Microarranjos de DNA na Biologia Molecular

Prévia do material em texto

BIOLOGIA 
MOLECULAR
Juliana Oliveira Rangel
Microarranjos
Objetivos de aprendizagem
Ao final deste texto, você deve apresentar os seguintes aprendizados:
 � Identificar microarranjos de DNA.
 � Descrever metodologias associadas à tecnologia de microarranjos.
 � Reconhecer aplicações da tecnologia de microarranjos na área 
biomédica.
Introdução
As descobertas no campo da genética, em especial aquelas que são 
resultado do sequenciamento do genoma humano, têm gerado grande 
impacto no desenvolvimento de tecnologias capazes de propiciar maior 
entendimento acerca do funcionamento dos organismos. Entre as novas 
tecnologias disponibilizadas, podemos destacar as técnicas de microar-
ranjo de DNA ou DNA microarray.
Os microarranjos de DNA são compostos por um número expressivo 
de moléculas de DNA de sequência conhecida. Esse conhecimento 
permite a composição de uma matriz de distintos fragmentos gené-
ticos, com disposição pré-definida. Com a captura dessa imagem, a 
análise da expressão simultânea de genes ocorre por meio de sistemas 
computacionais.
Neste capítulo, você vai identificar o que são os microarranjos de 
DNA, conhecerá as metodologias que estão associadas à tecnologia 
de microarranjos e, por fim, será capaz de reconhecer aplicações da 
tecnologia de microarranjos na área biomédica.
Tecnologia de microarranjos de DNA
O Projeto Genoma Humano
O desenvolvimento do Projeto Genoma Humano, que tinha como um dos 
objetivos principais identificar todos os genes humanos, teve duração de 13 
anos. Ao final desse projeto, uma vasta gama de informações foi produzida 
(Figura 1). Essas informações, de livre acesso aos pesquisadores de qualquer 
parte do globo terrestre, servem de base para o desenvolvimento de estudos 
e pesquisas que podem conduzir não apenas ao esclarecimento dos processos 
fisiopatológicos, mas também ao desenvolvimento de tecnologias aplicáveis 
a diferentes propósitos (DESSEN, 2009).
Figura 1. Visualização de dados de um mapa genômico.
Fonte: Zita/Shutterstock.com.
Leitores do material impresso, 
para visualizar esta figura 
em cores, acessem o link 
ou o código QR a seguir.
https://goo.gl/ERbMtn
Microarranjos2
Oriundo das análises e conclusões obtidas pelo projeto Genoma Humano, 
um novo campo de estudos genéticos foi estabelecido: as pesquisas genômicas. 
“Genômica” é o termo utilizado para designar estudos que compreendem o 
genoma, a partir de uma abordagem de genética bioquímica. Ou seja, enquanto 
o projeto Genoma sequenciou o genoma humano, as pesquisas genômicas per-
mitiram o entendimento de diferentes aspectos relacionados a funcionalidade, 
estrutura e expressão genética (GRIFFITHS et al., 2009).
A genômica pode ser dividida em quatro principais subáreas.
 � Genômica estrutural: como o próprio nome já destaca, tem por objetivo estudar a 
estrutura e o modo como os genes se organizam. Assim, a composição estrutural 
por modelagem, aliada à abordagem experimental, permite a caracterização das 
estruturas.
 � Epigenômica: estuda as modificações epigenéticas, ou seja, modificações no 
DNA, que ocorrem em todo genoma, bem como suas relações com os processos 
saúde-doença.
 � Metagenômica: estuda metagenomas, que são o correspondente ao DNA resultante 
de amostras extraídas do ambiente.
 � Genômica funcional: ramificação da genômica que, a partir das informações ob-
tidas por estudos do genoma, descreve como os genes e as proteínas interagem, 
e como se caracterizam suas funções (UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, 2018).
Das subáreas da genômica, estudaremos, neste capítulo, a genômica funcio-
nal. Isso porque, a partir dos importantes dados obtidos pelo projeto Genoma 
Humano, ela possibilita compreender como interagem fenótipo e genoma, 
e como suas funções são constituídas. Assim, ao desenvolver estudos de 
genômica funcional, objetiva-se incrementar os conhecimentos sobre como 
o genoma influencia as funções biológicas. Para tanto, é imprescindível o uso 
de técnicas que propiciem a investigação funcional dos diferentes padrões 
genéticos que podem existir. Entre as técnicas existentes, podemos destacar 
o microarranjo (Figura 2) (LAPPALAINEN, 2015).
