vivi aula 10

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Vivi aula 10 
· Enzima de restrição 
· São enzimas que cortam a molécula de DNA através do reconhecimento de sequências específicas 
· São muito específicas e funcionam como “tesoura molecular” 
· Funcionam nas bactérias como parte de um mecanismo de proteção ao ataque de um bacteriófago 
· O uso de enzimas de restrição permite a obtenção dos fragmentos de DNA in vitro, através da catálise da destruição das ligações fosfodiestes 
· Q exploração da sua atividade permitiu um avanço na engenharia genética 
· Sítio ativo é geralmente uma palíndrome (mesma sequência de nucleotídeos com polaridade invertida) 
· Existem três tipos: I, II e III
· Cortes com extremidades abruptas ou coesivas 
· Abrupta – dois fragmentos de mesmo tamanho 
· Coesivo – dois fragmentos de tamanho diferente 
· Os fragmentos podem ser separados por eletroforese 
· São usadas para criar moléculas recombinantes, a complementariedade entre os finais são gerados pela enzima de restrição 
Izoesquizômeros
· Diferentes enzimas de restrição que possuem a mesma sequência de reconhecimento 
· Diferem nas condições ótimas de reação, na estabilidade 
· Fatores que influenciam a atividade da enzima de restrição 
· Composição do tampão (diferem na força iônica, cátion principal) 
· Temperatura de incubação 
· Eletroforese 
· É a separação de moléculas com base na relação entre a carga e a massa das mesmas 
· As moléculas de DNA, assim como proteínas, são portadoras de cargas elétricas negativas, então quando colocada em campo elétrico, o DNA migra em direção ao polo positivo 
· Se a eletroforese for realizada em gel, o tamanho da molécula de DNA é um fator considerável 
· Quanto menor a molécula de DNA (peso molecular), mais rapidamente ela pode migrar pelo gel, logo as mais pesadas demoram mais para migrar 
· Reação em cadeia da polimerase (PCR) 
· É uma técnica que permite amplificar (replicar) um segmento de DNA específico em um tubo de ensaio 
· A PCR propicia um aumento significativo na concentração de genes específicos e de interesse 
· Isso pode ser feito utilizando primers específicos para localizar e hibridizado com o gene de interesse 
· Para fazer uma PCR nós precisamos de: 
· Dois primers de DNA, o primer 1 e 2 como iniciadores 
· Tampão – mantém o pH da reação 
· Cloreto de magnésio (MgCl2) – co-fator que melhora a eficiência da Taq DNA polimerase 
· DNA molde 
· Taq DNA polimerase que é capaz de sintetizar novas fitas de DNA a partir de fitas simples do DNA (ou RNA) molde – A taq auxilia na adição de nucleotídeos complementares 
· Água – acertar o volume da reação 
· DNTP’s (DATP, DGTP, DTTP, DCTP) – desoxinucleotideosy 
· É dívida em 3 etapas: 
1. Desnaturação 
· Com a temperatura entre 94 e 96 graus, ocorre a separação da dupla fita pelo aumento da temperatura 
2. Pareamento a 
· Entre 50 e 65 graus, ocorre a atuação de primers (em pcr o primers é de DNA) 
3. Extensão 
· Nessa etapa ocorre a adição de nucleotídeos complementares pela ação da Taq DNA polimerase