Apostila Biossegurança

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Níveis de Biossegurança, Métodos de controle de microrganismos e Biossegurança na Saída a campo.
· Níveis de Biossegurança
A grande maioria dos biotecnologistas começa a carreira em um laboratório, não necessariamente durante a Iniciação Científica ou no estágio, mas naquela primeira aula de biologia, química ou física básica. O primeiro contato é excitante e você se vê pronto para fazer coisas incríveis e também realizar novas descobertas, contudo, a segurança vem sempre em primeiro lugar.
É necessário proteger a si mesmo, seus colegas e o ambiente de organismos biológicos e agentes com que se trabalha no laboratório. Os níveis de biossegurança são uma maneira de classificar as precauções que devem ser tomadas para a prática de uma ciência mais segura.
Existem quatro Níveis de Biossegurança (NB) definidos pelo Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC), designados em ordem crescente pelo grau de proteção proporcionado: NB-1, NB-2, NB-3 e NB-4. O primeiro nível começa com precauções mínimas devido ao baixo risco de biossegurança. A medida de segurança aumenta nos próximos três níveis, proporcionalmente ao risco que os organismos e agentes utilizados oferecem ao operador e ao meio ambiente.
A classificação de laboratórios em níveis de biossegurança é importante porque dita o tipo de práticas de trabalho que podem ser realizadas, além de influenciar fortemente o projeto das instalações em questão e o tipo específico de equipamento de segurança utilizado.
NB-1 Nível de Biossegurança 1
Nesses laboratórios se trabalha com agentes bem caracterizados e que não causam qualquer doença ou dano em seres humanos adultos e sadios, como a Saccharomyces cerevisiae. É possível trabalhar na bancada ao ar livre utilizando práticas microbiológicas padrões.
Riscos: individual e comunitário baixos
Agentes biológicos que têm probabilidade nula ou baixa de provocar doenças no homem e que não constituem risco para o meio ambiente.
Organismo receptor e parental:
- não patogênico
- com amplo histórico documentado de utilização segura
- sem efeitos negativos para o meio ambiente
Ex: Saccharomyces cerevisiae e Lactobacillus sp. Lactobacilos, Algumas bactérias anaeróbias e Microorganismos não patogênico.
NB-2 Nível de Biossegurança 2
Os laboratórios NB-2 são utilizados para trabalhar com agentes que apresentam riscos moderados para o pessoal e para o ambiente, como aqueles patogênicos ou infecciosos que podem causar doenças brandas ou moderadas, com tratamento acessível em humanos (por exemplo, vírus da hepatite B e Salmonella).
Suas instalações devem conter equipamentos e fornecimentos necessários para descontaminação dos resíduos do ambiente (por exemplo, autoclave). Laboratórios NB-2 devem ter, ainda, cabines de biossegurança para evitar a propagação de aerossóis infecciosos criados durante os procedimentos normais ou por acidentes.
Para trabalhar em um NB-2, é necessário seguir todas as regras e regulamentos de segurança de um NB-1, além de receber treinamento específico para manipulação de agentes patogênicos. É importante também utilizar Equipamentos de Proteção Individual (EPIs) e sempre retirá-los ao sair do laboratório para áreas não NB-2.
Riscos: individual moderado e comunitário limitado
Organismos patogênicos, porém geralmente não apresentam um perigo sério para os indivíduos. Pode provocar infecções graves, porém já se conhecem medidas profiláticas adequadas com risco de propagação limitado ou reduzido na comunidade e no meio ambiente.
Ex: vírus da hepatite B e Salmonella e Leptospira sp (bactéria) Chlamydia pneumoniae, C. trachomatis, Helicobacter pylori, Staphylococcus aureus, Treponema pallidum, Helmintos e protozoários intestinais, Diversos fungos, HVA, HVB, HVC, Herpes, Rubéola.
NB-3 Nível de Biossegurança 3
Laboratórios NB-3 tratam agentes que têm potencial para causar doenças graves ou infecção letal por inalação. Nesses ambientes se trabalha com micro-organismos que causam doenças humanas graves, mas que que possuem tratamento ​​(por exemplo, Mycobacterium tuberculosis e o vírus da encefalite de St. Louis). Por isso, devem estar localizados separadamente das áreas de acesso irrestrito.