3Microarranjos
Figura 2. Microarranjo de DNA com pontos de DNA fixados em uma superfície de vidro 
utilizadas para medir níveis de diversas interações gênicas.
Fonte: science photo/Shutterstock.com.
Microarranjo de DNA
O expressivo número, em constante crescimento, de informações resultantes 
de estudos sobre expressão gênica e sequenciamento genômico aumentam de 
forma gradativa o nível de complexidade dos conhecimentos acerca da funcio-
nalidade dos genes. Como consequência disso, existe crescente demanda por 
novas metodologias capazes de auxiliar na obtenção de respostas não apenas 
eficientes, mas também confiáveis (VÊNCIO, 2006).
Nesse contexto, a técnica de microarranjos de DNA é uma das relevantes 
tecnologias que desponta nesse cenário, pelas vantagens que oferece na relação 
custo-benefício, em função do tempo relativamente curto em que é realizada 
e o amplo espectro de estudo da expressão gênica que propicia.
Leitores do material impresso, 
para visualizar esta figura 
em cores, acessem o link 
ou o código QR a seguir.
https://goo.gl/hHtN1D
Microarranjos4
Essa técnica consiste, basicamente, na utilização de chips de DNA (os 
microarranjos) que dispõem, de modo organizado, de grupos de milhares de 
moléculas de DNA com sequências previamente definidas. O chip de DNA 
contém sondas (ou spots) com porções microscópicas das amostras depositadas 
na superfície da lâmina. Sua função é detectar o material expresso, que pode 
ser de dois tipos: cDNA ou oligonucleotídeos (VÊNCIO, 2006).
Metodologias associadas à tecnologia 
de microarranjos
Para que você entenda como a tecnologia de microarranjos funciona, é im-
portante que fiquem claras as abordagens a ela atreladas. A seguir, você com-
preenderá quais são e como contribuem essas metodologias para composição 
da tecnologia de microarranjos.
Ao abordarmos essa tecnologia, é importante que você entenda que seu cerne é o 
processo de hibridização. Em biologia molecular, “hibridização” é o termo que refere à 
capacidade que ácidos nucleicos apresentam, quando em única fita, de associarem-se, 
resultando na geração de uma dupla fita. Essa estrutura de cadeia dupla é composta 
por pontes de hidrogênio. Essas pontes formam uma ligação estável, que liga as fitas 
simples com seus nucleotídeos dispostos de forma pareada por suas bases comple-
mentares. O conceito de hibridização advém da formação de uma terceira estrutura 
a partir de outras duas de origem diferentes, ou seja: um híbrido. Na tecnologia de 
microarranjos, a hibridização permite que as concentrações de mRNA dos tecidos, 
que são objeto de estudo, possam ser analisadas a partir da geração de luminosidade. 
Essa luminosidade é resultante da adição de fluoróforos, substâncias que conferem 
fluorescência às amostras utilizadas.
Processos básicos dos microarranjos
A tecnologia de microarranjos é constituída por quatro processos básicos 
(Figura 3), descritos a seguir.
5Microarranjos
Figura 3. Diagrama das etapas presentes na tecnologia de microarranjos.
Fonte: Theisen (2014).
1ª Etapa 2ª Etapa
DNA
PACIENTE
DNA
CONTROLE
3ª Etapa:
4ª Etapa: HIBRIDIZAÇÃO
Array CGH: The Complete Process
Etapas 1 a 3: DNA de amostras do paciente e controle são 
marcados com 	uoróforo e aplicadas ao microarranjo.
Etapa 4: Amostras de DNA tanto do paciente quanto do 
controle se ligam ou hibridizam ao microarranjo.
Etapa 5: O laser de microarranjo escaneia e mensura a 
	uorescência emitida. 
Etapa 6: Softwares analisam as informações e geram dados 
estatísticos.
