MARCADORES MOLECULARES

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MARCADORES 
MOLECULARES
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Variável Isoenzimas RFLP RAPD Microsatélites AFLP 
Modo de 
observação do 
polimorfismo 
molecular 
Genes expressos; 
formas 
alternativas de 
enzimas 
Fragmentos de 
restrição de DNA, 
detectados por 
hibridização com 
sonda de DNA 
Segmentos de DNA 
amplificados 
arbitrariamente 
Amplificação específica 
de região contendo 
seqüência repetida 
Segmento amplificado 
via PCR após digestão de 
DNA com enzima 
Expressão 
genética 
Co - dominante Co - dominante dominante Co - dominante Dominante 
Número de 
alelos por locos 
Média de 2 a 4 
alelos 
multialélico 2 alelos ( binário) Altamente multialélico 2 alelos ( binário) 
Disponibilidade 
de marcadores 
no genoma 
De 20 a 50 em 
geral 
ilimitada ilimitada ilimitada Ilimitada 
Distribuição no 
genoma 
Regiões de cópia 
única 
Baixo número de 
cópias; 
medianamente 
repetidas em 
telômeros e 
centrômeros 
Mais ou menos ao acaso Mais ou menos ao acaso Mais ou menos ao acaso 
Custo baixo médio baixo Muito alto Médio 
 
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Construção de biblioteca genômica ou 
de cDNA
mRNA ou
DNA
cDNA
Clone cDNA Biblioteca de cDNA
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Interpretação dos resultados
A1A1
A1A2
A2A3
A1
A1
A1
A2
A2
A3
Repetição
Sítio de 
Restrição
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Vantagens e Desvantagens de 
RFLP
� Reprodutível
� Marcadores co-dominantes
� Simples
� Trabalhoso
� Caro
� Uso de sondas radioativas*
Vantagens dos Marcadores RFLP
• O uso de RFLP aumenta, a probabilidade de se encontrar 
associações estatísticas significativas entre marcadores e genes 
que controlam um caráter de interesse;
• Expressão co – dominante permite identificar genótipos 
homozigotos e heterozigotos;
Limitações dos Marcadores RFLP
• técnico especializado;
• Obtenção de biblioteca genômica;
• Uso de material radioativo P32
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Método Southern 
Blotting
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RFLP
Representação de DNA de fita simples em loco específico:
L1 
L2 
L3
L4
L5
L6
Sítio de restrição
Sonda – fragmento de DNA 
clonado marcado)
Mutação gerando sítio de restrição na 
seqüência homóloga
Mutação gerando sítio de restrição fora da 
seqüência homóloga
Inserção de seqüência de DNA entre os sítios 
de restrição
Mutação/ deleção de sítio de restrição que 
flanqueia seqüência homóloga
Deleção de seqüência de DNA entre os sítios de 
restrição
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Detecção autoradiografia de diferentes fragmentos de DNA das 
linhagens após a hibridização
Sondas 
• Através da transcrição reversa de mRNA do organismo em estudo, 
produzindo – se uma biblioteca de molécula de DNA complementar;
• Fragmentos de DNA genômico são clonados ao acaso;
• Amplificados por PCR de seqüência conhecida, utilizando primer 
conhecido;
• As bandas obtidas são amplificadas.
• A seleção de clones visa obter clones de cópias únicas, sem 
seqüência repetida ( pois estas hibridizam com vários fragmentos 
na membrana, o que resulta em borrões não interpretáveis na 
autoradiografia;
• Sondas com seqüências moderadamente repetidas no genoma 
torna – se útil quando o objetivo for a obtenção de uma impressão 
digital genética ( Fingerprint), específica para cada indivíduo
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Biblioteca genômica
• Passos: 
Coleta de tecido Extração de DNA Digestão de DNA com
Endonuclease
Eletroforese e seleção de fragmentos 
de tamanho específico para serem clonados
Preparo de plasmídeo vetor
Digestão de plasmídeo vetor com endonuclease 
Ligação de fragmentos ao plasmídeo vetor 
Transformação bacteriana
Detecção de células transformadas
Seleção e repicagem Acúmulo de transformantes 
( BIBLIOTECA GENÔMICA)
Aplicação do RFLP: fragmentos de restrição 
reconhecidos por uma sonda, numa análise de 
relação de parentesco 
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Resultado de uma 
investigação de um crime 
(estupro). O DNA da vítima, 
dos suspeitos, do namorado e 
do material colhido na vagina 
(evidência ou corpo de delito) 
foi obtido. Um DNA controle 
também é empregado no 
ensaio. As bandas obtidas do 
suspeito 1 coincidem com as 
obtidas do esperma do corpo 
de delito. As bandas obtidas 
do DNA das células da 
mulher, obtidas em mistura 
com o esperma, coincidem 
com as bandas da vítima (de 
fato, o DNA é da vítima). 
