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Imunologia Clínica 1 Imunologia Clínica Prof. Sandro Jorge Januário Imunologia Clínica 2 Introdução à Imunologia 3 Histórico 3 Conceitos e Componentes do Sistema Imune 4 Mecanismos da Resposta Imune 11 Imunidade Inata ou Natural (Celular) 12 Imunidade Adaptativa ou Adquirida (Humoral) 13 Classes de imunoglobulinas 14 Estrutura Molecular das Imunoglobulinas 14 Características e Propriedades das Imunoglobulinas 14 Sistema Complemento 19 Conceito e classificação 19 Atividade Fisiológica ou Propriedades do Sistema Complemento: 19 Resposta Imunológica Mediada por Células (Imunidade Celular) 20 Ativação dos Linfócitos T 20 Ativação de Linfócitos B e Produção de Anticorpos 21 Resposta Imune contra Tumores e Transplantes 23 Mecanismos Imunes da Rejeição Tumoral 23 Mecanismos Imunes da Rejeição de Transplantes 23 Reações de Hipersensibilidade 24 Tolerância Imunológica e Autoimunidade 26 Doenças Causadas pela Resposta Imune Defeituosa 27 Mecanismos Gerais 27 Imunopatogênese das Doenças Autoimunes 28 Fundamento dos Métodos Imunológicos no Diagnóstico Laboratorial 30 Considerações Gerais 30 Caracteristica das Reações Antígeno-Anticorpo (Ag – Ac) 30 Técnicas mais Utilizadas 32 Reação de Precipitação 32 Reação de Aglutinação 32 Reação de Imunodifusão 34 Reação ou Ensaio Imunoenzimático (EIA ou ELISA) 35 Reação de Imunoblot (WesternBlot) 35 Reação de Imunofluorecência 36 Imunofluorescência Direta (IFD) 36 Radioimunoensaio (RIA) 37 Referência 40 Sumário Imunologia Clínica 3 UNIDADE I - Imunologia Básica Introdução à Imunologia A imunidade é definida como resistência a doenças, em especial às infecciosas e parasitárias. O conjunto de células, tecidos e moléculas que medeia a resistência a infecções é chamado de sistema imunológico, e a reação coordenada dessas células e moléculas aos agentes estra- nhos ao organismo, também denominados de antígenos, é chamada de resposta imunológica. Um dos processos fisiológicos mais predominantes no sistema imunológi- co é a produção de anticorpos, que ocorre em função da presença do antígeno, aos quais reagem especificamente. O intuito da resposta imunológica na interação antígeno- -anticorpo é neutralizar a ação dos antígenos. Figura 1 – Anticorpos ligados a células do sistema imu- nológico atacando um antígeno A Imunologia é uma ciência que trata do estudo do sistema imunológico e de sua resposta (produção de an- ticorpos) a agressões por moléculas ou agentes invasores (antígenos). Estuda o complexo sistema imunológico do ser humano, que protege o organismo de doenças, que podem ser causadas por uma grande variedade de bac- térias, vírus, fungos, toxinas, protozoários, vermes, entre outros. As células do sistema imunológico são altamente or- ganizadas, recebem ou enviam mensagens de ataque ou mensagens de supressão, apresentação do agente inva- sor ás células, destruição ou neutralização de substâncias produzidas pelo invasor ou molécula estranha. Histórico • O termo imunidade foi adotado por Tucídides no século V a.C. para designar proteção contra uma doença. • O primeiro conceito de imunização ativa adqui- rida naturalmente surgiu com os chineses, que fa- ziam as crianças inalarem “pós” feitos com crostas de lesões cutâneas de pacientes que tinham sido acometidos pela varíola. • Em 1796, pesquisas mostraram que era possível induzir a proteção contra o vírus da varíola humana por meio do vírus cowpox da varíola bovina (vaca = vacina). Aparece então o termo vacinação, que é a introdução de vírus enfraquecidos ou de parte deles (ex.: proteína), incapazes de produzir doen- ça em pessoas sadias, com a finalidade de conferir proteção natural contra uma doença. Edward Jen- ner foi o cientista idealizador da vacina. • No início do século XIX, foi descoberto que muitas doenças infectocontagiosas eram provocadas por seres microscópicos como bactérias e fungos. Isso se deu pelos estudos de Robert Koch com a estimu- lação do sistema imunológico. • Em 1880, em Paris, iniciou-se o projeto para uma vacina contra o cólera em galinhas e também uma vacina contra a raiva, pelos estudos de Louis Pas- teur. • Em 1890, foi descoberto que o soro de pacientes vacinados apresentava substâncias que, de forma específica, se ligavam aos agentes que causavam infecções. Essas substâncias seriam denominadas de anticorpos por Shibasaburo Kitasato e Emil von Behring. Fonte: http://www.misodor.com/ANEMIAS%20HEMOLITICAS.php Imunologia Clínica 4 Conceitos e Componentes do Sistema Imune a) Conceitos básicos Antígenos (Ag): são substâncias (proteínas, polissa- carídeos, microrganismos etc.) que vão ser reconhecidos pelo sistema imune como algo estranho ao organismo. Características: • Antigenicidade: Propriedade de reagir com o Ac especificamente, porém sem induzir o sistema imu- ne. • Imunogenicidade: É a capacidade do Ag de indu- zir a uma resposta imune. • Haptenos: são moléculas pequenas, que podem ser estranhas, antigênicas, porém não imunogêni- cas (ex.: lipídeos, ácidos nucleicos, insulina, que, para se tornarem imunogênicas, têm que estar as- sociadas com proteínas carreadoras). • Epítopos: pequena região do Ag capaz de ser re- conhecida pelo Ac e ligar-se a ele. Para ser imuno- gênico, deve ser estranho, ter complexidade, maior peso molecular e apresentar epítopos acessíveis. Anticorpos (Ac): proteína globular, que também pode ser chamada de imunoglobulina, capaz de reagir especi- ficamente com o antígeno. Podem ser solúveis (lançados no sangue) ou ligadas à membrana dos linfócitos B. Den- tre as funções dos anticorpos, destacam-se: neutralizar toxinas, precipitar microrganismos, combinar-se com Ag e formar precipitados, ativar o sistema complemento, imo- bilizar microrganismos (ex.: anticorpos podem se ligar ao flagelo de bactérias e impedir a sua locomoção). Figura 2 – Desenho esquemático de um tipo de anti- corpo (imunoglobulina G) com extremidades para