5ª Etapa: 6ª Etapa:
1. Seleção e extração das amostras
A etapa inicial do processo consiste em escolher quais tecidos ou células 
serão utilizados para análise de microarranjos. Por exemplo, quando se estuda 
uma determinada doença, o tecido selecionado poderá ser oriundo do órgão 
em que a patologia se estabelece. Além dotecido doente, é selecionado um 
tecido saudável, que será utilizado como amostra de referência (também 
conhecido como amostra controle) para tecidos normais e doentes para fins 
de comparação dos padrões. As diferenças entre amostra de referência e 
amostra doente permitem que se possa entender as diferenças entre estados 
normais e patológicos, auxiliando no entendimento das vias que conduzem 
ao estabelecimento da doença. Após a seleção e o cultivo desses tecidos, seu 
RNA é extraído para a próxima etapa.
2. Identificação das amostras
Ao RNA das amostras de interesse e das amostras de referência são adicio-
nadas substâncias corantes com capacidade para emitir fluorescência. Esses 
Microarranjos6
compostos recebem o nome de fluoróforos, entre os quais os mais utilizados 
para microarranjos são as cianinas 3 e 5, que emitem fluorescências de cores 
diferentes (verde e vermelho, respectivamente), permitindo que se possa dife-
renciar a origem da emissão de fluorescência. Após a inclusão dos fluoróforos, 
os dois RNAs em questão são misturados e colocados nos microarranjos de 
DNA, que podem conter sequências complementares de oligonucleotídeos 
ou cDNA. 
3. Hibridização das amostras 
Processo básico principal dessa tecnologia, consiste na determinação do 
quão semelhantes são as expressões gênicas nas duas amostras estudadas. 
Essa semelhança é detectada pela capacidade que ambas apresentarão ou não 
de se ligarem às sequências complementares de oligonucleotídeos ou cDNA 
presentes nas placas de microarranjos.
4. Quantificação da expressão gênica
Por fim, todas as sequências que foram hibridizadas têm sua fluorescência 
digitalizada por lasers de dimensões microscópicas. A partir dessa imagem, 
a proporção de expressão gênica identificada nos dois tipos de amostras é 
estimada via relação da hibridização apresentada entre elas. Dessa forma, é 
possível compreender as diferenças relevantes na expressão gênica presente 
nos estados normal e patológico (CAMPOS, 2008).
Microarranjos com oligonucleotídeos: nesse tipo de microarranjo são utilizados 
oligonucleotídeos, que são polímeros compostos por até 20 nucleotídeos. Na técnica de 
microarranjos, os oligonucleotídeos são sintetizados com o intuito de se combinarem 
a uma região que já se sabe ter o estabelecimento de uma mutação. Assim, pode-se 
dizer que nessa técnica o oligonucleotídeo é utilizado com uma sonda.
Microarranjos com cDNA: nesse tipo de microarranjo, é utilizado o DNA comple-
mentar. Trata-se de uma molécula de DNA gerada pela transcrição reversa do mRNA 
de interesse. É uma molécula sintética que apresenta maior estabilidade (NEVES, 2010).
7Microarranjos
Aplicações da tecnologia de microarranjos 
na área da biomédica
Como vimos, a técnica de microarranjos oferece ilimitadas possibilidades de 
aplicações relacionadas às ciências da saúde. Isso se deve, principalmente, 
pela grande quantidade de informações que essa tecnologia gera e que são 
capazes de auxiliar no entendimento de processos fisiopatológicos investiga-
dos. No que se refere ao campo biomédico, essa técnica pode ser utilizada de 
diferentes modos. 
Diagnóstico e prognóstico
A capacidade que a técnica de microarranjos tem de analisar em ampla escala 
a expressão de milhares de genes presentes em células ou em tecidos-alvo, 
proporciona uma visão global do perfil de expressão gênica. Aplicado à aná-
lise tumoral, os microarranjos de DNA auxiliam a definir os caracteres de 
progressão tumorais, bem como possibilitam o entendimento entre perfis 
fenotípicos capazes de formar metástases, bem como aqueles não metastá-
ticos. É sabido sua grande utilidade para definição de perfis genéticos que 
apresentam expressão capaz de indicar a progressão de tumores. Graças às 
técnicas de microarranjos, a caracterização de perfis moleculares de carci-
nomas permite, por exemplo, predizer o comportamento de diversos tipos de 
tumores frente a abordagens terapêuticas, bem como identificar novos alvos 
terapêuticos. No caso de doenças infecciosas, permite a detecção de múltiplos 
microrganismos, de modo simultâneo. Além disso, aplicada à virologia, a 
tecnologia de microarranjos, a partir da investigação das mutações presentes 
no HIV, auxilia no delineamento do perfil de expressão gênica existente na 
resistência ao coquetel antirretroviral. Assim, atua como tecnologia aliada 
não apenas na detecção e no esclarecimento dos mecanismos que conduzem 
ao estabelecimento das doenças, mas também no modo como ela evolui e os 
prognósticos a eles atrelados (OKAMOTO, 2005).
