Biotec_Vacinas de DNA e proteína recombinante

Prévia do material em texto

NP2 Biotec 
1 - Noções básicas da utilização da Bioinformática: 
- Ferramentas de busca em banco de dados (NCBI) de genes e proteínas: BLAST, BLASTx, BLASTn, entre 
outros); 
2 – Bioinformática: 
- Familiarização com bancos de dados genéticos e moleculares, identificação; 
- Alinhamento de sequências de DNA e proteínas (Clustal); 
- Análise de sequência desconhecida; 
3 - DNA na identificação Humana: 
- Amplificação por microssatélite por PCR; 
- Amplificação do DNA mitocondrial; 
- Polimorfismo DNA usado na justiça (identificação de pessoas, teste de paternidade, sexagem e diagnóstico 
molecular de patologias); 
4 - Terapia gênica 
5 - Vacinas de DNA e de proteína recombinante: 
- Vacinas de DNA ou vacinas de 3a geração: conceitos, aplicabilidade, comparação com vacinas de 1a geração 
(vírus mortos/atenuados) e de 2a geração (fragmentos virais); 
- Princípios bioéticos da terapia gênica e vacinas de DNA; 
6 - Clonagem de organismos x clonagem terapêutica: 
- Diferenças e princípios bioéticos; 
- Animais modelo: transgênicos e knockout (diferenças e aplicabilidade); 
- Clonagem animal; 
7 - Plantas transgênicas: 
- Plantas transgênicas: finalidade, metodologia, técnicas de transformação (eletroporação, aceleração de partículas/ 
bombardeamento de DNA, infecção por Agrobacterium), impactos ambientais, econômicos e de saúde, segurança 
alimentar; 
- Transgênicos de 1a geração (benefício agrícola), 2a geração (benefício ao consumidor) e 3a geração (uso 
terapêutico): exemplos 
 
 
5 - Vacinas de DNA e de proteína recombinante 
O estado de imunidade pode ser induzido através do uso de variados tipos de vacinas, baseadas em 
microrganismos: 
1. Atenuados, microrganismos vivos; 
2. Inativados, extratos de microrganismos; 
3. Proteínas recombinantes – 3ª geração 
 
Nas vacinas mais antigas, normalmente o que se inocula no paciente é o próprio patógeno ou agente patogênico 
atenuado, ou morto. Nas vacinas de segunda geração, o material entregue ao paciente são, na maioria das vezes, 
formulações contendo as proteínas do patógeno, que normalmente causam a resposta desejada do sistema 
imunológico. O que pesquisamos aqui são as vacinas de terceira geração, as chamadas vacinas de DNA, nas quais 
se inocula o material genético que codifica essa proteína. 
Vacinas de 3ª geração 
Vacina de DNA é uma preparação contendo uma construção de DNA plasmidial capaz de expressar uma proteína 
imunogênica no interior de células eucarióticas transfectadas, induzindo uma resposta imune. 
Como funcionam as vacinas de DNA? 
Os pesquisadores inserem genes para uma ou mais proteínas do patógeno em pequenos pedaços de DNA circular, 
não infeccioso, chamado plasmídeo. Após a introdução no hospedeiro, as células do hospedeiro irão, sintetizar as 
proteínas do patógeno. As células do sistema-imune, reconhecem a proteína como estranha, o sistema imune 
produz anticorpos e células T específicas para este antígeno. Após a purificação dos plasmídeos contendo o gene do 
antígeno, a molécula de DNA recombinante (DNA + gene de interesse) é introduzida em células humanas - 
processo de vacinação. 
 
 
Algumas vantagens das Vacinas de DNA: 
• Não requer cultivo de agentes infecciosos perigosos; 
• Não há riscos de uma cepa atenuada tornar-se virulenta novamente; 
• Não apresenta riscos para crianças, idosos ou imunocomprometidos; 
• Não é afetada por anticorpos maternos; 
• Pode ser produzida contra microorganismos que são difíceis de serem cultivados ou atenuados; 
• Vacinas contra múltiplos agentes podem ser co-administradas em uma única aplicação; 
• A produção em larga escala é bem mais barata; 
• A manutenção do controle de qualidade é mais fácil; 
• A comercialização não necessita de uma rede de refrigeração, pois são vacinas estáveis à temperatura ambiente. 
 
As principais desvantagens das vacinas de DNA são: dificuldade em reconhecer, selecionar e correlacionar todas as 
partes do DNA do agente que se quer combater; possibilidade da indução de uma doença autoimune; integração do 
DNA no cromossomo do hospedeiro, causando mutações que poderiam levar ao aparecimento de um câncer; e 
indução de tolerância do hospedeiro às substâncias estimuladas pelo DNA. 
Características do Microorganismo hospedeiro para a produção de DNA plasmidial (vacinas de DNA): 
• Crescimento rápido 
• Capacidade de crescimento em meio de cultivo simples e barato. 
• Não nocivo ou patogênico, capaz de receber um DNA exógeno 
• Estável em cultura. 
Os vetores de expressão usados em vacinas de DNA em geral possuem: uma região promotora e acentuadora forte, 
um sinal de poliadenilação. Esses três elementos combinados são essenciais para uma expressão alta e constitutiva 
nas células de mamíferos. 
Os vetores usados rotineiramente para a transferência gênica são os retrovírus, vírus vacina ou adenovírus. 
As vacinas gênicas podem ser administradas: 
• Através da injeção direta de DNA diluído em solução salina, no músculo do animal ou homem, a injeção 
intramuscular. 
• Ou através de biobalística utilizando um gene gun (arma de genes), aparelho que promove a aceleração e a 
introdução de micropartículas de ouro encobertas com o DNA de interesse na derme do animal ou homem 
• Ou ainda, em menor grau, o uso de DNA encapsulado em lipossomos como mecanismo utilizado na imunização 
genética e na terapia gênica 
 
