Caracterização de Microrganismos

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Caracterização de Microrganismos
A caracterização de microrganismos 
pode ser feita, por exemplo por: isolamento 
de microrganismos da água, do solo, 
amostras biológicas e secreções. 
Técnicas de caracterização 
 A realização da caracterização de 
microrganismos se baseia em técnicas de 
isolamento, quantificação e identificação 
de microrganismos. 
 Para a realização da caracterização 
é necessário instrumentos laboratoriais, 
como: uso da capela de fluxo laminar 
(para esterilizar ao se trabalhar com 
bactérias patogênicas), esterilização do 
recipiente para colocação dos meios de 
cultura feita em filtros (bactérias sensíveis 
ao calor) ou no autoclave, tubos de 
ensaio (armazenamento de amostras), 
placas de Petri (cultivo de bactérias), 
micropipetas volumétricas (medição de 
volumes de líquidos), estufas (utilizadas 
para manter a temperatura tida como ótima 
para o crescimento de microrganismos) 
O isolamento dos microrganismos é 
realizado por técnicas de cultura mista e de 
cultura pura: 
Cultura mista: permite o crescimento de mais 
de um tipo de microrganismos. Ex.: bactéria 
e fungo; 
Cultura pura: permite o crescimento de 
apenas um tipo específico de microrganismo. 
As culturas puras de microrganismos 
podem ser conservadas de dias a meses em 
refrigeradores (entre 4 e 10°C), para 
conservações mais longas, deve-se usar 
freezer a -70°C ou nitrogênio líquido a 
uma temperatura de -196°C, pode ser feito 
ainda a liofilização (retirada de toda a 
água do meio). 
Semeadura em meios de cultura 
Para a realização da semeadura em 
meios de cultura, incialmente, utiliza-se a 
alça de platina para flambar no bico de 
bunsen até a alça ficar rubra, depois da 
alça esfriada, utiliza-a para tocar na 
amostra contendo bactérias e realiza a 
semeadura no meio de cultura, geralmente, 
feita por meio de estrias superficiais, após 
isso, garante o ambiente favorável para o 
crescimento das colônias de bactérias e a 
sua posterior visualização. 
Em algumas situações em que há um 
grande número de crescimento bacteriano, 
pode utilizar o uso do método de 
semeadura pour-plate, que realiza diluições 
seriadas. Para tal, retira-se 1mL de amostra 
bacteriana, insere em 9 mL de água, torna 
a solução homogênea, e repete essas 
diluições sucessivas até que se chegue em 
uma diluição que possibilite a semeadura e 
a observação do crescimento das colônias. 
Curva de crescimento bacteriano 
 
 
 
 
 
 
 
 Tipos de microscópicos 
Para a visualização de bactérias, 
faz-se necessário o uso de microscópios, 
onde os mais utilizados são os luminosos 
(ampliação 1000-2000) e eletrônicos 
(ampliação 200 000 – 400 000). 
 A microscopia eletrônica permite 
visualizar até mesmo as organelas, 
enquanto, a microscopia luminosa possibilita 
a visualização dos contornos. 
Preparo dos microrganismos para 
microscópio 
Técnica da gota pendente: coloca uma 
gota da amostra e espalha na lâmina; 
Técnica da lâmina e lamínula: coloca uma 
gota da amostra, espalha sob a lâmina e 
adiciona uma lamínula para auxiliar na 
fixação da amostra. 
Técnicas de coloração 
 Coloração significa simplesmente 
corar os microrganismos com um corante 
que enfatize certas estruturas. Antes que 
os microrganismos possam ser corados, no 
entanto, eles precisam ser fixados 
(aderidos) à lâmina microscópica. A fixação 
simultaneamente destrói os microrganismos e 
os fixa na lâmina. Ela também preserva 
várias partes dos micróbios em seu estado 
natural com apenas um mínimo de distorção. 
 Os corantes são sais compostos por 
um íon positivo e um íon negativo. A cor 
dos chamados corantes básicos está no 
cátion; a dos corantes ácidos, está no 
ânion. Os corantes básicos são mais 
comumente utilizados que os corantes 
ácidos. Os corantes ácidos não são 
atraídos pela maioria dos tipos de 
bactérias porque os íons negativos do 
corante são repelidos pela superfície 
bacteriana carregada negativamente, 
assim, a coloração cora o fundo. A 
preparação de bactérias incolores contra 
um fundo colorido é chamada de 
coloração negativa, sendo importante 
para a visualização de formas da células, 
tamanhos e cápsulas. 
Tipos de colorações: 
▪ Coloração simples: 
 Uma coloração simples é uma 
solução aquosa ou alcoólica de um único 
corante básico. Tendo como objetivo 
primário, destacar todo o microrganismo, 
para que as formas celulares e as 
estruturas básicas fiquem visíveis. Alguns 
dos corantes simples usados em laboratório 
são o azul de metileno, a carbolfucsina, o 
cristal violeta e Safranina. 
▪ Colorações diferenciais: 
 Elas reagem de forma diferente com 
diversos tipos de bactérias e, assim, 
podem ser utilizadas para realizar a 
distinção entre elas, principalmente, nas 
microbactérias. As colorações diferenciais 
 
mais frequentemente utilizadas para 
bactérias são a coloração de Gram e a 
coloração acidorresistente. 
1. Coloração de Gram: 
 