RAPD
Random Amplified Polimorphic DNA
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RAPD
• É basicamente uma variação do protocolo de PCR, com duas 
características distintas:
- Utiliza um primer ao invés de um par de primer no PCR;
- o primer único tem seqüência arbitrária, e portanto sua 
seqüência alvo é desconhecida;
- Para que haja amplificação de um fragmento RAPD no 
genoma, duas seqüências de DNA complementares ao Primer 
arbitrário devem estar adjacentes ( menos de 4000 pares de 
base);
- A base molecular do RAPD indica que diferenças de apenas 
um par de bases ( mutação de ponto) são suficientes para não 
causar a complemetaridade do primer com osítio de iniciação
- Natureza binária – Presença e ausência
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PCR
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PCR
RAPD – reação 1
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RAPD – reação 2
Resultado da Reação
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PCR
Desnaturação
Anelamento
Extensão
Termociclador
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RAPD
Vantagens do RAPD:
• Baseia se na amplificação do DNA ( rapidez e simplicidade);
• Não requer o desenvolvimento prévio de biblioteca genômica;
• Quantidade mínima de DNA para o teste;
• Gera grande quantidade de polmorfismo de segmentos de 
DNA, distribuídos por todo o genoma
Limitações do RAPD:
• Baixo conteúdo de informação genética por loco;
• Apenas um alelo é detectado e, não distingue genótipos 
homozigotos de heterozigotos
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Matriz de Similaridade
RAPD -
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RAPD
AA
Aa
aa
AA Aa aa
Interpretação de RAPDs
� Marcadores RAPD são inespecíficos
� Dados binários (presença x ausência)
� RAPD são dominantes (AA = Aa)
� Problemas de co-migração
• mesma banda, mesmo fragmento?
• uma banda, um fragmento?
� Questionamento para filogenia
• banda homólogas?
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PCR com primers arbitrários: 
acúmulo de siglas!
� RAPD
• Random Amplified Polymorphic DNA
� DAF
• DNA Amplification Fingerprinting
� AP-PCR
• Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction
� MAAP
• Multiple Arbitrary Amplicon Profiling (sugerido 
por incluir todas as pequenas variações na 
técnica)
Diferenças entre ensaios com 
primers arbitrários 
� RAPD
• 10mers, gel de agarose corado com brometo
� DAF
• 5mers, gel de acrilamida e reação marcada 32P
� AP-PCR
• 10mers, gel de acrilamida e reação marcada 32P
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MARCADOR MOLECULAR - RAPD
RAPD - primer OPJ04 - Bananeira
1500 pb
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RAPD - Feijoeiro
OPAM13
OPY04
MARCADOR MOLECULAR - RAPD
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Microssatélites (SSR)
� Sequence-Tagged Microsatélites
(STMS)
• também conhecido como microssatélite ou 
Simple Sequence Repeat (SSR)
� Normalmente locus simples e multi-
alélico
� Co-dominante
� Altamente reprodutível 
Microssatélites 
� STMS ou SSRs
• Seqüências curtas (1 a 6 bases) repetidas 
em tandem 
• Presentes em procariotos e eucariotos
• Presentes em regiões codificantes e não 
codificantes
• Maioria das repetições são dinucleotídeos 
� (AC) n (AG) n (AT)n
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� Polimorfismo devido a diferenças no 
número de repetições
• Escorregamento da DNA polimerase durante a 
replicação
• Crossing-over desigual entre cromátides irmãs
� Codominantes
� Normalmente locos simples e multi-alélico
Microssatélites 
Microssatélites (SSR)
� altamente informativo - vários alelos 
por locos
� detecção por PCR
� facilmente transferível entre labs
� distribuição homogênea no genoma
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Microssatélites (SSR)
ACTTCATTAA TGTCTTAGGT GGCAGAATAC TTTGATGCAACAATTTCAAG GGGTGCTGAC ATTAAGTTGG CTGCCAATTG 
