componentes e a distância de eluição 
das espécies segregadas. 
Para realizar ocálculo dos valores de referência das 
amostras obtidas por infusão e decocção, bem como o do 
padrão utilizado uma relação entre a distância percorrida 
pela solução padrão desde o ponto de aplicação até o ponto 
de detecção e relaciona esse valor com a distância 
percorrida pela fase móvel. Esse cálculo é realizado para 
todas as amostras aplicadas na placa cromatográfica, 
consistindo na relação entre o ponto de aplicação da amostra 
e a terminação da eluição da fase móvel (X) com o ponto de 
aplicação das amostras e a marcação referente á 
identificação das amostras comparadas com o padrão 
utilizado (Y). 
O esperado é que ambos os extratos aquosos obtidos a partir da infusão e decocção possuam os mesmos 
valores de RF (valores de referência) do padrão de Cumarina utilizado no ensaio, somente assim é 
possível determinar a presença de tal marcador ativo. 
Como resultado nos cálculos para os métodos de infusão e decocção, que estão visualmente idênticos 
na altura de identificação das espécies analisadas, ambos possuem o mesmo valor de referência, 
determinado da seguinte maneira: 
RF = Y → RF = 6,5 cm → RF = 0,78 
 X 8,3 cm 
De maneira análoga, o valor de referência do padrão utilizado também foi identificado como 0,78 
tendo em vista a localização de ambas as amostras, determinando assim a presença de Cumarina nas 
amostras definidas como extratos aquosos provenientes dos métodos de infusão e decocção da casca 
do caule do Cumaru. 
 
Já em relação aos métodos denominados turbólise, maceração e percolação e sohxlet, o mesmo 
procedimento para análise por cromatografia em camada delgada foi realizado e como placa 
cromatográfica revelada com o auxílio de mesmos reagentes e de luz ultravioleta, obteve-se: 
 
A figura ao lado apresenta a 
placa cromatográfica com 
suas respectivas amostras 
após a eluição e revelação, 
entre elas estão o padrão 
utilizado para determinação 
de Cumarina “P”, o extrato 
aquoso obtido por turbólise 
“T”, o extrato obtido a partir 
da maceração e percolação 
“MP” e por último na porção 
direita o extrato obtido a 
partir do método de Sohxlet 
intitulado “S”. 
 
A partir das informações visuais detalhadas acima, é possível estabelecer as relações entre ponto de 
inserção da amostra e ponto onde a eluição foi interrompida (X), bem como o ponto de depósito da 
amostra e porção limitante da amostra arrastada após a eluição pela fase móvel onde o marcador foi 
identificado (Y), onde as comparações entre as amostras provenientes dos extratos realizados a partir 
dos métodos citados com o padrão utilizado, a partir desta comparação é determinada a presença ou 
ausência de marcadores como a Cumarina. 
A partir do ensaio acima, se faz real afirmar que a banda identificada como proveniente do método 
Sohxlet se caracteriza como o extrato mais semelhante ao padrão utilizado e portanto, pode ser definido 
como o melhor método para a extração da Cumarina em relação aos demais métodos vistos. Vale 
ressaltar que os demais extratos também possuem Cumarina. A análise realizada acima é inteiramente 
qualitativa. 
Os valores de referência foram calculados da seguinte forma: 
 
RF = Y → RF = 1,5 cm → RF = 0,23 
 X 6,5 cm 
 
Todos os extratos e o padrão utilizado obtiveram mesmo número de valor de referência. 
 
 
 
 
 
• Procedimento experimental: análise por CCD referente ao óleo essencial de Foeniculum 
vulgare 
 
Como as condições experimentais determinadas na cromatografia em camada delgada são basicamente 
as mesmas, algumas mudanças empregadas são ligadas apenas aos tipos de solventes que constituem 
a fase móvel que por sua vez são o Hexano associado ao Diclorometano em proporções equivalentes 
a 20:80 respectivamente, e o revelador que também é alterado visando a eficácia do ensaio e uma 
melhor visualização das bandas, que desta vez é o Iodo. O padrão utilizado foi definido como o anetol 
caracterizado como 99% de pureza e adquirido a partir da indústria Sigma-Aldrich dos Estados unidos, 
com número de identificação molecular equivalente a 41180-23-8. Além disto, a amostra utilizada é 
composta pelo Óleo essencial de Foeniculum vulgare. 
 
Apesar das mudanças descritas acima, a fase estacionária continua sendo a 
sílica de fase normal e, portanto, possuindo como principal característica a 
polaridade. Um pouco mais abaixo é apresentada a molécula conhecida 
como o Anetol, que neste ensaio é responsável pelo padrão utilizado na 
busca de tal marcador ativo e que influencia diretamente na qualidade dos 
extratos óbitos, no caso, o óleo essencial do funcho. 
 
 
Todo o procedimento de preparação da cuba cromatográfica e da placa cromatográfica que constituem 
respectivamente o recipiente que contém a fase móvel e a placa que contém a fase estacionária, é 
semelhante ao descrito no ensaio acima, com as divergências me relação aos solventes que a compõem 
e a amostra. Abaixo tem-se a figura que represente o cromatograma obtido a partir do ensaio. 
Ao lado é possível perceber a 
presença de duas bandas, 
sendo a localizada a direita 
definida como o padrão 
utilizado “P” e à esquerda tem-
se a amostra composta pelo 
óleo essencial analisado, além 
disso tem-se as marcações de 
depósito das amostras, término 
da eluição e identificação das 
amostras. 
O ponto denominado como final de eluição “X” se relaciona diretamente com o ponto de identificação 
das amostras, onde o arraste das mesmas tem sua parada, definido como ponto “Y”. A relação entre 
ambos define o valor de referência, calculado a seguir. 
RF = Y → RF = 3,3 cm → RF = 0,69 
 X 4,8 cm 
 
Os valores de RF da amostra de óleo essencial do funcho foram identificados e caracterizados como 
idênticos aos do padrão utilizado, determinando assim a presença de anetol na amostra. 
 
Método extrativo / Espécie vegetal RF padrão / RF da amostra 
Infusão/ A. cearensis 0,78/0,78 
Decocção/ A. cearensis 0,78/0,78 
Maceração e percolação/ A. cearensis 0,2/0,2 
Turbólise/ A. cearensis 0,2/0,2 
Sohxlet/ A. cearensis 0,2/0,2 
Hidrodestilação/ F. vulgare 0,7/0,7 
 
É possível verificar que o padrão utilizado de Cumarina se fez idêntico em relação a todos os ensaios 
de comparação com os métodos extrativos, nos fazendo compreender que em todos os métodos 
extrativos foi possível realizar a extração de Cumarina. O mesmo ocorreu no ensaio referente ao óleo 
essencial de Foeniculum vulgare, nos levando ao mesmo entendimento.