ligar-se especificamente ao antígeno b) Células e tecidos do sistema imunológico As células originam-se na medula óssea, onde muitas amadurecem antes de migrar para o sangue e a linfa; ór- gãos linfoides são aqueles que contêm grandes quantida- des de linfócitos em um ambiente de células não linfoides. • Os órgãos linfoides primários ou centrais (produ- ção e amadurecimento dos linfócitos) são: Medula óssea (bone marrow) e Timo (thymus) Fonte: http://metodoslaboratoriaiscomac.blogspot.com.br/2010/09/resumo-da- aula 27082010.html Imunologia Clínica 5 Figura 03 - Medula óssea e produção de todas as células do sistema imune Fonte: http://doemedulaosseanojapao.wordpress.com/medula-ossea/ Imunologia Clínica 6 Figura 4 - Timo e sua estrutura • Os órgãos linfoides secundários ou periféricos (início das respostas imunes adaptativas e manu- tenção dos linfócitos) são: Linfonodos, Baço, Tonsilas e órgãos linfóides asso- ciados à mucosa (MALT) Sob o ponto de vista histológico, os linfonodos ou gân- glios linfáticos são órgãos encapsulados constituídos por tecido linfoide e que aparecem espalhados pelo corpo, sempre no trajeto dos vasos linfáticos (axila, virilha, gran- des vasos do pescoço, tórax e abdome). As principais linhagens de células que são maturadas nos órgãos linfoides secundários provêm da medula ós- sea: • Linfócitos B. • Linfócitos T. c) Outras células envolvidas na resposta imune • Fagócitos: células capazes de realizar a fagocitose, isto é, o seu citoplasma é capaz de rodear, captar e digerir partículas vizinhas. Os fagócitos consti- tuem um importante mecanismo de defesa contra as infecções bacterianas, pois intervêm na resposta imunitária não específica. Nos seres humanos, de- sempenham funções fagocitárias os macrófagos, os neutrófilos, as células dendríticas e os monócitos. • Células natural killer (NK): Também chamadas de células exterminadoras naturais, são definidas como células citotóxicas não específicas, importan- tes na resposta precoce às células tumorais e infec- ções virais. • Basófilose mastócitos: liberação de histamina nas reações alergoinflamatórias. Todas as células citadas (linfócitos B e T, fagócitos e NK) possuem funções bem definidas no sistema imune e arti- culam-se entre si na liberação de anticorpos ou no ataque direto ao antígeno. Dependendo da fase do estímulo, te- remos dois tipos de resposta imune (celular ou humoral), que veremos mais à frente. Fonte: http://www.infoescola.com/sistema-imunologico/timo/ Imunologia Clínica 7 Figura 5: Corte mostrando a estrutura de um linfonodo, que é sede na maturação de linfócitos B Fonte: http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/corpo-humano-sistemalinfatico/imagens/sistema-linfatico-10.jpg Imunologia Clínica 8 Figura 6 - Sistema linfático, mostrando órgãos que participam da resposta imune (medula, linfonodos e baço) Imunologia Clínica 9 Figura 7 – Linhagens de células linfocíticas a partir da medula Fonte: http://www.medicinanet.com.br/conteudos/acpmedicine/4548/orgaos_e_celulas_do_sistema_imunologico__john_r_david_e_cox_terhorst.htm Imunologia Clínica 10 Figura 8 – Diversas células responsáveis pela resposta imune e suas funções (quadro em vermelho) Fonte: http://imunologia96.wordpress.com/2013/01/05/aspectosgeraissobreimunologia2/ Figura 9 – Origem das células do sistema imune a partir das linhagens linfoide e mieloide Fonte: http://pathmicro.med.sc.edu/portuguese/immuno-port-chapter1.htm Imunologia Clínica 11 Mecanismos da Resposta Imune A importância do sistema imunológico para a saúde é dramaticamente ilustrada pela observação frequente de que indivíduos com respostas “imunológicas” defeituosas são suscetíveis a infecções graves, geralmente com risco de vida. Mas o impacto da Imunologia vai além das doen- ças infecciosas. Os elementos do sistema imune (células e media- dores químicos) têm a capacidade de diferenciar o que é próprio do organismo ou não. Isso é necessário para a proteção contra agentes patogênicos e também para a eli- minação de células anormais (ex.: células neoplásicas). Al- guns agentes infecciosos podem se multiplicar dentro das células (ex.: vírus), outros, fora delas, o que é o caso da maioria. Os componentes do sistema imunológico prote- gem o organismo contra os diferentes tipos de patógenos. Quando a virulência do patógeno é alta e/ou a imunidade do hospedeiro está comprometida, a doença pode se ins- talar. Apesar dos efeitos benéficos do sistema imune, as defesas imunológicas podem ser prejudiciais quando há uma resposta imunológica excessiva. Nesse caso, o pro- cesso inflamatório pode trazer muito desconforto para o indivíduo devido aos seus efeitos na alteração da fisiolo- gia celular e tecidual. Podemos também ter o “ataque” de células e tecidos do próprio corpo pelo sistema imunológico, causando res- posta inflamatória intensa. É o caso das doenças autoimu- nes. Figura 10: Diversas células e mediadores químicos envolvidos na resposta imune Fonte: http://www.nature.com/nrc/journal/v4/n1/fig_tab/nrc1252_F1.html Imunologia Clínica 12 Imunidade Inata ou Natural (Celular) É chamada imunidade inespecífica. Os elementos do sistema imune inato incluem barreiras anatômicas, mo- léculas de secreção e componentes celulares. Entre as barreiras mecânicas anatômicas, estão pele, saliva, ácido clorídrico do suco gástrico, pH vaginal, cerume do ouvido, muco e cílios das vias respiratórias, processo inflamató- rio, febre, células fagocitárias, movimento dos intestinos e oscilação dos cílios bronco-pulmonares. Associados a essas superfícies protetoras, estão agentes químicos e biológicos. É dita inespecífica pois não precisa existir um reconhecimento especifico dos antígenos para ocorrer a reação imunológica. O mecanismo não específico realiza a defesa do organismo por: a) Fagocitose: englobamento e destruição do antí- geno. b) Neutralização: inativação dos efeitos tóxicos do antígeno. c) Lise: ruptura da