GATAATGGGT GATATTGCTG CCTATATGAA AAATGAAAAG CTTTCTATTA ATGAGATCAA ACTTATGCCA GAAGAGCTAG 
TAGAGCTGAT AGCTTCCATT AAAGGTGGGA CTATCAGTGG AAAGATTGGA AAGGAGGTAA GCATTTGCTT CTTTNACTGA 
TGCCACTTTC ATGTTCAAAC ATTTGTTAGT AATCCTGTCT ATTTATTTTC ATGGAAGAAT TTTACTAGCT ATTATTCTCC 
ACTGTGTAGA TGTGATTTTA TAGTTTGTTT GGATATATAA TTATTGTTCG TGTTTTTTTT TTTAATCCAA ACTTTATAAT 
CTTTCCAAGT GCTTTTCTCC TCCCTGTCTT TTTCCTCTAC CACACACACA CACACACACA CACACTCATA CAGAAAAAGG 
AAAAAGGAAA GAAAGAGAAC AGGAGATATA AAAACCTTTT TTCTTTATCA ATTAGATAAT TAGTTATAAA AGTTTTTCTC 
CTGCTTCTTA TCCCTCCGCT AAATGCCTGA TTAACTTTCT GCTGGTAAAG ATTTAAAATA ACTTGTTAAT TTTGGACATG 
 
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN CACACACACACACACACAC NNNNNNNNN NNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTGTGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNNNNNNNNNN
Primer REV
Primer FOR
Repetição CA
Microssatélites (SSR)
Obtenção de seqüências:
� a partir de banco de dados de genoma ou 
cDNA
� hibridação com biblioteca genômica, 
identificação de clones e seqüenciamento
� construção de biblioteca enriquecida por 
afinidade com seqüência da matriz 
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� Detecção do polimorfismo
• Géis de agarose
• Géis de acrilamida (detecta diferenças de até 
2pb)
� coloração direta: nitrato de prata (barato)
� Coloração indireta: marcação radioativa ou 
fluorescente 
Microssatélites 
� Problemas
• Custo e trabalho envolvidos no desenvolvimento 
dos primers
� Construção de bibliotecas genômica
� sequenciamento 
� Triagem dos melhores primers
�Possibilidade de se usar seqüências depositadas 
em banco de dados
EST – SSR funcional x SSR genômico 
Microssatélites 
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Nicotiana tabacum
DNA genômico total
Seqüência microssatélite
Adaptadores
Sonda biotinilada
Bolinha magnética-
estratividina
ssDNA
ssDNA
Coluna
Digestão
Ligação 
Adaptadores
Amplificação
Enriquecimento e 
Seleção
Amplificação após 
enriquecimento
Enriquecimento e Seleção
Coluna 
Magnética
Temperatura ambiente / 20 min
ssDNA
Sonda biotinilada
Biotina IIIII(CT)8
ou
Biotina IIIII(GT)8
95°C / 15 min
água
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Dna Total
Digestão
com RsaI Amplificação
Amplificação após
enriquecimento
Ligação com
adaptadores
Nicotiana ripanda
N. sylvestris
N. tabacum “Coker 176”
N. tabacum “Ky 14 RMI”
Vetor
Clonagem
PCR
Sequenciamento
Desenho de primers
Transferência e 
Southern blot
Transformação 
e Seleção
Meio LB + amp + 
X-gal + IPTG
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N. sylvestris
N. tabacum “Coker 176”
Microssatélites Ancorados 
ISSR
NNNNNNNNN CACACACACACACAC NNNNNNNNNNNN CACACACACACACAC NNNNN
NNNNNNNNNGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNNNNNNNN GTGTGTGTGTGTGTG NNNNN
(CA) n NN
(CA) n NN
NNNNN (CA) n
NNNNN (CA) n
Repetição CA
ISSR
5’ ou 3’ancorado
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Escolha de Marcadores
Característica RFLP RAPD SSR AFLP ISSR CAPS 
Polimorfismo Pontual Pontual # Pontual Pontual Pontual
InDel InDel Rep. InDel InDel InDel
Nível de
Polimorfismo médio médio alto médio médio baixo
Abundância alta m.alta média m.alta média alta
Dominância CoDom Dom CoDom Dom Dom CoDom
[DNA] 10 µg 25 ng 50 ng 500 ng 25 ng 25 ng 
Seqüência não não sim não não sim
Marcação sim/não não não sim/não não não
Repetibilidade alta baixa alta média baixa alta
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Classificação por Tipo de Técnica
� Métodos sem uso de PCR
� RFLP
� VNTR
� Métodos com uso de PCR
• PCR com primers arbitrários
� RAPD, AP-PCR, DAF, MAAP;
� Polimorfismo de Tamanho de Fragmento Amplificado 
AFLP;
� ISSR
• PCR sítio-específico
� CAPS, SCAR
� SSRs (microssatélites)
� TGGE, SSCP, DGGE 
Classificação por Número de Cópias 
da Seqüência Alvo
� Seqüência de poucas cópias - codificante
� RFLP
� Seqüência com cópias repetidas
� VNTR
� SSRs (microssatélites) 
� ISSR
� Seqüência com número de cópias indefinido 
� RAPD, AP-PCR, DAF, MAAP;
� AFLP;
� CAPS, SCAR