Estrategias purificacao analises proteínas - Proteômica

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Proteômica
Estratégias de Purificação e Análises 
de Proteínas
O isolamento ou purificação de uma proteína é uma etapa que precede 
os estudos de suas características físico-químicas, de sua estrutura 3D 
e a compreensão de suas propriedades biológicas. 
Inicialmente, a estratégia de purificação de uma proteína é empírica, ou 
seja, baseada em tentativa-erro, e deve ser desenhada para cada proteína 
individualmente. Não há como prever quais métodos serão os mais 
eficientes para se purificar uma proteína pela primeira vez.
Purificação
2
Métodos baseados em características físico-químicas das biomoléculas:
1. Tamanho – Massa – Densidade (ex: centrifuação, diálise, gel-filtração)
2. Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica, eletroforese)
3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia, fase reversa)
Métodos baseados em afinidade biológica, que exploram a interação entre duas 
moléculas:
4. Cromatografia de afinidade
Métodos de Isolamento de Proteínas
Os métodos de separação de biomoléculas são agrupados em duas categorias:
ORGANELAS
LisossomosLisossomos
MitocôndriaMitocôndria
GolgiGolgi
NúcleoNúcleo
SOBRENADANTE
F
1 F 2 F 3 F 4
F
2 .1
F
2 .2
F
2 .3
F
2 .3.1
F
2 .3.2 . . . . . . F 2. 3.N
Precipitação com Sal/Solvente
Precipitação com Sal/Solvente
Cromatografia Troca Iônica
Cromatografia Troca Iônica
(pH ou resina diferente)
F
2 .3.N.X
1 Proteína apenas
(0.001g) - 0.1 a 0.5% total
Gel Filtração
MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) 
O fluxograma ao lado representa a “marcha” de purificação de uma proteína, 
mostrando as etapas sucessivas, cada 
uma consistindo de método, que levam ao 
isolamento de uma proteína presente 
numa mistura complexa.
Observe a quantidade de proteínas 
(100g) presente no material inicial e 
quanto da proteína purificada se obtém no 
final (0,001g). Esses números são típicos 
para a purificação da maioria das 
proteínas, em especial enzimas. 
Em cada etapa, a proteína de interesse é 
separada das demais com base em uma 
propriedade diferente. Consequente-
mente, as proteínas ainda misturadas com 
aquela que está sendo isolada são cada 
vez mais semelhantes em suas 
características físico-químicas, exigindo 
métodos cada mais sensíveis, capazes 
de explorar pequenas diferenças, para se 
chegar à proteína pura. 
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• Medida da atividade biológica
- particular para cada proteína
- deve ser quantitativa, para estimar quanto 
da proteína de interesse há em cada fração.
• Medidas do conteúdo proteico (diversos)
- absorbância de luz UV de 280 nm
- métodos colorimétricos 
(ex: Lowry, Bradford, BCA, etc)
Além dos métodos de purificação, análises 
complementares devem ser feitas ao longo da 
purificação, para verificar se o processo de 
separação está sendo eficiente.
A medida da atividade biológica da proteína 
de interesse e do conteúdo de proteínas de 
cada fração resultante do processo de 
separação devem ser feitas a cada passo. 
Assim, apenas a fração que contém a 
proteína de interesse, marcada com um 
círculo vermelho no fluxograma, é submetida 
à próxima etapa de purificação.
ORGANELAS
LisossomosLisossomos
MitocôndriaMitocôndria
GolgiGolgi
NúcleoNúcleo
SOBRENADANTE
F
1 F 2 F 3 F 4
F
2 .1
F
2 .2
F
2 .3
F
2 .3.1
F
2 .3.2 . . . . . . F 2. 3.N
Precipitação com Sal/Solvente
Precipitação com Sal/Solvente
Cromatografia Troca Iônica
Cromatografia Troca Iônica
(pH ou resina diferente)
F
2 .3.N.X
1 Proteína apenas
(0.001g) - 0.1 a 0.5% total
Gel Filtração
MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) 
Para iniciar a purificação, inicialmente é necessário extrair a proteína de interesse 
para um meio líquido, exceto se ela já estiver naturalmente presente em um meio 
líquido (sangue, suor, água do mar, meio de cultura, seiva de planta, etc). 