 
Observação: o cristal violeta é um corante 
primário, o iodo é um fixador de corante, o 
álcool é um agente descolorante e o 
corante safranina é um contracorante. 
 O corante púrpura e o iodo se 
combinam no citoplasma de cada bactéria, 
corando-a de violeta-escuro ou púrpura. As 
bactérias que retêm a coloração violeta-
escuro ou púrpura após a tentativa de 
descoloração com o álcool são 
classificadas como gram-positivas; as 
bactérias que perdem a coloração 
púrpura ou violeta-escura após a 
descoloração são classificadas como 
gram-negativas. 
2. Coloração acidorresistente: 
A coloração acidorresistente se liga 
fortemente apenas às bactérias que 
apresentam um material ceroso em suas 
paredes celulares. No procedimento, o 
corante vermelho carbolfucsina é aplicado 
a um esfregaço fixado, e a lâmina é 
aquecida levemente por vários minutos. A 
seguir, a lâmina é resfriada e lavada com 
água. O esfregaço é tratado com álcool-
ácido, um descolorante, que remove o 
corante vermelho das bactérias que não 
são acidorresistentes. Os microrganismos 
acidorresistentes retêm a cor vermelha ou 
rosa, pois a carbolfucsina é mais solúvel nos 
lipídeos da parede celular do que no 
álcool-ácido, em bactérias que não são 
acidorresistentes, cujas paredes celulares 
não possuem os componentes lipídicos, a 
carbolfucsina é rapidamente removida 
durante a descoloração, deixando as 
células incolores. O esfregaço é, então, 
corado com o contracorante azul de 
metileno. As células que não são 
acidorresistentes aparecem azuis após a 
aplicação do contracorante. 
 
▪ Coloração pelo Giemsa: 
Utilizada para o cultivo de protozoários. 
▪ Colorações especiais: 
 
São utilizadas para corar porções dos 
microrganismos, como os endósporos, 
flagelos ou cápsulas. 
1. Coloração negativa para 
cápsulas: 
Para demonstrar a presença de cápsulas, 
pode misturar as bactérias em uma solução 
contendo uma fina suspensão coloidal de 
partículas coradas, a fim de fornecer um 
fundo contrastante e, então, corar as 
bactérias com uma coloração simples, como 
a Safranina. 
 
2. Coloração para endósporos 
(esporos): 
Os esporos não podem ser corados pelos 
métodos comuns, como a coloração simples 
e a coloração de Gram, uma vez que os 
corantes não conseguem penetrar no 
endósporo. O corante verde malaquita 
(coloração primária), é aplicado a um 
esfregaçi fixado com calor e aquecido em 
vapor por cerca de 30minutos. Então, a 
preparação é lavada por cerca de 30 
segundos com água, para remover o verde 
malaquita de todas as partes da célula, 
exceto dos edósporos. A seguir, a Safranina, 
um contracorante, é aplicado ao esfregaço 
para corar as porções da célula que não 
os endósporos. Em um esfregaço 
corretamente preparado, os endósporos 
aparecem em verde dentro de células 
vermelhas ou rosadas. 
 
3. Coloração dos flagelos: 
Utilizada para demonstrar a presença de 
flagelos. Um mordente é usadopara 
aumentar os diâmetros dos flagelos até que 
se tornem visíveis microscopicamente 
quando corados com carbolfucsina. 
 
Caracterização dos microrganismos 
▪ Características morfológicas: 
(diâmetro celular, comprimento celular, 
número de flagelos, comprimento do flagelo, 
produção de pigmentos solúveis, 
pigmentos); 
▪ Nutricionais e de cultivo (depende 
do meio de cultura); 
▪ Características metabólicas 
(reação de oxidase, liquefação da gelatina, 
hidrólise de amido, desnitrificação); 
▪ Características antigênicas 
(reação antígeno – anticorpo); 
▪ Características patogênicas; 
▪ Características genéticas (DNA 
isolado de bactéria e aplicação de uma 
sonda de DNA).