Biossegurança na utilização das vacinas de DNA 
Para ser aprovada a vacina precisa ser: 
- Ser testada em animais de laboratório e se não apresentar reações adversas poderá ir para os passos seguintes. 
- Testes clínicos em seres humanos 
Problemas que podem ocorrer: 
- Inserção do DNA plamidial no genoma do hospedeiro podendo causar mutagênese por inserção ou inativação do 
gene. 
Questionário: 
1 - Explique os passos da técnica de DNA e recombinante? 
Construção do dna recombinante1 com o gene da parede da bactéria ou vírus, introdução do dna recombinante na 
bactéria (transformação), indução da formação da proteína recombinante, purificação da proteína, confecção da 
vacina com a proteína recombinante purificada. 
1 O primeiro passo é isolar um fragmento de DNA, que contém o gene de interesse. Agora isolado, é colocado em um meio com um fragmento de DNA 
bacteriano circular, o plasmídio e as enzimas de restrição. O plasmídio bacteriano possui sua capacidade de inserir um fragmento de DNA externo ao seu 
próprio genoma. As enzimas de restrição vão cortar uma determinada região do plasmídeo, onde será ligado ao fragmento de DNA de interesse. O fragmento 
de DNA isolado irá unir-se com o DNA bacteriano, através das enzimas de ligação, ligases. Nesse momento, é originado o DNA recombinante. 
O próximo passo é introduzir o DNA recombinante em bactérias vivas ou diretamente em meio de cultura com as mesmas. Após a incorporação do DNA 
recombinante, as bactérias serão capazes de produzir um nova proteína, conforme os genes do fragmento de DNA isolados inicialmente. 
2 - Diferencie DNA vacina e Vacina proteína recombinante? 
VDNA: molécula DNa recombinante (não tem parte da bactéria), direto célula humana. 
VPR: Molécula dna recombinante + transforma bactéria+ expressa proteína+ purifica+ introduz proteína vírus, (só 
tem a proteína). 
3 - Questão 125152 
As vacinas são classificadas em três grandes grupos (ou gerações) em razão das estratégias ou dos 
conceitos utilizados na preparação do princípio ativo [...]. Nas vacinas de primeira geração o agente 
patogênico é inativado ou atenuado. Nesse grupo, destacam-se vacinas de prevenção da coqueluche, 
contra varíola, poliomielite, sarampo, rubéola, adenovírus [...]. 
Na segunda geração, a indução de anticorpos é voltada para um único alvo, uma toxina, ou açúcares de 
superfície, que permite ao sistema imune neutralizar o agente infeccioso. Nesse grupo, destacam-se 
vacinas acelulares que empregam toxoides (toxinas purificadas e inativadas por tratamento químico), 
proteínas e polissacarídeospurificados, como as antitetânica, antidiftérica, hepatite B e as vacinas para o 
controle da meningite meningocócica e da pneumonia. [...] 
Na terceira geração, o conceito vacinal surgiu da observação de células em que o DNA injetado 
conseguiu penetrar as membranas citoplasmática e nuclear e utilizar o maquinário enzimático necessário 
à transcrição e tradução, produzindo o antígeno que desencadeará uma série de respostas imunológicas. 
Embora as perspectivas depositadas nas vacinas de DNA tenham sido frustradas pela baixa 
imunogenicidade de diversas vacinas submetidas a testes clínicos, os resultados indicam que essas 
vacinas podem ser instrumentos excelentes para a ativação de respostas imunológicas citotóxicas e, 
consequentemente, controle de patógenos de replicação intracelular como vírus, algumas bactérias e 
certos tipos de câncer. 
DINIZ, M.O. & FERREIRA, L.C.S. Biotecnologia aplicada ao desenvolvimento de vacinas. Estudos 
Avançados, v. 24, n. 70, 2010 (adaptado). 
Dadas as afirmativas sobre a tecnologia do DNA recombinante na produção de vacinas, 
I. As estratégias de clonagem e de introdução de mutações em genes específicos têm permitido a 
produção de vírus e bactérias inativos de forma mais precisa e segura do que os métodos convencionais 
das vacinas de primeira geração. 
II. O aprimoramento das técnicas de produção de proteínas recombinantes, através de sistemas de 
expressão heterólogos, permite que bactérias, leveduras, células de mamíferos e insetos sejam utilizados 
para a produção de antígenos. 
III. A tecnologia do DNA recombinante na produção de vacinas de DNA tem representado uma forma 
alternativa de desenvolver imunoterapias – vacinas com propriedades terapêuticas. 
verifica-se que está(ão) correta(s) 
 a)I, II e III. (CORRETA) 
 b)I e III, apenas. 
 c)I e II, apenas. 
 d)III, apenas. 
 e)II, apenas. 
 
 
 
	3 - Questão 125152