Identificação dos genes alvo
A partir do desenvolvimento de estudos comparativos entre células e/ou tecidos 
considerados normais, em comparação aqueles com a doença objeto de estudos, 
os microarranjos permitem traçar perfil de expressão gênica característico 
da doença estudada e, assim, auxiliar na identificação dos genes envolvidos 
na patologia. 
Microarranjos8
Atualmente, o mecanismo molecular envolvido em eventos cardiovascula-
res, como acidentes vasculares cerebrais, tem sido investigado com o auxílio de 
técnicas de microarranjos. A partir dessa técnica, passaram a ser identificadas, 
por exemplo, alterações nos perfis genômicos presentes em amostras de sangue 
periférico logo após as primeiras horas de acidente vascular cerebral (AVC), 
de modo a afetar diferentes linhagem celulares sanguíneas. Além dessas infor-
mações, foi possível identificar que as alterações na expressão gênica desses 
pacientes implicaram a ativação de vias de resposta tanto inflamatória quanto 
imune que resultam em um perfil genômico de AVC claramente diferente das 
demais patologias do sistema cardiovascular. Assim, esse tipo de conhecimento 
permite o desenvolvimento de estratégias terapêuticas específicas que podem 
interferir nos genes relacionados às vias ativadas de modo a reduzir o impacto 
do AVC (GUINDALINI; TUFIK, 2007).
Farmacogenômica
A farmacogenômica é o estudo de como os genes afetam a resposta de um 
indivíduo aos fármacos. Trata-se de uma forma de medicina personalizada, 
que representa um avanço no entendimento de como as variações gênicas 
podem interferir no transporte das substâncias, bem como no modo como 
elas são metabolizadas.
Assim, a partir do perfil de expressão gênica do paciente, frente à exposição 
a um dado medicamento, o uso da tecnologia de microarranjos em estudos de 
farmacogenômica permite o entendimento que conduz à tomada de decisão 
sobre o melhor tratamento dentro das linhas terapêuticas vigentes, podendo 
ser definido de modo personalizado. Além disso, o acompanhamento do 
tratamento por análise de microarranjos permite monitorar o estabelecimento 
precoce de efeitos adversos associado ao uso de medicamentos (GUINDALINI; 
TUFIK, 2007).
Controle de ameaças biológicas à população
“Agentes biológicos” é o termo que engloba bactérias, vírus, entre outros 
organismos de potencial patogênico, assim como as toxinas que eles produ-
zem. Sua detecção apresenta complexidade muito maior, quando comparada 
a agentes químicos. A relevância de metodologias capazes de detectar com 
precisão esses agentes biológicos advém de seu potencial como arma biológica, 
uma vez que a dispersão de microrganismos ou toxinas como armas biológicas 
pode resultar em prejuízo de grandes proporções às populações expostas. 
9Microarranjos
Nesse contexto, a identificação de patógenos utilizando a tecnologia de mi-
croarranjos tem relevante papel na detecção de possíveis armas biológicas. 
Isso porque é um artifício de identificação rápido considerado padrão-ouro, 
capaz de identificar diversos microrganismos ao mesmo tempo. Do ponto de 
vista da segurança pública trata-se de um instrumento de proteção relevante 
(SONG; AHN; WALT, 2005).
Investigação de crimes
Nas últimas décadas, a utilização da análise de DNA nas investigações forenses 
representou um avanço significativo nesse segmento. A existência de mutações 
e recombinações genéticas confere aos indivíduos sequências diversas (exceto 
em gêmeosunivitelinos) que os tornam únicos. Essa diversidade genética é o 
fator determinante no papel da tecnologia de microarranjos como instrumento 
de direcionamento e até de decisão de investigações criminais. A tecnologia de 
microarranjos fornece suporte a decisões judiciais por fornecer detalhes presentes 
no DNA que podem ser cruciais para a conclusão de investigações forenses. 
Além de utilizar os microarranjos para excluir, entre os suspeitos, quais estão 
de fato envolvidos em um crime, uma nova abordagem aplicada às ciências 
forenses vem ganhando espaço: a definição de perfil por análise de fenótipo. 