tecidos
células
Homogeneização 
(para romper tecidos e células)
por pressão
(prensa francesa)
liquefação
(Potter)
Homogenado
ou
Extrato bruto
Material 
de 
partida
Material na 
fonte
por ultra-som com
detergente
Vários métodos são 
possíveis para transformar 
células, órgãos, tecidos em 
um homogenado, ou extrato 
bruto, como mostra a figura.
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Sendo a proteína de interesse 
uma proteína de membrana, é 
necessário solubilizá-la. 
Para esse fim são utilizados 
detergentes, que dissolvem a 
membrana plasmática e 
formando complexos solúveis 
com as proteínas.
Proteínas 
integrais da 
membrana
detergente micelas
Complexos 
não micelares
Dependendo da concentração
Detergentes podem ser 
iônicos e não iônicos
Detergentes 
não iônicos
Triton X-100
(polyoxyethylene (9,5) p-t-octylphenol)
SDS
Dodecil sulfato de 
sódio
Cetab
Cetyltrimethylammonium 
bromide
Deoxicolato de sódio
Detergentes iônicos
Octilglicosídeo
(octyl-b-D-glucopyranoside)
sangue centrifugado: separação de plasma e células
A centrifugação frequentemente é uma das primeiras 
etapas de purificação aplicado a um extrato bruto. Através 
do movimento de rotação do rotor da centrífuga, uma força 
centrífuga é aplicada à amostra, separando seus compo-
nentes através de suas massas e/ou densidade, conforme 
a técnica. 
Através de sucessivas etapas de centrifução com 
velocidades (rotações por minuto, rpm) crescentes, pode-
se obter diferentes frações de um homogenado de células 
ou tecidos.
centrifugação diferencial
homogenado
células intactas
pedaços de membrana
núcleos
mitocôndrias
lisossomos
ribossomos
fração
citoplasmática
A centrífuga
Câmara blindada
Amostra 
sedimentando
refrigeração vácuo
rotor
ângulo
fixo
5
R$ 3.000 US$ 70,000
Centrífuga
Clínica
Ultracentrífuga
Força centrífuga
1,200g por 15 minutos 
separa plasma de 
células sanguíneas
200,000 g por 24 
horas para separar 
organelas menores 
ou complexos 
proteicos
(necessitam vácuo 
para evitar atrito do ar, 
além de refrigeração)
Relação entre o raio do rotor, velocidade angular (rpm) e a força centrífuga (g)
Preço aproximado
Existem centrífugas para diferentes tipos de aplicações, 
dependendo da força centrífuga que são capazes de gerar.
Centrifugação em gradiente de densidade
Solucões de sacarose com 
densidades diferentss são 
colocadas no tubo, uma 
sobre a outra Amostra é colocada no 
topo do gradiente
5% sacarose
20% sacarose
centrifugação
Baixa densidade
Média densidade
Alta densidade
A centrifugação em um 
meio com gradiente de 
densidade melhora a 
eficiência da separação. As 
partículas se deslocarão 
através do gradiente até 
encontrarem uma região 
com densidade equivalente 
a sua, quando param de se 
mover, formando “bandas”.
Gradientes podem ser 
utilizados para separar 
diferentes tipos de células, 
organelas, ácidos 
nucléicos, complexos 
proteicos, etc.
Gradiente separação de:
Ficoll-Hypaque leucócitos
Sacarose mitocôndrias
Cloreto de césio ácidos nucléicos 
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REPRESENTAÇÃO DA SUPERFÍCIE DE UMA PROTEÍNA. AS ÁREAS
VERMELHAS REPRESENTAM RESÍDUOS COM CARGAS NEGATIVAS, AS
ÁREAS EM AZUL REPRESENTAM RESÍDUOS COM CARGA POSITIVA.
QUANDO AS PROTEÍNAS SE ENOVELAM, OS RESÍDUOS HIDROFÓBICOS
TENDEM A FICAR NO SEU INTERIOR. ENTRETANTO, SEMPRE FICAM
"PATCHES“ HIDROFÓBICOS EXPOSTOS NA SUPERFÍCIE.
Solventes miscíveis com a água diminuem a constante 
dielétrica do meio e desorganizam a camada de solvatação 
das proteínas. 
Os mais utilizados são etanol e acetona. 
Proteínas também podem ser precipitadas com adição de solventes ao meio ou 
quando colocadas em meio com pH próximo ao seu ponto isoelétrico. 
Água 
Dimetilformamida
Metanol
Etanol
Acetona
Clorofórmio
Benzeno
78.5 1.85
48.9 3.96
32.6 1.66
24.3 1.68
20.7 2.72
4.8 1.15
2.3 0.00
Solvente Constante
Dielétrica 
Momento
Dipolar
Proteína P.I.
Pepsina <1,0
Ovalbumina galinha 4,6
Albumina sérica humana 4,9
Tropomiosina 5,1
Insulina bovina 5,4
Fibrinogênio humano 5,8
Gama-globulina 6,6
Colágeno 6,6
Mioglobina equina 7,0
Hemoglobina humana 7,1
Ribonuclease A bovina 7,8
CitocromoC equino 10,6
Histona bovina 10,8
Lisozima, galinha 11,0
Salmina, salmão 12,1
Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas
Proteínas colocadas em meio com pH igual ao seu PI 
tendem a precipitar, pois tendo carga neutra, apresentam 
a camada de solvatação menos organizada. 
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Para remover o excesso de sal ou do solvente no precipitado, utiliza-se a diálise.
-amostra é colocada dentro de um saco feito com uma membrana de celofane com poros 
tratados, que permite a passagem de moléculas até 10,000 d.
- o saco contendo a amostra é imerso em um recipiente contendo o solvente que se deseja
- excesso de sal ou de solvente se difunde para o solvente
- após várias trocas de solvente, todo o excesso de sal/solvente terá sido retirado.
Para obter as proteínas precipitadas em solução novamente, é 
necessário reverter as condições que levaram à precipitação.
Membrana 
de celofane
solvente
solução a 
ser dialisada
Aos precipitados obtidos com sal ou 
solvente, adiciona-se água.
Ao precipitado obtido com variação 
de pH, retornar ao pH original.
início final
∆t
Que características devem ter as resina cromatográficas para possibilitar 
separações de moléculas baseadas em diferentes propriedades ?
Cromatografia de permeação em gel ou gel-filtração: 
separação de moléculas pela massa molecular
géis são porosos, funcionando como peneiras ou filtros
Cromatografia de troca iônica:
separação de moléculas pela carga elétrica
géis apresentam grupos carregados positiva- ou negativamente
Cromatografia de partição (fase reversa ou hidrofóbica):
separação de moléculas pela solubilidade relativa em meio aquoso
géis possuem carácter hidrofóbico
Cromatografia de afinidade:
separação de moléculas pela capacidade de interagir com um ligante 
géis possuem ligante específico ligado covalente à resina
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Como se avalia se o processo de purificação de uma proteína foi eficiente ?
Três parâmetros permitem avaliar a eficiência do processo de purificação de uma proteína:
- Atividade específica (AE): é a razão entre a quantidade da proteína de interesse, medida 
através de sua atividade biológica, e a quantidade total de proteínas presentes 
em cada etapa de purificação. Esse índice aumenta ao longo da purificação.
- Índice de purificação: indica quantas vezes em relação ao material de partida a proteína 
de interesse foi “concentrada”. Calcula-se como a razão entre as atividades 
específicas inicial (material de partida) e final (proteína pura).
- Rendimento: indica quanto (em %) da proteína de interesse ativa presente no material de 
partida foi recuperado ao final da purificação. Um certo grau de perda é 
inerente do processo de purificação (em cada etapa só devem ser proces-
sadas as frações mais ricas em atividade biológica, desprezando-se aquelas 
que apresentam pouca atividade). 
Também podem ocorrer perdas por desnaturação das proteínas devido às 
diferentes condições (pH, sais, etc) a que são submetidas nas diferentes 
etapas de purificação. Espera-se recuperar o máximo possível da proteína de 
interesse. 
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Existem vários métodos para se determinar a sequência de aminoácidos de 
uma proteína. Dois métodos atualmente mais utilizados:
a) Método de Edman: reação do aminoácido N-terminal da proteína com 
fenil-isotiocianato . A proteína modificada é submetida a 
hidrólise ácida liberando o aminoácido N-terminal modificado, e este é 
identificado por cromatografia. Segue-se novo ciclo de reação com o 
próximo aminoácido na proteína, que se tornou o novo N-terminal. 
b) Espectrometria de massa: determinação das massas de fragmentos 
correspondendo a aminoácidos, retirados sequencialmente da proteína.
Veremos mais sobre esse método na aula sobre eletroforese e 
proteômica. 
Método de Edman -
sequenciamento de proteínas com 
PITC (fenil-isotiocianato)
ciclo 1
ciclo 2
hidrólise com ácido trifluoroacético
hidrólise ácida
vai para novo ciclo
análise cromatográfica (troca iônica ou fase reversa)
(1)
(2)
(3)
acoplamento
acoplamento
Cada ciclo de reação compreende 3 etapas:
1. Reação da proteína com PITC, que se 
acopla ao grupo amino NH2- livre do 
aminoácido 1 (no exemplo, uma lisina, K);
2. Hidrólise ácida da proteína conjugada com 
PITC libera a feniltiohidantoína (PTH) do 
aminoácido 1 e o restante da proteína, 
tornando o aminoácido 2 o novo resíduo 
N-terminal (no exemplo uma serina, S);
3. Análise cromatrográfica do PTH-
aminoácido e novo ciclo de reação com o 
novo N-terminal da proteína. 
Sequenciadores automatizados fazem 
todas as etapas, com capacidade para 
realizar 30 ciclos por dia, a partir de 
100-200 picomoles de proteína. 
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Sequenciamento de novo de proteínas por espectrometria de massas
Para sequenciar proteínas 
é preciso obter o espectro 
MS/MS de seus 
peptídeos.
Isso significa 2 etapas de 
MS acopladas. 
Depois de fazer o MS da 
molécula inteira, esta é 
fragmentada dentro do 
aparelho por colisão com 
gases.
Os fragmentos são então 
separados e analisados 
por MS.
hélio ou argônio
A ligação peptídica se quebra formando fragmentos típicos, como os 
íons b e y mostrados na figura acima, que terão massas diferentes de 
acordo com o radical R de cada aminoácido.
Espectro MS/MS do peptídeo 
tríptico 
GLSDGEWQQVLNVWGK.
AA Codes Mono. AA Codes Mono.
Gly G 57.021464 Asp D 115.02694
Ala A 71.037114 Gln Q 128.05858
Ser S 87.032029 Lys K 128.09496
Pro P 97.052764 Glu E 129.04259
Val V 99.068414 Met M 131.04048
Thr T 101.04768 His H 137.05891
Cys C 103.00919 Phe F 147.06841
Leu L 113.08406 Arg R 156.10111
Ile I 113.08406 CMC 161.01467
Asn N 114.04293 Tyr Y 163.06333
- - - Trp W 186.07931
Analiza-se o espectro 
buscando diferenças de 
m/z equivalentes a um 
resíduo de aminoácido, 
que permitem conhecer 
a seqüência do 
peptídeos
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Métodos imunoquímicos aplicados a proteínas 
� estrutura e propriedades de imunoglobulinas
� anticorpos policlonais e monoclonais: produção e purificação
� imunodiagnóstico: aglutinação X lise
� imunoprecipitação: difusão em gel, imunoeletroforese
� ELISA, Western blot
� imunohistoquímica e imunofluorescência
Anticorpos são imunoglobulinas.