membrana ou da parede celular do antígeno. Figura 11 - Leucócito (neutrófilo) fagocitando uma bactéria Processo inflamatório: É sem dúvida um dos principais processos complexos da resposta imune inespecífica, que envolve vários com- ponentes celulares e moleculares e pode ocorrer todos os mecanismos citados acima (a, b e c). Ocorre uma intensa alteração na fisiologia local tissular, por vezes com altera- ções sistêmicas. Dependendo da magnitude da inflama- ção, o organismo passará por alterações locais que são bem pontuais e características: dor, calor, rubor, edema e disfunção no órgão. Figura 12 – Etapas do processo inflamatório No tecido lesionado, células como os mastócitos e os basófilos produzem substâncias químicas que atraem neutrófilos e monócitos, que se transformam em macró- fagos quando saem do sangue, vão para os tecidos e reali- zam fagocitose dos antígenos e de células mortas. A imunidade inata é principalmente mediada por célu- las especializadas. É por isso que podemos chamá-la tam- bém de imunidade celular. Características da resposta imune inata: • Tem como forte característica a resposta imedia- ta. • Patógenos são reconhecidos especificamente. Fonte: http://primeirobdi2012.blogspot.com.br/ Fonte: http://patofisio.wordpress.com/2010/04/20/inflamacao/ Imunologia Clínica 13 • Não é gerada memória imunológica. • Mesmo que o organismo tenha vários contatos com o mesmo agente patogênico, a resposta imu- nológica não muda. • O início da resposta adaptativa depende basica- mente da resposta inata. Imunidade Adaptativa ou Adquirida (Humoral) Pode ser chamada de específica pois necessita de um contato prévio com o agente patogênico por meio de uma exposição que aumenta a sua intensidade. É dotada de duas características muito importantes, que são a especi- ficidade e a memória. Produz os anticorpos que são secre- tados pelos linfócitos B. Tipos de respostas imunes específicas • Imunidade ativa: o indivíduo imunizado passa a ter um papel ativo no desenvolvimento da resposta imune (ex.: vacinação). • Imunidade passiva: o indivíduo torna-se imune sem nunca ter sido exposto a um dado antígeno. Recebe soro ou células de uma outra pessoa imuni- zada com o mesmo antígeno. • Imunidade humoral: Mediada pelos anticorpos. Imunologia Clínica 14 Classes de imunoglobulinas Anticorpos ou imunoglobulinas • São Proteínas (globulinas) formadas por 2 ca- deias leves e 2 cadeias pesadas; • Produzidas pelo linfócitos B ativados (plasmó- citos); • Podem permanecer sob a forma de receptores de superfícies celulares ou serem secretados; • De acordo com a cadeia pesada, distinguem-se 5 classes de anticorpos: Iga, IgD, IgE, IgG e IgM Estrutura Molecular das Imunoglobulinas São constituídas por cadeia leve e cadeia pesada, im- portantes no reconhecimento e na ligação com o antíge- no. Figura 13 – Estrutura molecular esquemática de um anticorpo mostrando as extremidades de ligações (ca- deias) às quais se liga o antígeno Características e Propriedades das Imunoglobulinas Cada molécula de imunoglobulina (Ig) é constituída por duas cadeias pesadas e duas cadeias leves ligadas por pontes dissulfeto (dois átomos de enxofre). As cadeias pe- Fonte: http://www.oocities.org/sssiqueira/basica7.htm Imunologia Clínica 15 sadas são quem definem as classes de imunoglobulina - IgA, IgG, IgD, IgE e IgM. As cadeias leves são de dois tipos, kappa (κ) e lambda (λ). A especificidade de ligação ao antígeno é definida pela porção variável (Fab) da molécula, constituída pela união das regiões variáveis das cadeias leve e pesada da imunoglobulina. O tipo de estrutura molecular e as propriedades características de cada classe de imunoglobulina podem ser vistas na tabela 1 abaixo. Tabela 1 - Características básicas das classes de imunoglobulinas Classe Estrutura Propriedades IgA Dimérica Encontrada em mucosas de trato gastrointestinal, respiratório e urogenital. Monomérica Previne colonização por patógenos. Presente também na saliva, lágrimas e leite. IgD Monomérica Imunoglobulinade membrana. Faz parte do receptor de membrana de linfócitos B virgens (BCR). IgE Monomérica Envolvida em processos alérgicos e parasitários. Sua interação com basófilos e mastócitos causa liberação de histamina. IgG Monomérica Principal imunoglobulina da imunidade adquirida. Tem capacidade de atravessar a barreira placentá- ria. IgM Monomérica Faz parte do receptor de membrana de linfócitos B virgens (BCR). Pentamérica Forma encontrada no soro, secretada precocemente na resposta imune adquirida. Nota: as imunoglobulinas M e G são bastante solicitadas nos imunoensaios (exames laboratoriais imu- nológicos) no diagnóstico de doenças inflamatórias e infecciosas, principalmente para verificar em que fase se encontra a doença: aguda (determinação de IgM) ou crônica (determinação da IgG), entre outras aplicações Em resumo, para ocorrer a imunidade adquirida ou adaptativa (mediação humoral), é necessário o estimulo da imunidade inata (mediação celular). Sendo assim, esses dois mecanismos de resposta imune estão interligados: Imunologia Clínica 16 • Comparações entre imunidade inata (celular) e imunidade adaptativa ou adquirida (humoral): Imunidade inata e imunidade adquirida Imunidade inata, natural ou inespecifica (celular): caracteriza-se por uma limitada capacidade de distinguir um microorganismo do outro: Não gera memória imunológica. Tem como principais componenetes: dústria farmacêutica e usados como medicamentos para diversas patologias que precisam de imunomoduladores, como a hepatite C. Imunidade adquirida, adaptativa ou específica (humoral): obtida durante a vida de um indivíduo como reação adaptativa à presença de patógenos adaptativos; em muitos casos, GERA memória imunológica. Tem como compo- nentes: Interferon Proteína produzida por certas células quando ataca- das por vírus ou outros parasitas intracelulares, que é li- berada na circulação e, ao se ligar à membrana de outras células, induz a produção de proteínas antivirais. É mui- to importante na resposta imune humoral às infecções virais. Existem três classes químicas: os interferons Alfa, Beta e Gama. Atualmente, eles são sintetizados pela in- Imunologia Clínica 17 Figura 14 – Estrutura cristalográfica do interferon beta Figura 15 – Liberação de interferon para intervir numa infecção viral Figura 16 - Gama Interferon sendo secretado por algu- mas células do sistema imune e a estimulação de outras células a partir da sua ação Fonte: http://svaleria68.blogspot.com.br/2011_04_01_archive.html Fonte: http://imunologando.blogspot.com.br/ Imunologia Clínica 18 Fonte: http://imunologando.blogspot.com.br/ Imunologia Clínica 19 Sistema Complemento Conceito e classificação O complemento é um dos mecanismos efetores mais importantes da resposta imune inata (natural). Quando um microrganismo penetra no organismo, normalmente provoca ativação do complemento. O sistema complemento no organismo é composto por varias proteínas, que funcionam de uma maneira ordena- da e integrada para defendê-lo contra infecções e produ- zir quadros de inflamação. São moléculas que compõem o sistema complemento: C1, C2, C4, C3, C5, C6, C7, C8 e C9. Na via alternativa de ativação do C, os componentes são denominados por letras: b, d e p. À medida que ocor- re a ativação, os fragmentos são gerados, sendo que os maiores recebem a denominação b e os menores, a, por exemplo, C4b e C4a. Figura 18 - Moléculas do sistema complemento (com- plement cascade) fazendo mediação de uma reação entre as células do sistema imune e célula antigênica (bactéria), culminando com sua lise As moléculas de proteínas do sistema complemento precisam ser ativadas para ocorrer as reações. Atividade Fisiológica ou Propriedades do Sistema Complemento: • É responsável por ampliar a resposta imunológica por meio de uma serie de reações enzimáticas, que deno- minamos de cascata. • Possui diversas vias para poder se ativar. • A resposta imune é regulada por proteínas que estão acopladas à membrana celular. Imunologia Clínica 20 Resposta Imunológica Mediada por Células (Imunidade Celular) A imunidade mediada por células é o ramo da resposta imunológica adaptativa cujo papel é combater infecções causadas por microorganismos intracelulares. Esse tipo de imunidade é mediada pelos linfócitos T. Ativação dos Linfócitos T Os linfócitos T representam quase 75% do total de lin- fócitos que estão no sangue. O timo é o órgão responsá- vel por sua ativação e maturação. A principal importância dessas células é a estimulação da imunidade celular. Os linfócitos T diferenciam-se em subpopulações que apre- sentam funções distintas no sistema imune: a) Os linfócitos T helper: são responsáveis pela di- ferenciação dos linfócitos B em plasmócitos (secre- tam anticorpos). b) Os linfócitos T supressores: são responsáveis pela finalização da resposta imune por intermédio da inibição da resposta celular e humoral. c) Os linfócitos T citotóxicos: são responsáveis pela destruição ou eliminação direta de células com in- fecção viral e células tumorais. Para isso, usam os mecanismos de: • Abertura de orifícios na membrana, cau- sando a lise celular. Esses orifícios são feitos pelas proteínas denominadas perforinas. • Indução da morte programada (apopto- se) das chamadas células-alvo (ex.: células neoplásicas). Figura 19 - Apresentação do antígeno pelo macrófago (tipo de fagócito) e ativação do linfócito T e sua diferenciação (T helper, T supressor, T citotóxico) Fonte: http://evunix.uevora.pt/~sinogas/TRABALHOS/2003/Diversidade.htm Imunologia Clínica 21 Resposta Imunológica Mediada por Anticorpos (Imuni- dade Humoral) Basicamente, é a resposta imune mediada pelos lin- fócitos B e outras células de sua linhagem (ex.: plasmóci- tos), que produzem anticorpos para eliminar patógenos e substâncias produzidas por esses patógenos. Faz parte da resposta imune adaptativa. Ativação de Linfócitos B e Produção de Anticorpos Essas células são ativadas por antígenos, proliferam e diferenciam-se em plasmócitos (células produtoras de an- ticorpos). As células B representam até 10% dos linfócitos do sangue. Nem todos se diferenciam em plasmócitos; nesse caso, dão origem às células B da memória imunitária, que reagem rapidamente a uma segunda exposição ao mes- mo antígeno. Figura 20 – Após ativação, linfócito B produz e libera os anticorpos Fonte: http://sanidadanimal.info/cursos/inmunologia3/ca022.htm Imunologia Clínica 22 Figura 21 – Origem e maturação de linfócitos B e T Fonte: http://bio12-ciencia.blogspot.com.br/2011/03/sistema-iimunitario-mecanismos-de.html Em resumo, o linfócito B precisa ser estimulado pelo linfócito T para se diferenciar e produzir anticorpos. Imunologia Clínica 23 Resposta Imune contra Tumores e Transplantes O câncer e os transplantes de órgãos são duas situa- ções clinicas em que o papel do sistema imune tem rece- bido uma grande atenção. As respostas imunes contra os tumores e transplantes compartilham várias características. Ambas são situações em que o sistema imune não responde aos micróbios, como habitualmente faz, mas às células não infecciosas que são percebidas como estranhas Mecanismos Imunes da Rejeição Tumoral O principal mecanismo imune da erradicação tumoral é matando as células tumorais por meio de linfócitos T ci- tolíticos (CTLs) específicos para os antígenos tumorais que irão destruí-las. Figura 22 – Célula tumoral sendo atacada por linfócitos T citotóxicos Mecanismos Imunes da Rejeição de Transplantes A rejeição é o reflexo da resposta imunológica aumen- tada (inicialmente local) envolvendo, na maioria das ve- zes, os antígenos HLA do órgão transplantado. Pode ser classificada como hiperaguda, aguda e crônica. No ser humano, o sistema HLA (Human Leukocyte An- tigen) está inserido no processo de reconhecimento das células. Sua maior importância é a proteção do organismo a injúrias do meio externo e também a regulação da res- postaimune. Teremos então a intervenção dos elementos clássicos de defesa, como o envolvimento de anticorpos, numero- sos mecanismos de regulação da resposta celular e citoci- nas, que modulam a intensidade da resposta. Fonte: http://www.ciencianews.com.br/unicel/1pg.htm Imunologia Clínica 24 Reações de Hipersensibilidade São reações imunológicas de respostas imunes varia- das. Vai depender do estímulo que o antígeno, neste caso chamado de alérgeno, provoca no organismo. O compo- nente clínico alergoinflamatório está presente e bem evi- dente. Podem ser provocadas por antígenos endógenos ou exógenos. Vejamos os tipos de reações: a) Tipo I - anafilática. b) Tipo II - citotóxica. c) Tipo III - doenças de imunocomplexos. d) Tipo IV - tardia. a) Hipersensibilidade tipo I ou anafilaxia: Características: • Os anticorpos IgE são o principal mediador imu- nológico. • Ocorre numa pessoa previamente sensibilizada pelo alérgeno (antígeno), por intermédio da combi- nação Ag-Ac, que está ligada a células especializa- das na reação (ex.: basófilos e mastócitos). • Pode ser fatal caso ocorra comprometimento do sistema respiratório (ex.: edema de de glote). • Pode ter efeitos locais (10% da população) ou, na maior parte, sistêmicos. b) Hipersensibilidade tipo II: A principal característica celular e molecular é a pre- sença do alérgeno aderido às células-alvo. Apresenta ba- sicamente os seguintes mecanismos: • Atuação do sistema complemento, que leva à lise celular. Pode ocorrer na Doença Hemolítica do Re- cém-Nascido (DHRN) ou em reações causadas pe- los efeitos de medicamentos. • Ativação da resposta de citotoxidade celular me- diada por anticorpos. • Anticorpos fazem mediação contra receptores localizados na membrana celular, causando distúr- bios na regulação da fisiologia celular. c) Hipersensibilidade tipo III: • A principal característica é a mediação por com- plexo antígeno-anticorpo. Os assim chamados imu- nocomplexos são responsáveis por ativar as prote- ínas do sistema complemento. A reação pode ser local ou sistêmica, e o antígeno (alérgeno) pode ter origem interna (do próprio corpo) ou externa. A reação denominada de Arthus é caracterizada por morte tecidual ou inflamação nos vasos em região loca- lizada por ataque de imunocomplexos nessa área. Pode ser grave. d) Hipersensibilidade localizada tipo IV: A principal característica é a mediação dos linfócitos T previamente sensibilizados. Temos dois tipos de meca- nismos: Tardia: • As citocinas que são liberadas pelos linfócitos T CD4 são responsáveis pela maioria dos efeitos. • Presença de aglomerados celulares em alguns tecidos, em especial o subcutâneo, que provocam hiperemia e edema. • Pode ocorrer Inflamação do tipo granulomatosa (aglomerados de células epitelioides com a presen- ça de linfócitos em volta). • Citotoxidade Direta: Neste caso, as principais células mediadoras são os linfócitos T CD8, que promovem a eliminação das células que estão apresentando os antígenos. Imunologia Clínica 25 Figura 23 – Alérgeno estimulando a resposta imune de hipersensibilidade Fonte: http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=Hipersensibilidade+Tardia&lang=3 Imunologia Clínica 26 Tolerância Imunológica e Autoimunidade Quando o indivíduo é incapaz de ter uma resposta imune a um antígeno específico, dizemos que ele tem to- lerância imunológica. Pode ocorrer da seguinte forma: • Perda de linfócitos B e T durante o processo de maturação, por intermédio do que chamamos de- leção clonal. • Inativação dos linfócitos promovida por antíge- nos, o que é chamado isso de anergia clonal. Autotoimunidade caracteriza-se pela falta de reconhe- cimento do que é próprio do organismo. Com isso, ocorre o ataque dos componentes do sistema imune (citocinas e células) dirigidas a uma variedade de tecidos no organis- mo, causando lesões e disfunções. Características básicas: • Resposta imunológica a antígenos próprios (autó- logos). • Formação de anticorpos contra estruturas celula- res do próprio organismo. • Aparecimento de doença autoimune causada pela falha da autotolerância, com consequente le- são celular e tecidual. Figura 24 - Consequências do encontro dos linfócitos com os antígenos Fonte : http://www.ebah.pt/content/ABAAAfjacAH/tolerancia-imunologica Imunologia Clínica 27 Doenças Causadas pela Resposta Imune Defeituosa Mecanismos Gerais Ocorre devido a resposta imunológica voltada contra as moléculas (antígenos autólogos) e células do próprio individuo. É causada pela falha da autotolerância, na qual autoanticorpos e células reativas provocam lesões celula- res e teciduais. Alguns fatores podem colaborar com a formação da autoimunidade. São eles: • Anormalidades nos linfócitos e na apresentação dos antígenos endógenos causa falha na autotole- rância central ou periférica. • Infecções e até mesmo características genéticas podem predispor. Etiopatogênese primária das doenças autoimunes: As alterações tissulares são mediadas pelas citocinas liberadas. Estas promovem o processo inflamatório, que aumenta o fluxo de linfócitos para o local, e com isso ocor- re a apresentação do antígeno próprio pelas células que foram ativadas. Figura 25 - Formação de lesão tecidual por falha na autotolerância Fonte : http://www.ebah.pt/content/ABAAAfjacAH/tolerancia-imunologica Imunologia Clínica 28 Imunopatogênese das Doenças Autoimunes Imunopatologia – É a ciência que estuda as lesões e doenças produzidas pela resposta imunitária. Imunopatogênese - É o processo de desenvolvimento de doenças por mediação imunológica. Doenças Autoimunes – São causadas pela resposta imune defeituosa. O sistema imunológico não reconhece determinados grupos celulares e, a partir daí, trata-os como estruturas estranhas, passando a atacá-las e produzindo autoanti- corpos. De acordo com o número de órgãos afetados, as doen- ças autoimunes se classificam da seguinte forma: a) Órgão-específica – ocorre a expressão da autoi- munidade de maneira restrita em alguns órgãos, com alta especificidade. Ex.: vitiligo > melanócitos (células que produz a melanina). b) Sistêmica – neste caso, vários tecidos e órgãos do corpo podem ser atingidos pelos autoanticorpos. Ex.: lúpus eritematoso sistêmico (LES) > coração, rins, pulmão e outros. Algumas doenças de etiologia autoimune: • Tireoidite de Hashimoto. • Síndrome de Sjogrenn. • Artrite reumatóide. • Anemia hemolítica. • Pênfigo. • Síndrome de Guillain-Barré. • Miastenia grave. • Lúpus sistêmico. • Diabetes tipo I. • Doença de Crohn. • Esclerose múltipla. • Vitiligo. • Esclerodermia. • Doença celíaca. Figura 26 – Numerosas lesões necrosadas e crostosas em pele e mucosas (pênfigo vulgar) Fonte: http://alinepsicoblog.blogspot.com.br/2012/07/penfigo-foliaceo-ou- fogo-selvagem.html Imunologia Clínica 29 Figura 27 – Modelo celular e molecular no desenvolvimento de uma doença autoimune (autoimunopatogênese) Fonte: http://imunologia96.files.wordpress.com/2013/01/fig-3-3-modelo-da-doenc3a7a-nodesenvolvimento-de-uma-doenc3a7a-auto-imune.jpg Imunologia Clínica 30 Unidade II – Imunologia Aplicada Fundamento dos Métodos Imunológicos no Diagnóstico Laboratorial Considerações Gerais Os métodos imunológicos diretos ou indiretos tem sido amplamente utilizados para suprirem as deficiências dos métodos parasitológicos ou microbiológicos na pes- quisa de antígenos, anticorpos ou imunocomplexos por sua rapidez, simplicidade de execução, possibilidade de automação e baixo custo operacional. O conhecimento da aplicação dos testes sorológicos e a interpretação correta dos resultados obtidos é fundamental para os clínicos, pa- tologistas e analistas clínicos. Importância dos testes sorológicos na Patologia Clíni- ca: • Elucidar processos patologicos com sintomas e si- nais clínicos confundíveis. • Diferenciar a fase da doença (aguda ou crônica). • Diagnosticar doença congênita. • Selecionar doadores e receptores de órgãos para transplantes. •Avaliar a evolução e o prognóstico da doença. • Avaliar a eficácia da terapêutica ou sua suspen- são. • Avaliar a imunidade ativa específica naturalmente adquirida ou artificialmente induzida (vacinas). • Verificar o agravamento da doença. Caracteristica das Reações Antígeno-Anticorpo (Ag – Ac) As principais caracteristicas das reações Ag – Ac são a especificidade e a sensibilidade. A especificidade de um imunoensaio é definida pela percentagem de resultados negativos pelo teste nos individuos não doentes, ou seja, a proporção dos verdadeiros negativos, e pode ser influen- ciada por inúmeros fatores que levam a resultados falso- -positivos (anticorpos heterófilos > reações cruzadas). Figura 28 – Reação “chave-fechadura” da ligação Ag - Ac A sensibilidade de um imunoensaio refere-se à porce- tagem de resultados positivos pelo teste na população de doentes, ou seja, a proporção de resultados verdadeira- mente positivos, evitando os falsos-negativos. A alta sen- sibilidade de um teste diminui a janela imunológica de uma doença. A janela imunólogica compreende o perío- do em que a infecção se instala e o organismo começa a produzir anticorpos suficientes para ser detectados num imunoensaio. Fonte: http://cienciasnamosca.wordpress.com/category/outros-materiais/ page/4/ Imunologia Clínica 31 Figura 29 – Janela imunológica na infecção pelo vírus da hepatite C e variedades de testes imunológicos no diag- nóstico laboratorial precoce Fonte: http://www.biomedicinapadrao.com/2011/10/nucleic-acid-technologies-nat.html Um exemplo na figura 25 é que a escolha de um teste de terceira geração de EIA (enzimaimunoensaio) detecta os anticorpos anti-HCV mais precocemente (70 dias) que o teste de EIA de primeira geração (150 dias). O fato de ter o teste mais aprimorado (de terceira geração ção) aumen- ta a sensibilidade e diminui a janela imunológica. Testes não muito sensíveis para determinadas reações são um problema, pois aumentam o periodo da janela imunológica, prejudicando o diagnóstico precoce de uma doença. Essas duas caracteristicas, sensibilidade e especificida- de, são importantes pois podem influenciar diretamente num resultado confiável. Porém temos outros parametros que devem ser verificados para validação de um teste as- sim como em todo ensaio laboratorial: • Precisão. • Acurácia e exatidão. • Reprodutibilidade. Imunologia Clínica 32 Técnicas mais Utilizadas A maioria das técnicas laboratoriais que são feitas de rotina na área de pesquisa ou diagnóstico são funda- mentadas seguindo metodologias que consideram o uso de antígenos e anticorpos. O uso de anticorpos depende da habilidade que eles têm em se ligar especificamente com o antígeno para produzir complexos imunológicos, em soluções ou em géis, que podem ser verificados em inúmeros métodos óticos e que atualmente podem ser automatizados. A automação na área da imunologia no laboratório clí- nico também é uma realidade, devido à necessidade de resultados mais rápidos pelo aumento da demanda de solicitações de exames para elucidar diagnósticos, bem como pelo aparecimento de novas técnicas que permitem resolver casos que antes não se conseguia solucionar. A seguir, mencionaremos as técnicas imunológicas/ sorológicas que são utilizadas com frequência nos labo- ratórios clínicos. Reação de Precipitação Baseia-se na quantificação de precipitados resultantes da reação antígeno-anticorpo. Esse precipitado formado depende de alguns fatores físico-quimicos e, neste caso, de fatores imunológicos também. As concentrações do antígeno e do anticorpo influenciam na formação e na quantidade de precipitados formados. Se a quantidades de antígeno e de anticorpos se equi- valem, chamamos isso de região de equivalência. Ocorre- rá uma máxima precipitação, que decresce quando existe excesso de anticorpos ou de antígenos. Uma reação que pode ocorrer quando temos excesso de anticorpos na amostra analisada é o efeito ou fenômeno de prozona, que pode comprometer a interpretação dos resultados. Nesse caso, podemos eliminar esse interferente realizan- do uma titulação na amostra com quantidades fixas de antígeno para evitar tais erros. Figura 30 - Amostras positivas num imunoensaio utili- zando a técnica de precipitação Reação de Aglutinação Essa reação caracteriza-se pela formação de agregados bem visíveis como resultado da interação de anticorpos específicos com partículas insolúveis que contêm deter- minantes antigênicos em sua superfície. O processo de aglutinação é feito tanto com partícu- las que apresentam determinantes antigênicos naturais em sua superfície. Esses determinantes antigênicos são substâncias (proteínas, lipídios e outros) provenientes de protozoários, hemácias ou partículas inertes como látex, poliestireno, bentonita, e outros, às quais se adsorvem ou se fixam antígenos solúveis. No primeiro caso, a reação é dita aglutinação direta, e no segundo, aglutinação indireta ou passiva. Agregados visiveis > Ensaio positivo Fonte: http://drugline.org/medic/term/test-vdrl/ Imunologia Clínica 33 Figura 31 – Esquema de aglutinação de hemáceas (he- maglutinação) Exemplo de exame: Teste de Coombs indireto – Quando uma amostra de soro tem anticorpos que foram formados contra um eritrócito e o analista quer se assegurar de que também vai detectar anticorpos não aglutinadores potenciais na amostra, é realizado o teste de Coombs Indireto. Esse teste é realizado incubando os eritrócitos com a amostra de soro. Depois, lava-se várias vezes com solução salina para retirar quaisquer anticorpos não ligados e por fim é adicionado um soro anti-imunoglobulina para fazer ligação cruzada com as células.Fonte: http://www.aprenda.bio.br/portal/?p=4139 Figura 32 – Etapas no ensaio imuno-hematológico de Coombs indireto Fonte: http://www.biomedicinapadrao.com/2011/02/teste-de-coombs-indireto.html Imunologia Clínica 34 Podemos realizar os testes de aglutinação em placas, tubos ou lâminas. Caso o soro possua uma quantidade elevada de títulos de anticorpos aglutinantes, podemos nos deparar com o fenômeno de prozona, obtendo-se re- sultados falsos-negativos. Esse efeito é eliminado empre- gando-se diluições no soro, como dito anteriormente no item 2.1. Reação de Imunodifusão A reação de difusão tem como principal característica a solubilidade da substância que está sendo analisada em um meio gelatinoso ou fluido. É um processo pelo qual ocorre o transporte da subs- tância em questão de uma parte para outra, resultante do movimento molecular ao acaso. Pode ser feita em meio gelificado, que impede a formação de correntes devido às diferenças de temperatura. Se, por acaso, os poros do gel são maiores do que o tamanho das partículas, a difusão deve ser realizada em meio liquido ou fluido. Figura 34 – Imunodifusão sendo usada para o diagnós- tico de uma micose sistêmica (coccidiodomicose) Fonte: http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1806- -37132009000300013&script=sci_arttext A imunodifusão detecta a reação antígeno-anticorpo pela produção de precipitados. Podemos classificar a téc- nica como: imunodifusão simples ou imunodifusão dupla. Na simples, ou o anticorpo, ou o antígeno estão fixados ao suporte, e o outro difunde-se até ocorrer a precipitação do complexo Ag-Ac. Na imunodifusão dupla, os dois, an- tígeno e anticorpo, deslocam-se um em direção ao outro até aparecer a precipitação como resultado da interação. Figura 33 – Aglutinação do sangue em làmina em teste de grupo sanguíneo ABO e fator Rh. O primeiro teste do seu lado esquerdo é positvo para o grupo A Fonte: http://criatividadeeciencia.blogspot.com.br/2012/08/tipagem-sanguinea- professorarosane.html Imunologia Clínica 35 Figura 35 - O diâmetro do anel da reação positiva é proporcional ao log da concentração do antígeno Reação ou Ensaio Imunoenzimático (EIA ou ELISA) Dentre as técnicas que utilizam enzimas, destacamos as reações imunoenzimáticas que se baseiam na utiliza-ção de antígenos ou anticorpos marcados com essas en- zimas e permitem a detecção, titulação e quantificação de substâncias de interesse clínico. A principal delas é o ELISA, que veremos a seguir. ELISA (Enzyme Linked Immuosorbet Assay) Foi desenvolvido como uma alternativa ao teste que era largamente usado para a detecção de antígenos e an- ticorpos, o chamado radioimunoensaio. O princípio bá- sico do ELISA é a imobilização de um dos reagentes em uma fase sólida (placa), enquanto outro reagente é ligado a uma enzima, com preservação da atividade enzimática e da atividade imunológica do anticorpo. O teste pode de- tectar quantidades pequenas de antígenos ou anticorpos Fonte: http://pathmicro.med.sc.edu/portuguese/13.GIF e tem elevada precisão se os reagentes e os parâmetros do teste forem bem padronizados. No final do processo, o resultado positivo é revelado pela cor. Figura 36 – Etapas na reação de ELISA Ensaio Imunoenzimático - ELISA • Primeiro exame aplamente empregado para diag- nóstico; • Alta sensibilidade (triagem) acima de 98%; Método • Baseia-se na ligação do anticorpo (soro) com o antígeno da placa USANDO ENZIMA Ag sintético Proteínas recombinantes Próprio vírus inativado Reação de Imunoblot (WesternBlot) Este método é amplamente usado para confirmar os resultados obtidos em testes imunoenzimáticos (ex.: ELISA). Usamos antígenos obtidos de cultura de celular, separados por eletroforese em bandas distintas, que são posteriormente transferidas para uma membrana de ni- Fonte: http://www.liaccentralsorologica.com.br/noticias_chagas.html Imunologia Clínica 36 trocelulose. A reação ocorre no contato dos antígenos presentes no teste com os anticorpos, que estão presentes na amostra. ImunoBlot - Western Blot Cultivo em células o agente viral > proteínas (antígenos) do agente etiológico são fracionadas de acordo com seu peso molecular (eletroforese) > as proteínas separadas são eletrotransferidas do gel para membrana de Nitrocelulose. Detecta Acs quando presentes em soro ou plasma humano. A posição das bandas na tira permite que a reatividade desses Acs seja associada com antígenos virais específicos. Figura 37 – Fita de nitrocelulose mostrando positividade para os antígenos presentes na estrutura do HIV - Wester- nBlot positivo para HIV Fonte: http://www.bio-rad.com/prd/en/US/CDG/PDP/M4T5SX15/GS-HIV-1-Western-Blot Reação de Imunofluorecência O teste de imunofluorescência fundamenta-se na capacidade de ligação das moléculas de anticorpo com substâncias fluorescentes denominadas de fluorocromos de forma covalente, sem perder a especificidade com o antígeno. É muito usado no diagnóstico laboratorial para diver- sas condições clinicas. Pode ser dividido em: Imunofluorescência Direta (IFD) Este é empregado na pesquisa e na localização de antí- genos aderidos à superfície celular ou em tecidos. Baseia- -se na ligação direta de um anticorpo específico marcado com fluorocromo, formando o conjugado. O conjugado fixa-se ao antígeno e forma um complexo estável. Imunologia Clínica 37 O anticorpo que não é ligado pode ser removido por lavagens, e o preparado é observado em microscópio específico, chamado de microscópio de fluorescência. Empregamos este teste na pesquisa de vários patogenos como: Treponema pallidum, Escherichia coli, algumas es- pécies de estreptococos ß-hemolítico do grupo A Figura 38 – Esquema da reação de imunofluorescência direta Fonte: http://pathmicro.med.sc.edu/portuguese/20. GIF 2.6.2 Imunofluorescência Indireta (IFI) Empregamos o teste de imunofluorescência indireta para amplificar o sinal, aumentando assim a sensibilidade do teste. Podemos usar a IFI na pesquisa tanto de antíge- nos como na de anticorpos. Figura 39 – Fluorescência mediada pela presença de antígenos no parasita que é observado em microscopia de fluorescência Figura 40 - Representação esquemática da reação de IFI positiva Radioimunoensaio (RIA) O Radioimunoensaio é um dos métodos mais sen- síveis para a análise quantitativa das reações antígeno- -anticorpo, permitindo medidas rápidas e precisas; mes- mo em preparações não purificadas, apresenta limiar de detecção da ordem de nanogramas ou picogramas. O Radioimunoensaio pode ser utilizado para quantificar hormônios, drogas, marcadores tumorais, alérgenos e an- ticorpos e antígenos em doenças parasitárias. Há muitas variações, mas o princípio é o mesmo: a quantidade de reagente marcado (antígeno ou anticorpo quantifica o an- tígeno ou anticorpo não-marcado na amostra a) Radioimunoensaio Direto No Radioimunoensaio direto, uma quantidade fixa e li- mitada de anticorpo é ligada a um suporte sólido. Adicio- na-se uma quantidade fixa e pequena de antígeno mar- cado, misturada com uma amostra em teste ou com as soluções padrão que contêm concentrações conhecidas do antígeno não-marcado. Após um período de incuba- ção, remove-se o antígeno não ligado e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida. b) Radioimunoensaio de competição No Radioimunoensaio de competição, uma quantida- de fixa do antígeno é imobilizada em um suporte sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa de anticorpo marcado Fonte: ht tp:/ /www. labvw.com.br/2008/mater ia l_c ient i f i co/novos/ Imunoensaios%20Natalia%20Witzke%20Testoni.pdf Fonte: http://www.liaccentralsorologica.com.br/noticias_chagas.html Imunologia Clínica 38 específico, misturada com a amostra em teste ou uma série de soluções padrão com concentrações variadas do antígeno solúvel. Após um período de incubação, o anti- corpo marcado que não se ligou à fase sólida e o antígeno solúvel são removidos por lavagem e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida. c) Radioimunoensaio de captura No Radioimunoensaio de captura, uma quantidade fixa de anticorpo é imobilizada em um suporte. A solução teste, com quantidade desconhecida de antígeno, ou as soluções padrão, com concentrações conhecidas do an- tígeno são adicionadas. Após a incubação, remove-se o antígeno não-ligado e adicionam-se anticorpos marcados específicos para o antígeno, com sítio de ligação diferente do sítio do anticorpo de fase sólida. O anticorpo marcado não-ligado é removido por lavagem e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida. As principais limitações desse tipo de imunoensaio são: o custo do teste, a vida média dos reagentes e prin- cipalmente o risco operacional, pois se manuseia elemen- tos radioativos. Figura 41 - Manipulação de substâncias radioativas para a realização do RIA Figura 42 - Representação esquemática da reação de RIA (Geral) Fonte:http://www.psychemedics.com.br/exame-toxicologico/nossa- tecnologia-riah/ Fonte: http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=Radioimunoens aio&lang=3 Imunologia Clínica 39 Figura 43 - Variação de RIA este junto com o EIA – etapas do chamado “ensaio sanduíche“ É importante lembrar que todas as etapas de um imunoensaio precisam ser realizadas de forma criteriosa para evitar resultados duvidosos ou inconclusivos. Fonte: http://elseviersaude.com.br/ciencias-basicas/tcnicas-de-laboratrio-abbas-imunologia/ Imunologia Clínica 40 Referência ABBAS, Abul K.; LICHTMAN, Andrew H. Imunologia bási- ca: funções e disturbios do sistema imune. 1ª ed. Rio de Janeiro: Revinter, 2003. ________. Imunologia Celular e Molecular. 6ª ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2007. FERREIRA, Antonio Walter; ÁVILA, Sandra do Lago Mora- es. Diagnóstico laboratorial das principais doenças infecciosas e Autoimunes. 1ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001. MARZOCCO, Anita; TORRES, Bayardo b. Bioquímica bási- ca. 1ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007. KAUMON, Pietre; LAVOINNE, Alain; DE VERNEUIL, Hubert. Bioquímica e biologia molecular. 2ª ed. Rio de Ja- neiro: Guanabara Koogan, 2006.
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