Semelhante a um laboratório NB-2, é necessário treinamento especial para manipulação de agentes potencialmente letais. O supervisor deve ter muita experiência em lidar com agentes infecciosos e o instituto deve realizar exames sanguíneos regularmente para testar a exposição dos colaboradores a esses patógenos
Riscos: individual alto e comunitário limitado
 Organismos patogênicos que costumam provocar doenças graves, propagada de um hospedeiro infectado ao outro. Existem medidas profiláticas e de tratamento bem estabelecidas.
Ex. Bacillus anthracis, HIV, M.tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis e o vírus da encefalite de St. ,Clostridium botulinum, M. bovis (todas as cepas, exceto a BCG),M. tuberculosis, Fungos: Histoplasma capsulatum, HIV, HTLV (vírus T-linfotrópicos humanos tipo I ).
NB-4 Nível de Biossegurança 4
Laboratórios NB-4 tratam de qualquer agente que cause doenças com risco de vida, sem tratamento disponível e com alto potencial de infecção transmitida por aerossol, ou agentes que apresentem risco desconhecido (por exemplo os vírus Ebola e Lassa). Qualquer pessoa que trabalhe em um NB-4 deve ser bem treinada e seu supervisor deve ter muita experiência na área.
Riscos: individual e comunitário elevados
Agentes infecciosos patogênicos que geralmente causam doenças graves, sendo facilmente transmitidas e na maioria dos casos não se conhece tratamento eficaz e as medidas profiláticas não estão bem estabelecidas.
Transmissão via respiratória ou desconhecida.
Ex. Vírus Ébola e Lassa Somente Vírus, Agentes de febres hemorrágicas, Vírus da aftosa, Vírus Ébola, Vírus da Gripe aviária H5N1.
· Métodos de controle de microrganismos
deterioração dos alimentos.
O controle de microorganismos se refere às diferentes formas de matar ou remover os microorganismos, reduzir o número e inibir o crescimento. O método de escolha depende do tipo de material que contém o microrganismo. Este controle pode ser feito através de métodos físicos e métodos químicos. Podem ser feitos do seguinte tipo:
Esterilização: Processo de destruição ou remoção de todas as formas de vida microbiana, incluindo esporos bacterianos, que são as formas mais resistentes de vida.
Desinfecção: Processo que visa a destruição ou inibição do crescimento de patógenos vegetativos em superfícies ou substâncias inertes. Desinfetante é agente normalmente químico que mata as formas vegetativas, mas não necessariamente esporos bacterianos.
Anti-sepsia: Processo que visa a destruição ou inibição do crescimento de microrganismos vegetativos em tecidos vivos, pele e mucosas. O produto químico utilizado é denominado anti-séptico.
Assepsia: Assepsia significa ausência de patógenos vivos. A técnica asséptica se destina a eliminar e excluir todos os microrganismos infecciosos pela esterilização de equipamentos, desinfecção do meio ambiente e limpeza dos tecidos do corpo com anti-séptico.
Descontaminação: Eliminar microorganismos de um determinado material.
Limpeza: Remoção mecânica de matéria orgânica de superfícies e objetos.
Fatores de influência a efetividade dos tratamentos antimicrobianos
· O número de microrganismos;
· Características dos microrganismos;
· Presença de matéria orgânica;
· Concentração do agente antimicrobiano;
· Temperatura;
· Tempo de exposição ao agente antimicrobiano.
Ações dos agentes de controle de microrganismos
· Alteração da permeabilidade da membrana
· Danos à proteínas
· Danos à ácidos nucléicos
· Forma vegetativa - metabolismo ativo, atividade metabólica no máximo, cresce e se multiplica
· Forma esporulada - Metabolismo inativo, não cresce nem se multiplica
· Microrganismos patogênicos - causador de doenças
· Microrganismo oportunista (semi patogênico) - causador de doença devida a imunidade baixa.
· Microrganismos sapróbio - decompositor na natureza
Importância do controle microbiano
· Prevenir ou controlar a transmissãode doenças infecciosas
· Prevenir ou controlar a contaminação ou crescimento de microrganismos nocivos
· Prevenir ou controlar a deterioração e dano de material por microrganismo
Métodos Físicos de Controle de Microorganismos
Por Fabiana Santos Gonçalves
Microbiologia
O controle de microorganismos se refere às diferentes formas de matar ou remover os microorganismos, reduzir o número e inibir o crescimento. O método de escolha depende do tipo de material que contém o microrganismo. Este controle pode ser feito através de métodos físicos e métodos químicos. Abaixo estão os principais métodos físicos.
Calor
Quando uma população de bactérias é submetida ao calor, suas proteínas são desnaturadas. Há fluidificação dos lípideos na presença de calor úmido. Os microorganismos são considerados mortos quando perdem a sua capacidade de se multiplicar de forma irreversível. Quando falamos de calor seco, oxidação. Porém devemos levar em consideração que cada microorganismo responde de uma forma, de acordo com sua resistência, quantidade e estágios metabólicos. O método a ser escolhido deve ser aquele mate as formas mais resistentes de microorganismos. Os três parâmetros que podem expressar essas diferenças: temperatura, tempo e grau de resistência.
Quando uma população microbiana é submetida ao calor, a redução do número de indivíduos viáveis ocorre de forma exponencial. Portanto, quanto mais tempo se passar exposto ao calor, menor a quantidade de microorganismos em determinado meio. Segundo Flavio Alterthum, um material será considerado estéril quando trabalhamos na faixa de probabilidade de encontrar um indivíduo vivo é de 1/10-6 (um para um milhão).
Calor úmido
a) Fervura
O mecanismo de ação da fervura é a desnaturação de proteínas. Não é um método de esterilização, mas após cerca de 15 minutos de fervura pode matar uma grande quantidade de microorganismos, mas não é eficaz contra endósporos bacterianos e alguns vírus. Normalmente este método é utilizado em desinfecções caseiras, preparo de alimentos, etc.
b) Autoclavação
O mecanismo de ação da autoclavação é a desnaturação de proteínas. Se os materiais a serem submetidos à autoclavação não forem deformados pelo calor ou umidade, este é o melhor método a ser empregado. A autoclave é um aparelho que trabalha com temperatura e pressão elevadas. Quando os microorganismos estão diretamente em contato com o vapor a esterilização é mais eficaz. Utiliza-se esse processo para esterilização de meios de cultura, soluções, utensílios e instrumentos.
c) Pasteurização
O mecanismo de ação da pasteurização também é a desnaturação de proteínas. Este método foi desenvolvido por Louis Pasteur em 1846. Consiste em aquecer o produto em uma determinada temperatura, por um certo tempo e logo após, resfriá-lo. Este processo reduz o número de microorganismos, mas não assegura sua esterilização. Muito utilizado na esterilização de leite, creme de leite, cerveja, vinho, etc.
Calor Seco
a) Flambagem
É um método simples, porém muito eficaz. Consiste em colocar a alça de platina diretamente sobre o fogo, oxidando todo o material até virar cinzas.
b) Incineração
Também é muito eficaz. Utilizado para incinerar diversos tipos de materiais, como papéis, materiais hospitalares, carcaças de animais, etc. Também oxida todo o material até virar cinzas.
c) Fornos
Normalmente é utilizado para esterilizar vidrarias. Deve-se atentar bem à relação tempo x temperatura.
Filtração
A passagem de soluções ou gases através de filtros retém os microorganismos, então pode ser empregada na remoção de bactérias e fungos, entretanto, passarão a maioria dos vírus.
Radiações
Dependem do comprimento de onda, da intensidade, da duração e da distância da fonte para esterilizar.
Ionizantes
Utilizam radiações gama, mas tem um custo elevado. Formam radicais superativos e destroem o DNA. Utilizado para esterilização de produtos cirúrgicos.
Não-ionizantes
A mais empregada é a luz ultravioleta, que altera o DNA através da formação de dímeros. As lâmpadas germicidas são de baixo poder de penetração.
Baixas temperaturas
Não têm efeito esterilizante, apenas interrompem o crescimento bacteriano, preservando os microorganismos.
Microondas
As radiações emitidas não afetam o microorganismo, mas geram calor, esterilizando meios de cultura e materiais. Por isso têm sido cada vez mais utilizados.
Indicadores Biológicos
Neste método, suspensões-padrão de esporos bacterianos são submetidos à esterilização juntamente com os materiais a serem esterilizados. Após o processo, os indicadores são colocados em meios de cultura adequados. Se não houver crescimento, é porque o processo de esterilização foi eficiente.
Pressão Osmótica
Quando em contato com meios hipertônicos (alta concentração de sais e açúcares) as células dos microorganismos perdem água por osmose, ficando murchas, impedindo assim o crescimento bacteriano. Método utilizado para conservar alimentos.
Dessecação
Este é um método para preservação de microorganismos. Sabe-se que na ausência de água alguns microorganismos têm o seu metabolismo reduzido e até ausente, porém permanecem viáveis. Através da liofilização a água é removida do interior das células e os microorganismos são preservados em condições especiais de armazenamento e temperatura.
Métodos Químicos de Controle de Microorganismos
Por Fabiana Santos Gonçalves
Bioquímica, Microbiologia
Os agentes químicos utilizados para essa função podem ser esterilizantes ou desinfetantes. A esterilização acaba com todas as formas de vida de um material, enquanto os desinfetantes apenas reduzem a carga de microorganismos, a ponto de não oferecer riscos de disseminação.
Principais grupos de agentes químicos para controle de microorganismos:
Álcoois
O álcool atua na desnaturação das proteínas e solubilização de lipídios. Pode haver efeitos secundários na interferência do metabolismo e eventual lise das células. No mercado existe uma grande variedade de produtos que podem ser usados de acordo com o tipo de esterilização desejado.
Aldeídos e derivados
Por ser bem solúvel em água, o aldeído fórmico é o mais utilizado. A metenamina pode ser misturada ao ácido mandélico em algumas preparações, aumentando o poder bactericida.
Fenóis e derivados
O fenol é um desinfetante fraco, tendo interesse apenas histórico, pois foi o primeiro agente a ser utilizado como tal na prática médica e cirúrgica. Os fenóis atuam sobre qualquer proteína, mesmo aquelas que não fazem parte da estrutura ou protoplasma do microorganismo, significando que, em meio orgânico protéico, os fenóis perdem sua eficiência por redução da concentração atuante.
Os cresóis têm um poder 3 vezes maior que os fenóis. A creolina é uma mistura de cresóis e é utilizada na desinfecção de superfícies, vasos sanitários, etc.
O timol é menos tóxico e é mais ativo que o fenol cerca de 30 vezes. São utilizados como anti-sépticos em infecções causadas por fungos.
O triclosan tem uma ampla atividade bacteriostática e fungistática, e não é tóxico.
Pelo seu poder biocida, os compostos fenólicos são utilizados em larga escala em indústrias de alimentos e rações, na preservação de madeiras, na fabricação de cosméticos e em áreas médicas.
Halogênios e derivados
Um dos anti-sépticos mais utilizados na prática cirúrgica é o iodo sob a forma de tintura. O mecanismo de ação é combinação irreversível com proteínas, provavelmente através da interação com os aminoácidos aromáticos, fenilalanina e tirosina.
Desde que não haja excesso de matéria orgânica, o cloro gasoso pode ser utilizado para desinfecção da água. O cloro ataca os grupos alfa-aminados das proteínas, formando cloroaminoácidos instáveis.
Ácidos Inorgânicos e Orgânicos
O ácido bórico é um dos mais populares anti-sépticos, mas causa intoxicação. O ácido acético, o ácido lático, ácido benzóico e seus derivados, ácido sórbico e ácido cítrico são utilizados na conservação de alimentos. O ácido mandélico e o ácido nalidíxico são utilizados como anti-sépticos das vias urinárias. Os ácidos graxos possuem atividadeantifúngica.
Agentes de superfície
Os compostos mais utilizados são cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, cloreto de cetilpiridíneo e o cetremida. Os sabões não se encaixam nesta categoria , mas são compostos aniônicos que possuem limitada ação quando comparada com a de substâncias catiônicas. Os detergentes derivados de amônia são bastante utilizados em desinfecções e anti-sepsias.
Metais pesados e derivados
O baixo índice terapêutico dos mercuriais e o perigo de intoxicação por absorção fizeram com que aos poucos deixassem de serem usados, curiosamente alguns derivados mercuriais tiveram grande aceitação, embora dotados de fraca atividade bactericida e bacteriostática in vivo, como o merbromino.
Agentes oxidantes
A liberação de oxigênio nascente, que é extremamente reativo e oxida, entre outras substâncias, os sistemas enzimáticos indispensáveis para sobrevivência dos microorganismos. A água oxigenada é o agente mais utilizado. O ozônio tem sido utilizado no tratamento de água de consumo.
Esterilizantes gasosos
O óxido de etileno é empregado com sucesso na esterilização de materiais cirúrgicos, embora tenha uma ação lenta. A betapropiolactona é cerca de 4000 vezes mais eficaz que o óxido de etileno, mas é tóxica e tem baixo poder de penetração.