Cadeia H (pesada) – 50.000 d
Cadeia L (leve) – 25.000 d
Porção N-terminal das cadeias L e H
~ 120 aminoácidos variáveis
restante da cadeia é constante
Cadeia H Cadeia L
Imunoglobulina
classe Sub-classe
γ1 κ ou λ IgG IgG1
γ2 κ ou λ IgG2
γ2 κ ou λ IgG3
γ4 κ ou λ IgG4
α1 κ ou λ IgA IgA1
α2 κ ou λ IgA2
µ κ ou λ IgM
δ κ ou λ IgD
ε κ ou λ IgE
Função Estrutura
anticorpo
antígeno
Complexo antígeno-anticorpo
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Imunoprecipitação
Complexos Antígeno-
Anticorpo insolúveis
- Precipitado é máximo na 
Zona de equivalência
- Excesso de Ag ou de Ac
Fazem complexos solúveis
Recombinant
Protein L
Native
Protein A
Recombinant
Protein A
Recombinant
Protein G
Protein
A/G
Source Peptostreptococci Staphylococcus
aureus
Bacillus Streptococci Bacillus
Molecular Weight 35,800 42,000 44,600 22,000 50,449
Number of Binding
Sites for IgG
4 4 5 2 4
Albumin Binding Site no no no no no
Optimal Binding pH 7.5 8.2 8.2 5 5-8.2
Binds to VLκ Fc Fc Fc Fc
Proteínas bacterianas com afinidade por Imunoglobulinas
- Servem como ligantes em matrix de afinidade
- Servem como 2º.ligantes em testes imunoenzimáticos
bead
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Imunobeads: adsorção complexo Ag:Ac
Ensaios Imunoenzimáticos ou ELISA
+ 1º.Ac + Ag
placa
Ag
Ac 1º.
Ac 2º.
ES
cor
ELISA
sandwich + 2º.Ac + S cor
Padronização do ELISA
Concentração do Ag ou Ac
A
b
s 
(i
n
te
n
si
d
ad
e 
d
a 
co
r)
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Western blot
Anticorpo secundário marcado com:
- enzima
- radioativo
- fluorescente 
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1. Eletroforese: uma técnica de separação de baseada na migração de partículas
carregadas sob a ação de um campo elétrico.
2. A eletroforese de proteínas é geralmente realizada em géis feitos de polímeros
de acrilamida.
3. O gel de poliacrilamida atua como uma peneira molecular. A separação das 
proteínas é baseada na sua razão carga/massa.4. A eletroforese na presença de SDS separa as proteínas com base em seu peso 
molecular.
Eletroforese
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Eletroforese
Eletroforese Sob Condições Não Desnaturantes
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Eletroforese Sob Condições Desnaturantes (SDS-PAGE)
• O SDS se liga a maoiria das proteínas de forma proporcional ao seu peso molecular.
• A ligação do SDS à proteína confere a esta molécula um grande número de cargas
negativas, tornando a carga intrínseca da proteína insignificante.
• A conformação nativa da proteína é alterada pela ligação com o SDS.
Eletroforese Sob Condições Desnaturantes (SDS-PAGE)
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Após a eletroforese, as proteínas podem se visualizada por colaração com Comassie
blue, que liga proteínas
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• Isoletrofocalização é uma técnica de separação de proteínas com base em
seu ponto isoelétrico.
• Um gradiente de pH é estabelecido por uma mistura de anfólitos que se 
distribuem ao longo do gel.
• Quando a mistura de proteínas é aplicada ao gel, cada proteína migra até
atingir o pH que atinge seu pI.
Isoletrofocalização
Isoletrofocalização
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Eletroforese Bidimensional
Eletroforese Bidimensional
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Eletroforese Bidimensional