Essa definição é utilizada, sobretudo, na inexistência de indivíduos suspeitos. 
Nessa abordagem, os microarranjos de DNA são utilizados para predizer as cores 
dos olhos, dos cabelos e da pele, a partir de modelos estatísticos. Para que você 
entenda a capacidade de predizer o perfil fenotípico de microarranjos, a técnica 
pode conferir uma acurácia próxima a 95%. Isso permite aos investigadores 
potencializarem o direcionamento das investigações e, assim, reduzir o tempo 
que seria utilizado para encontrar os envolvidos no crime (MATHESON, 2016) 
Informações sobre novos estudos envolvendo microar-
ranjos estão disponíveis em sites de revistas científicas de 
reconhecimento mundial, como a revista Nature.
https://goo.gl/DXHyZS
Microarranjos10
CAMPOS, R. S. Um estudo sobre processamento e análise de imagens de microarranjos de 
DNA. 2008. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Engenharia da Compu-
tação)- Universidade Federal de Pernambuco, Recife, 2008. 
DESSEN, E. M. B. Atualização em biologia molecular: a revolução genômica. 2009. Dis-
ponível em: <http://www.genoma.ib.usp.br/sites/default/files/apostila-zona-sul.pdf>. 
Acesso em: 22 nov. 2018.
GRIFFITHS, A. J. F. et al. Introdução à genética. 9. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 
2009.
GUINDALINI, C.; TUFIK, S. Uso de microarrays na busca de perfis de expressão gênica: apli-
cação no estudo de fenótipos complexos. Revista Brasileira Psiquiatria, v. 29, n. 4, p. 370-374, 
2007. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1590/S1516-44462007000400014>. Acesso 
em: 22 nov. 2018.
LAPPALAINEN, T. Functional genomics bridges the gap between quantitative genetics 
and molecular biology. Genome Research, v. 25, p. 1427-1431, 2015. Disponível em: <ht-
tps://genome.cshlp.org/content/25/10/1427.full>. Acesso em: 22 nov. 2018.
MATHESON, S. DNA phenotyping: snapshot of a criminal. Cell, v. 166, n. 5, p. 1061-1064, 
2016. Disponível em: <https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.08.016>. Acesso em: 22 nov. 
2018.
NEVES, C. D. Experimentos de microarrays e teoria da resposta ao item. 2010. Dissertação 
(Mestrado em Estatística)- Universidade de São Paulo, São Paulo, 2010.
OKAMOTO, O. K. DNA microarrays in cancer diagnosis and prognosis. Einstein, v. 3, n. 1, 
p. 31-34, 2005. Disponível em: <http://apps.einstein.br/revista/biblioteca/artigos/vol3/
num_1/Vol3_%20N1_P31.pdf>. Acesso em: 22 nov. 2018.
SONG, L.; AHN, S.; WALT, D. R. Detecting biological warfare agents. Emerging Infectious 
Diseases, v. 11, n. 10, p. 1629-1632, 2005. Disponível em: <https://wwwnc.cdc.gov/eid/
article/11/10/pdfs/05-0269.pdf>. Acesso em: 22 nov. 2018.
THEISEN, A. Diagram of the microarray-based comparative genomic hybridization (aCGH) 
process. 2014. Disponível em: <https://www.nature.com/scitable/content/diagram- 
of-the-microarray-based-comparative-genomic-41020>. Acesso em: 22 nov. 2018.
UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND. Epigenômica humana explicada em novo livro di-
dático. 2018. Disponível em: <https://chromosome.com.br/blog-chromosome-news/
epigenomica-humana-explicada-em-novo-livro-didatico/>. Acesso em: 22 nov. 2018.
VÊNCIO, R. Z. N. Análise estatística na interpretação de imagens: microarranjos de 
DNA e ressonância magnética funcional. 2006. Tese (Doutorado em Bioinformática) - 
Universidade de São Paulo, São Paulo, 2006. 
11Microarranjos
Leitura recomendada
VERJOVSKI-ALMEIDA, S.; DEMARCO, R. Genoma contra a esquistossomose. 2018. Disponível 
em: <http://www2.uol.com.br/sciam/reportagens/genoma_contra_a_esquistosso-
mose.html>. Acesso em: 22 nov. 2018.
Microarranjos12
Conteúdo: