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CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIA Estudos pré-clínicos e clínicos no desenvolvimento de uma vacina de DNA recombinante contra o vírus HIV, tipo HIV-1 Discente: Giovanna Cardoso Amui Docente: Luiz da Silveira Neto Gurupi-TO Julho de 2018 CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIA Estudos pré-clínicos e clínicos no desenvolvimento de uma vacina de DNA recombinante contra o vírus HIV, tipo HIV-1 Trabalho apresentado para conclusão de disciplina de Vacinologia do curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia, da Universidade Federal do Tocantins, Campus de Gurupi. Gurupi-TO Julho de 2018 SUMÁRIO 1 JUSTIFICATIVA E IMPORTÂNCIA 2 1.1 AIDS 2 1.2 Epidemiologia global e no Brasil 2 1.3 Classificação e características do HIV 4 1.4 Resposta imune contra o HIV 6 1.5 Tratamentos disponíveis no mercado 6 1.6 Proposta do projeto 7 2 ESTUDOS PRÉ-CLÍNICOS 8 2.1 Isolamento do patógeno 8 2.2 Síntese do cDNA 8 2.3 Sequenciamento dos cDNAs isolados 9 2.4 Predição de epítopos, amplificação e clivagem do cDNA 9 2.5 Recombinação do DNA e seleção do vetor 10 2.6 Seleção do adjuvante 10 2.7 Formulação vacinal 11 2.8 Testes in vitro 11 2.9 Modelo e obtenção dos animais 12 2.10 Testes in vivo 12 3 ESTUDOS CLÍNICOS 13 3.1 Fase 1 13 3.2 Fase 2 14 3.3 Fase 3 14 3.4 Fase 4 14 REFERÊNCIAS 15 �1 1 JUSTIFICATIVA E IMPORTÂNCIA 1.1 AIDS A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (Acquired Immunodeficiency Syndrome - Aids) é uma doença infecciosa pandêmica que tem como responsável o Vírus da Imunodeficiência Humana (Human Immunodeficiency Virus - HIV). Este vírus foi identificado em 1983 no Instituto Pasteur de Paris pelo Dr. Luc Montagnier, e causa uma diminuição significativa dos linfócitos TCD4+, que são células de extrema importância no sistema imunológico. Devido aos seus efeitos no sistema imunológico o vírus abre portas para que agentes infecciosos “oportunistas” desenvolvam infecções descontroladas que podem levar à morte em muitos casos. Este vírus possui um período de incubação longo, podendo levar em media 8 a 10 anos para desenvolver a doença propriamente dita (Aids) após a infecção viral primaria, com exceções de casos em que a mesma pôde ser identificada com 2 ou ate 12 anos pós infecção (SILVA, 2008). O vírus HIV pode ser adquirido através de relações sexuais desprotegidas ou do contato com sangue ou hemoderivados infectados, alem da transmissão vertical entre mãe e filho (a) durante a gestação, ao nascer ou ao amamentar (Marcello, 2006). 1.2 Epidemiologia global e no Brasil Nos últimos anos as pesquisas para obtenção de cura/tratamento/vacina contra Aids tem aumentado cada vez mais, aumentando o conhecimento em relação aos mecanismos do vírus assim como de terapias e prevenções contra a infecção do mesmo. Apesar dos avanços ja atingidos o numero de pessoas infectadas com HIV no mundo ainda é exorbitante. De acordo com The United Nations Joint Programme on HIV/AIDS (UNAIDS) em seu resumo informativo mais recente, desde o início de sua epidemia, o HIV infectou entre 65,2 e 88 milhões de pessoas, tendo sido contabilizadas aproximadamente 35 milhões de mortes por causas relacionadas à AIDS desde então. Em 2016 foram contabilizadas entre 30,8 e 42,9 milhões de pessoas vivendo com HIV em todo o mundo, sendo 1,8 milhão dessas, novas infecções no mesmo ano. Dos infectados no mundo aproximadamente 94% são adultos, e dentro desses 51% são adultos do sexo masculino. Na África Oriental e Austral aproximadamente 19,4 milhões de pessoas foram reportadas como portadoras do vírus HIV em 2016 (sendo 59% delas mulheres e meninas), �2 representando 43% das infecções globais. Na África Central e Ocidental havia 6,1 milhões de pessoas vivendo com HIV em 2016, sendo 56% das mesmas do sexo feminino. Na Ásia e no Pacífico cerca de 5,1 milhões de pessoas viviam com HIV, enquanto na Ásia central e Leste Europeu havia aprox. 1,6 milhão de pessoas com HIV em 2016. Na America Latina foram contabilizadas 1,8 milhão de pessoas vivendo com HIV em 2016 (UNAIDS, 2017). Entre 2007 e 2017 mais de 190.000 casos de infecção por HIV foram notificadas, sendo a maioria na Região Sudeste com 49,7% dos infectados e a minoria na Região Centro- Oeste com 6,7% dos infectados. Aproximadamente de 68% dos casos de infecção por HIV no Brasil nos últimos 10 anos foram em pessoas do sexo masculino. Foi observado também, neste período, que cerca de 52% dos infectados estão entre 20 e 34 anos, e com relação a raça/ cor a diferença é de apenas 4%, estando os negros e pardos à frente. Desde o início da epidemia ate 2017 foram contabilizados 882.810 casos de pacientes que desenvolveram Aids no Brasil, tendo uma media de 40 mil novos casos por ano, nos últimos 5 anos. A maioria dos indivíduos com Aids no Brasil esta entre 25 e 39 anos, sendo a leve maioria do sexo masculino. Ao comparar-se os dados no Brasil entre 2006 e 2016 pode-se observar que a taxa de detecção da Aids em homens chega ate a ser 3 vezes maior do que em mulheres, porem houve uma baixa na detecção na maioria das faixas etárias para ambos os sexos (Figura 1) (BRASIL, 2017). A �3 12 Vol me − oletim Epidemiológico Secretaria de Vigilância em Saúde − Ministério da Saúde − Brasil A maior concentração dos casos de aids no Brasil está nos indivíduos com idade entre 25 e 39 anos, em ambos os sexos. Os casos nessa faixa etária correspondem a 52,9% dos casos do sexo masculino e, entre as mulheres, a 49,0% do total de casos registrados de 1980 a junho de 2017 (Tabela 16). Quando comparados os anos de 2006 e de 2016, observam-se reduções nas taxas de detecção entre os indivíduos com até 14 anos de idade, em ambos os sexos. Nas demais faixas etárias, a taxa de detecção entre os homens é superior, sendo até três vezes maior do que entre as mulheres no último ano para as faixas etárias de 20 a 24 e de 25 a 29 anos (Tabela 17 e Figura 9). Figura 9 – Taxa de detecção de aids (/100 mil hab.) segundo faixa etária e sexo. Brasil, 2006 e 2016a. a Casos notificados no Sinan e Siscel/Siclom até 30/06/2017; no SIM, de 2000 a 2016. Fonte: Sinan (atualizado em 30/06/2017). Entre os homens, nos últimos dez anos, observou-se um incremento da taxa de detecção entre aqueles de 15 a 19 anos, 20 a 24 anos, 25 e 29 anos e 60 anos e mais. Destaca-se o aumento em jovens de 15 a 19 anos e de 20 a 24 anos: do ano de 2006 para o de 2016, a taxa quase triplicou entre o primeiro grupo e, entre os de 20 a 24 anos, a taxa mais que duplicou. Mesmo com esses aumentos observados, a maior taxa de detecção em 2016 permaneceu entre os indivíduos na faixa etária de 35 a 39 anos: 49,4 casos/100.000 habitantes, 21,5% menor do que a observada em 2006 (Tabela 17 e Figura 10). 2, 4 16 ,0 41 ,1 55 ,1 62 ,9 62 ,0 50 ,4 37 ,3 28 ,2 10 ,8 6, 7 33 ,9 48 ,3 47 ,7 49 ,4 44 ,2 40 ,2 33 ,8 26 ,7 12 ,9 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 15 a 19 anos 20 a 24 anos 25 a 29 anos 30 a 34 anos 35 a 39 anos 40 a 44 anos 45 a 49 anos 50 a 54 anos 55 a 59 anos 60 e mais Ta xa d e de te cç ão (x 10 0 m il ha b. ) 2006 2016 Figura 10 – Taxa de detecção de aids (/100 mil hab.) em homens, segundo faixa etária e sexo, Brasil. 2006 e 2016a. a Casos notificados no Sinan e Siscel/Siclom até 30/06/2017; no SIM, de 2000 a 2016. Fonte: Sinan (atualizado em 30/06/2017). 2006 3,6 1,6 1,1 3,6 13,7 30,5 37,2 34,6 34,4 30,0 21,7 15,6 5,6 3,6 1,6 0,9 2,4 16,0 41,1 55,1 62,9 62,0 50,4 37,3 28,2 10,8 75,0 60,0 45,0 30,0 15,0 0,0 15,0 30,0 45,0 60,0 75,0 < 5 5 a 9 10 a 14 15 a 19 20 a 24 25 a 29 30 a 34 35 a 39 40 a 44 45 a 49 50 a 54 55 a 59 ≥ 60 Mulheres Homens Faixa Etária Taxa de detecção (x100 mil hab.) 2016 2,6 0,5 0,5 4,1 10,2 15,0 19,6 23,4 24,1 20,5 17,4 13,6 6,4 2,1 0,4 0,3 6,7 33,9 48,3 47,7 49,4 44,2 40,2 33,8 26,712,9 75,0 60,0 45,0 30,0 15,0 0,0 15,0 30,0 45,0 60,0 75,0 < 5 5 a 9 10 a 14 15 a 19 20 a 24 25 a 29 30 a 34 35 a 39 40 a 44 45 a 49 50 a 54 55 a 59 ≥ 60 Mulheres Homens Faixa Etária Taxa de detecção (x100 mil hab.) B Figura 1 A e B: Taxa de detecção de aids (/100 mil hab.) segundo faixa etária e sexo no Brasil em 2006 e 2016 (BRASIL, 2017). 1.3 Classificação e características do HIV O HIV é um retrovírus do genero Lentivirus e a maioria das suas características físico- químicas indicam pertencimento a família Retroviridae. O mesmo possui um nucleoide cilíndrico em vírion maduro, e essa é a característica que o diferencia morfologicamente (JAWETZ, et al, 2007). No presente momento dois diferentes agentes etiológicos do HIV foram identificadas, o HIV-1 e o HIV-2. O HIV-2 é endêmico na Africa Ocidental enquanto o HIV-1 é o grande responsável pela epidemia mundial. O HIV-1 é reportado como sendo mais virulento e transmissível que o HIV-2, pois o segundo é conhecido por ter um longo período de latência, podendo levar a um desenvolvimento tardio da doença (TOURE-KANE, et al., 2000; WIGG, 2008). Dentro do tipo HIV-1 há quatro subgrupos chamados de M (main/major), O (outlier), N (new ou non-M/non-O) e o Grupo P (LAL, CHAKRABARTI, YANG, 2005; PLANTIER, et al., 2009). A maior parte das cepas do HIV-1 se encontram dentro do grupo M, que e o principal e de maior importância, por ser considerado o responsável pela pandemia mundial, e é subdividido em nove subgrupos referenciados pelas letras A, B, C, D, F, G, H, J e K, sendo que os subgrupos A e F se subdividem em subsubgrupos A1, A2, F1 e F2 (PERRIN L., KAISER L., YERLY S., et al, 2003; SANTOS, ARAÚJO, GALVÃO-CASTRO, ALCANTARA, 2009; PINTO, STRUCHINER, 2006). O grupo O não possui ramificações conhecidas, e esta limitado à Africa central e ocidental, assim como o grupo N, ele representa poucos casos de infecção. Ja o grupo P esta relacionado a uma nova variante do vírus que foi encontrada em apenas uma mulher ate hoje (SIMON, MAUCLÈRE, ROQUES et al, 1998). �4 12 Vol me − oletim Epidemiológico Secretaria de Vigilância em Saúde − Ministério da Saúde − Brasil A maior concentração dos casos de aids no Brasil está nos indivíduos com idade entre 25 e 39 anos, em ambos os sexos. Os casos nessa faixa etária correspondem a 52,9% dos casos do sexo masculino e, entre as mulheres, a 49,0% do total de casos registrados de 1980 a junho de 2017 (Tabela 16). Quando comparados os anos de 2006 e de 2016, observam-se reduções nas taxas de detecção entre os indivíduos com até 14 anos de idade, em ambos os sexos. Nas demais faixas etárias, a taxa de detecção entre os homens é superior, sendo até três vezes maior do que entre as mulheres no último ano para as faixas etárias de 20 a 24 e de 25 a 29 anos (Tabela 17 e Figura 9). Figura 9 – Taxa de detecção de aids (/100 mil hab.) segundo faixa etária e sexo. Brasil, 2006 e 2016a. a Casos notificados no Sinan e Siscel/Siclom até 30/06/2017; no SIM, de 2000 a 2016. Fonte: Sinan (atualizado em 30/06/2017). Entre os homens, nos últimos dez anos, observou-se um incremento da taxa de detecção entre aqueles de 15 a 19 anos, 20 a 24 anos, 25 e 29 anos e 60 anos e mais. Destaca-se o aumento em jovens de 15 a 19 anos e de 20 a 24 anos: do ano de 2006 para o de 2016, a taxa quase triplicou entre o primeiro grupo e, entre os de 20 a 24 anos, a taxa mais que duplicou. Mesmo com esses aumentos observados, a maior taxa de detecção em 2016 permaneceu entre os indivíduos na faixa etária de 35 a 39 anos: 49,4 casos/100.000 habitantes, 21,5% menor do que a observada em 2006 (Tabela 17 e Figura 10). 2, 4 16 ,0 41 ,1 55 ,1 62 ,9 62 ,0 50 ,4 37 ,3 28 ,2 10 ,8 6, 7 33 ,9 48 ,3 47 ,7 49 ,4 44 ,2 40 ,2 33 ,8 26 ,7 12 ,9 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 15 a 19 anos 20 a 24 anos 25 a 29 anos 30 a 34 anos 35 a 39 anos 40 a 44 anos 45 a 49 anos 50 a 54 anos 55 a 59 anos 60 e mais Ta xa d e de te cç ão (x 10 0 m il ha b. ) 2006 2016 Figura 10 – Taxa de detecção de aids (/100 mil hab.) em homens, segundo faixa etária e sexo, Brasil. 2006 e 2016a. a Casos notificados no Sinan e Siscel/Siclom até 30/06/2017; no SIM, de 2000 a 2016. Fonte: Sinan (atualizado em 30/06/2017). 2006 3,6 1,6 1,1 3,6 13,7 30,5 37,2 34,6 34,4 30,0 21,7 15,6 5,6 3,6 1,6 0,9 2,4 16,0 41,1 55,1 62,9 62,0 50,4 37,3 28,2 10,8 75,0 60,0 45,0 30,0 15,0 0,0 15,0 30,0 45,0 60,0 75,0 < 5 5 a 9 10 a 14 15 a 19 20 a 24 25 a 29 30 a 34 35 a 39 40 a 44 45 a 49 50 a 54 55 a 59 ≥ 60 Mulheres Homens Faixa Etária Taxa de detecção (x100 mil hab.) 2016 2,6 0,5 0,5 4,1 10,2 15,0 19,6 23,4 24,1 20,5 17,4 13,6 6,4 2,1 0,4 0,3 6,7 33,9 48,3 47,7 49,4 44,2 40,2 33,8 26,7 12,9 75,0 60,0 45,0 30,0 15,0 0,0 15,0 30,0 45,0 60,0 75,0 < 5 5 a 9 10 a 14 15 a 19 20 a 24 25 a 29 30 a 34 35 a 39 40 a 44 45 a 49 50 a 54 55 a 59 ≥ 60 Mulheres Homens Faixa Etária Taxa de detecção (x100 mil hab.) Os subtipos do HIV-1 se diferenciam em 25% das suas sequências de nucleotídeos, e subsubtipos se diferenciam entre si em 10 a 20% (PERRIN L., KAISER L., YERLY S., et al, 2003). O vírus HIV é esférico com aproximadamente 10 nm de diâmetro e possui uma bicamada lipídica conhecida com envelope, onde são expressas glicoproteínas transmembranares (gp41) e de superfície (gp120). Seu capsídeo viral é basicamente composto pela proteína p24 e seu nucleocapsídeo é formado por proteicas p7 e p9 juntamente com duas moléculas de fita simples de RNA (DA ROSA, 2016). As proteases, transcriptases reversas (TR) e integrases são as três principais primeiras encontradas em uma partícula de HIV-1. A enzima TR é responsável pela transcrição do RNA viral em um DNA complementar, chamado de cDNA, que será integrado ao genoma da célula alvo pelas integrases (BARRÉ-SINOUSSI, 1996; COFFIN, et al. 1986; SIMON, HO, ABDOOL, 2006.). Figura 2: Estrutura do HIV com suas principais proteínas (SILVA, 2008). O HIV possui três genes principais em seu genoma (que possui cerca de 9.8 kb) sendo eles o gag, o pol e o env. Os genes que irão codificar proteicas estruturais são os gag e env, enquanto o pol ira codificar enzimas virais como integrases, TR e proteases. Os genes env são extremamente importantes para o vírus, pois eles codificam as glicoproteínas transmembranares e de superfície, que possuem a função de ajudar na entrada do vírus na célula hospedeira, facilitando assim sua replicação (JAWETZ, et al., 1998; FREED, 2001). �5 Da Silva, B. C. M. Revisão da literatura 17 forma não-covalente (Barré-Sinoussi, 199632; Fields et al., 200127; Sierra et al., 200533). p 32 Integrase ssRNA p10 protease Proteínas do MHC Transcriptase reversa (p66-p51) p24 p17 gp41 gp120 Figura 2. Estrutura do HIV-1 com suas principais proteínas O genoma viral do HIV-1, seqüenciado em 1985 por Wain-Hobson et al.34, possui estrutura típica dos retrovírus, sendo formado por duas fitas simples e idênticas de RNA diplóide, de polaridade positiva, cada uma com aproximadamente 9,2 quilobases (Kb) de comprimento; possui o gene gag, que codifica as sete proteínas estruturais: p24, principal proteína do capsídeo; p17, proteína da matriz; p7 e p9, proteínas do núcleo-capsídeo, que se ligam ao RNA; três pequenas proteínas: p1 e p2 (regulação da O virus HIV, assim como muitos outros possui mecanismos de evasão para assegurar sua sobrevivência, além de aumentar sua variabilidade genética. O mesmo passa por uma alta taxa de mutações que ocorrem devido à falta da função corretora da transcriptase reversa e de sua ação recombinante, que gera um escape do sistema imunológico (GUIMARÃES, 2013). 1.4 Resposta imune contra o HIV Estudos mostram que não apenas a imunidade celular, mas também a humoral são importantesna mediação da resposta ao HIV-1 (MCMICHAEL, ROWLAND-JONES, 2001). Dentro da imunidade celular as células TCD4+ e TCD8+ são de extrema importância pois são responsáveis pelo reconhecimento da cadeia de MHC classe II e I. Epítopos para células T CD8+ ja foram bastante estudados, em compensação poucos epítopos para células T CD4+ foram testados (CARVALHO, 2010). De acordo com Borgo (2010) os linfocitos T CD4+ são considerados alvos preferenciais do HIV, pois induzem e mantém uma resposta imune celular, e é enfatizado nesse estudo a importância dos epítopos T CD4+ devido à sua indução à proliferação de células de memória. Esta alta resposta proliferativa de linfócito T CD4+ ja foi observada, por estudos anteriores, quando houve estimulo de antígeno p24 em pacientes infectados com HIV-1, mostrando também que houve indução na produção de IFN-y, uma celular importante na resposta imune celular (ROSENBERG et al., 1997). Devido a importância das células T CD4+ para indução e maturação de linfócitos T CD8+ e manutenção dos linfócitos T de memória, é de extrema necessidade a adição de epítopos para células T CD4+ na formulação vacinal contra HIV (MULLER, 2009). As respostas precoces antígeno especificas das células T CD4+ também são fatores positivos na construção de uma vacina contra infecção por HIV (PANCRE et al., 2007). 1.5 Tratamentos disponíveis no mercado Apesar de terem passado décadas desde a descoberta do HIV o acesso ao tratamento antirretroviral ainda não atingiu toda a população infectada. Atualmente pode-se encontrar em mercado cerca de 20 drogas antirretrovirais regulamentadas para tratar a infecção pelo vírus HIV. Esses tratamentos são compostos por 6 classes diferentes de drogas: os inibidores de TR análogos de nucleotídeos e nucleosídeos, os inibidores de TR não análogos de nucleosídeos, os inibidores de proteases, os inibidores de fusão, os antagonistas de CCR5 e os inibidores de integrasse (Panel on Antiretroviral Guidelines for Adults and Adolescents, 2008). Os tratamentos regulamentados atualmente resumem-se em coquetéis contendo 2 ou mais drogas antirretrovirais de classes distintas, sendo conhecida como Terapia Antirretroviral Combinada �6 (ART) ou Terapia Antirretroviral Altamente Eficaz (HAART). Apesar de a infecção viral continuar se espalhando pelo mundo, o impacto dos tratamentos, onde há disponibilidade, é visível. Em 2017 mais de 20 milhões de infectados tiveram acesso à terapia antirretroviral, sendo aproximadamente metade da população mundial infectada (UNAIDS, 2017). Atualmente vários candidatos a vacinas terapêutica estão em testes como ALVAC-HIV, Remune e células dendríticas autólogas pulsadas com HIV inativado. A ALVAC-HIV conseguiu induzir resposta pela T CD8+, porém apenas uma resposta temporária (JIN et al., 2002), enquanto como tratamentos terapêuticos utilizando essa vacina em união com lipopeptídeos do HIV e administrada na presença de IL-2 obteve-se uma resposta imunológica mais prolongada do tratamento antirretroviral com indução de T CD4+ e T CD8+ (LÉVY et al., 2006). A vacina Remune foi um dos primeiros candidatos a vacina terapêutica contra HIV, tendo sido desenvolvida há aproximadamente 10 anos, e é composta pelo m.o. inativado, depletado de glicoproteina gp120 e emulsificado em adjuvante incompleto de Freund, tendo mostrado aumento na resposta de células T CD4+ (ROBBINS et al., 2003). Em 1998 a empresa Vaxgem tentou produzir uma vacina contra HIV unindo genes de dois subtipos de HIV porem não obteve um resultado eficaz, pois não foi capaz de imunizar todos os testados, e os que foram imunizados não foi significativo. Em 2003 a UFRJ tentou modificar essa vacina com a adição de um novo gene, porem também não obteve resultados satisfatórios. Atualmente a USP esta no processo de desenvolvimento de uma vacina contra HIV, que é composta pela união de genes que codificam proteicas formadoras do vírus, tendo como principio a expressão dessa proteína para formação desses peptídeos, sem que contenha a virulência do vírus, estimulando assim o sistema imune a gerar memória. 1.6 Proposta do projeto Tendo em vista as informações acima abordadas, a proposta deste projeto é realizar estudos pré-clínicos e clínicos para o desenvolvimento de uma vacina de DNA recombinante contra o vírus HIV, mais especificamente contra o tipo HIV-1, que é o responsável pela pandemia global. Esta vacina recombinante conterá todos os genes codificadores de epítopos de T CD4+ de HIV-1 encontrados nos vírus isolados das amostras coletadas. O delineamento experimental desta vacina estará descrito nas etapas a seguir. �7 2 ESTUDOS PRÉ-CLÍNICOS São os testes que fornecerão informações de segurança e eficácia in vitro e in vivo em animais com semelhanças genéticas e/ou evolutivas à espécie alvo, antes que sejam realizados testes em humanos. 2.1 Isolamento do patógeno O isolamento do patógeno será feito através da coleta de amostras de saliva de pessoas infectadas separadas em diversos grupos diferentes. Os infectados a terem sua amostra coletadas serão separados em 3 grupos étnicos principais, sendo eles caucasianos, negros e asiáticos. Dentro de cada grupo étnicos serão separados 6 subgrupos contendo 5 pessoas em cada um, contabilizando um total de 90 amostras sangüíneas infectadas. Esses subgrupos serão classificados por: menores de 18 anos contaminados a mais de 10 anos, menores de 18 anos contaminados a menos de 10 anos, pessoas entre 18 e 50 anos contaminados a mais de 10 anos, pessoas entre 18 e 50 anos contaminadas a menos de 10 anos, maiores de 50 anos contaminados a mais de 10 anos e maiores de 50 anos contaminado a menos de 10 anos. Após a coleta das 90 amostras, o RNA viral será extraído das células utilizando o protocolo QIAamp® 96 Virus QIAcube HT Kit da empresa QIAGEN® que é capaz de extrair e purificar RNA viral de diversas amostras, incluindo saliva, sangue, tecidos e outros tipos de fluidos corporais. Para a realização deste procedimento é necessário o uso do QIAcube® HT que é um instrumento utilizado para extração e purificação automatizada de ácidos nucleicos utilizando placa de 96 poços, possibilitando assim a purificação de todas as 90 amostras a serem testadas ao mesmo tempo 2.2 Síntese do cDNA O cDNA é a fita de DNA complementar ao RNA viral extraído, e será sintetizada utilizando o kit cDNA Reverse Transcription Kit (High Capacity) da empresa Thermo Fisher®. Essa técnica se baseia na realização de reações utilizando transcriptase reversa como enzima sintetizadora da fita complementar. A verificação da efetividade da reação de síntese de cDNA será feita através de Eletroforese em gel de agarose 1%. É necessária a síntese do cDNA devido a relativa instabilidade do RNA, e a dificuldade de manter amostras livres de RNAses que são mais difíceis de serem inativadas do que DNAses. O DNA é biologicamente mais estável, assegurando a estabilidade das informações obtidas através de testes posteriores. Além da instabilidade do RNA, protocolos de amplificação por PCR e de sequenciamento foram desenvolvidas para serem utilizadas �8 com DNA, portanto é necessária a síntese do cDNA correspondente ao RNA viral a ser testado. 2.3 Sequenciamento do cDNA Para que tenhamos a sequencia genômica completa das amostras coletadas será realizado o sequenciamento completo das mesmas, e a comparação das amostras para identificação das suas semelhanças e diferenças. As amostras que possuírem 25% ou mais de diferenças serão consideradas como sendo de subtipos diferentes e serão utilizadas para montagem do DNA recombinantes, ja as que possuírem menos de 25% de diferenças serão consideradas como sendo do mesmo subtipos, diminuindo assim a quantidade de amostras a serem utilizadas na formulação vacinal. O sequenciamento das 90 amostras de cDNA será realizado na empresa Macrogen® Korea, que realiza diversos tipos de sequenciamento e sínteses, desdeos standard ate os customizados. A Macrogen possui diversas parcerias com pesquisadores e empresas Brasileiras, como por exemplo a Universidade de Brasilia, além de ser uma empresa de grande renome, e de fornecer resultados online e acessíveis. 2.4 Predição de epítopos, amplificação e clivagem do cDNA A predição de epítopos será feita através de bioinformática e pesquisas em literatura, com objetivo de encontrar sequências de genes codificadores de epítopos de T CD4+ correspondentes a todos os subtipos do grupo M e O do HIV-1. As pesquisas serão feitas em sites que fornecem serviços de bioinformatica e possuem bancos de gene como o European Molecular Biology Laboratory - Data Library, o GenBank do National Center for Biotechnology Information, o Protein Information Resource, o SwissProt, o International Nucleotide Sequence Databases Collaboration entre outros. Após a descoberta de todos os epitopos possíveis, primers complementares à esses epitopos serão desenhados para utilização em Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) com kit da InvitrogenTM e primers desenhados pelo grupo de pesquisa. Cada amostra passará por diversas PCRs, cada reação contendo um primer diferente. Esse estudo indicará quais amostras poderão ser utilizadas na formulação da vacina (positivas para a presença de qualquer epitopo de T CD4+), além de indicar quais amostras possuíam mais de um epítopo sendo expressado ao mesmo tempo, para vias de informação e pesquisa. Depois que a detecção desses genes nas amostras seja feita, àquelas positivas irão passar por tratamento com enzimas de restrição, que irão clivar apenas os pares de bases alvo, �9 que no caso serão os nossos genes codificadores de epitopos T CD4+. Essas enzimas de restrição desempenham um papel especifico, pois reconhecem e clivam apenas a sequencia de interesse geralmente realizando corte escalonado, deixando uma fita simples de DNA no final, para ser unida com outra ou adicionada em um vetor. 2.5 Recombinação do DNA e seleção do vetor A recombinação desses genes sera feita através da enzima DNA Ligase, que ira unir as pontas complementares das fitas, previamente clivadas pelas enzimas de restrição, em uma única fita contínua de DNA. Essas mesmas enzimas (de restrição e ligase) serão utilizadas na inserção desse novo DNA em um vetor. Atualmente existem diversos tipos vetores, e sua escolha pode variar do objetivo ao tamanho da fita a ser adicionada. Os principais tipos de vetores são os plasmídeos e os bacteriófagos. Os plasmídeos são moléculas pequenas de DNA circular, que podem ser inseridos em uma bactéria por meio de transformação (após a adição do novo DNA) e então cultivados em meio de cultura solido para verificação da efetividade do processo de transformação. Após o crescimento das bactérias, as mesmas deverão passar por processos para verificar se o plasmídeo inserido nelas esta correto (PCR), sendo então usada para produção de novos plasmídeos ou expressão de proteínas. A principal diferença entre os plasmados e os bacteriofagos é seu tamanho, que chega a 48500bp, e a inserção da nova fita de DNA é feita através do seus sitios de restrição, e o empacotamento do DNA é feito através dos seus sitio cos. Há também outros tipos de vetores, principalmente artificiais, sendo estes os PAC, BAC e YAC, derivados respectivamente de cromossomo artificial P1, cromossomo artificial bacteriano e cromossomo artificial de levedura. O melhor vetor a ser utilizado será escolhido de acordo com as características da nova fita de DNA recombinante obtida, principalmente seu tamanho. 2.6 Seleção do adjuvante Como a vacina proposta, apesar de não ser uma vacina inativada propriamente dita, e apesar de conter genes que codificam epítopos para T CD4+, não apresentará uma resposta imune imediata ou muito boa, portanto o uso de um adjuvante é sugerido. Entre os adjuvantes oleosos e aquosos é preferido o uso de um oleoso neste caso, pois diminuirá a quantidade de �10 doses necessárias, talvez até chegando a apenas uma dose, devido à sua liberação gradativa de antígeno. Por ja ter sido utilizado em pesquisas previas com vacinas contra HIV, e por potencializar resposta imune tanto humoral quanto celular, o Adjuvante Incompleto de Freund será utilizado na formulação vacinal. O Adjuvante Completo de Freund é basicamente uma emulsão oleosa em água contendo mycobacteria inativada através do calor ou por subunidades de sua parede celular (LPS). Apesar de não possuir uma resposta imunológica tão marcante quanto o completo, o adjuvante incompleto de Freund será utilizado por não possuir LPS em sua formulação. Levando em consideração que os LPS são extremamente alergênicos os adjuvantes completos de Freund entraram em desuso. 2.7 Formulação vacinal Como já apresentado previamente a vacina será composta por uma fita recombinante de DNA contendo diversos genes codificadores de epítopos para T CD4+, que estará inserido em um vetor previamente escolhido de acordo com o tamanho da fita obtida. Esse vetor passara por tratamento com NaOH para minimizar o crescimento de contaminantes e então será emulsificado em solução contendo Adjuvante Incompleto de Freund. Por ja ter passado por tratamento prévio com NaOH não será necessária a adição de antibióticos na composição da vacina, apenas um diluente que pode ser agua mili-Q livre de DNAses ou tampão PBS por exemplo. 2.8 Testes in-vitro Para os testes de toxicidade dos componentes da vacina, no caso o adjuvante, serão realizados o teste de toxicidade com Artemia salina, que foi escolhido devido a facilidade de manuseio, rapidez dos ensaios, alem de baixo custo. A Artemia salina é um microcrustáceo de agua salgada que costuma ser usada como alimento por peixes. O bimensais será realizado baseado nos protocolo descrito por Meyer et al (1982), que se baseia na adição de diferentes concentrações do toxico a ser testado à tubos de ensaio com quantidades previamente contadas e estabelecidas de microcrustáceos saudáveis com alimento disponível. Após 6 e 24h de incubação em ambiente iluminado as mortes serão contabilizadas e a porcentagem de morte para cada dose será determinada. Através dessas informações pode-se determinar a DL50 ou a dose que será letal para metade da população testada. �11 2.9 Modelo e obtenção de animal Para os testes de toxicidade feitos inicialmente nos testes in-vivo, os camundongos serão utilizados. Já para os experimentos de eficácia e imunogenicidade o modelo animal que será utilizado serão os primatas não humanos devido à sua semelhança genética com os humanos, mais especificamente o Macaco Rhesus que foi reportado como tendo sido utilizado em diversos testes prévios para vacinas e tratamentos contra HIV, inclusive pelo instituto Butantã atualmente, que é de onde os mesmo serão obtidos.. De modo geral os camundongos costumam ser mais utilizados em testes in-vivo, tanto para citotoxicidade quanto eficácia de medicamentos e vacinas, porém os primatas são reportados como apresentando respostas mais especificas, pois simulam o curso do patógeno pelo sistema imunológico humano de forma mais semelhante. Os animais obtidos serão mantidos em ambiente apropriado para seu desenvolvimento, com alimentação e agua adequados. 2.10 Testes in-vivo Para os testes in-vivo os animais serão separados em 4 grupos experimentais: o grupo G1 contendo animais saudáveis que não entrarão em contato com o vírus, que servirão de controle positivo para analise das respostas imunológicas e sistêmicas, o grupo G2 contendo animais saudáveis nos quais será aplicada a vacina, o grupo G3 contendo animais nos quais será aplicado apenas o Adjuvante Incompleto de Freund, e o grupo G4 contendo animais nos quais será aplicado apenas o diluente da vacina. Os grupos G2, G3 e G4 serão posteriormente expostos ao vírus HIV-1 e após período mínimo para detecção (3 semanas) serão testados para avaliar a eficiência da vacina.As vacinas serão administradas por via intramuscular sendo a primeira dose no dia 1, a segunda 30 dias depois, a terceira 60 dias depois da primeira e após 15 dias da terceira dose o teste desafio será feito com a concentração previamente estabelecida, e aos 90 dias de teste os animais devem ser sacrificados de forma a não causar sofrimento aos mesmos. Antes da aplicação da primeira dose e entre cada nova aplicação serão coletadas amostras de sangue para realização de hemograma completo (tubo com com EDTA), e de exames das funções hepáticas e renais, e ao final dos exames as amostras de sangue serão congeladas para posteriores testes. Após a eutanásia do animal o mesmo passara por necropsia para observação dos órgãos e coleta do fígado e dos rins pra exames histopatológicos. �12 Após o termino dos experimentos e exames clássicos novos testes serão realizados com as amostras de sangue congeladas previamente. Através do teste de ELISA (Enzyme- Linked Immunosorbent Assay) indireta a concentração de anticorpo será medida. Este teste se baseia na reação entre o antígeno de interesse e os anticorpos das amostras testadas, pra indicar a presença ou não do mesmo, e através da leitura da placa em aparelho leitor de ELISA por Densidade óptica pode-se calcular a concentração exata de anticorpo presente em cada amostra, permitindo assim a predição da quantidade de doses necessária para imunizar o indivíduo. Já o cálculo da dosagem de citocinas será feito através de ELISA de Captura, que parte do mesmo principio do ELISA convencional ou indireto, porém para medir a dosagem de IgM através da fixação de IgG nos poços. Para a medição da quantidade de células dos Linfócitos T e B será utilizada a citometria de fluxo, que e uma técnica amplamente usada para contar, examinar e classificar partículas microscópicas que estejam suspensas em meio liquido em fluxo. Essa técnica se baseia na passagem da amostra por um fluxo luminoso que medirá o tamanho das partículas através da dispersão da luz e traduzirá o mesmo em picos de ondas visíveis no computador que nos permitirão identificar a presença ou não das células alvo de acordo com seu tamanho, e sua quantidade de acordo com a quantidade de picos. 3 ESTUDOS CLÍNICOS São os mesmos testes realizados nos estudos pré-clínicos, porém já na espécie alvo, no caso os humanos. O mesmo é dividido em quatro fases principais que são responsáveis, respectivamente pelas respostas de “segurança e imunogenicidade”, “segurança e efeitos adversos”, “eficácia e efeitos adversos” e “vigilância”. 3.1 Fase I Como ja mencionado anteriormente o objetivo desta fase é garantir a segurança e a imunogenicidade da vacina desenvolvida. Nesta fase a vacina será administrada em grupos pequenos, em torno de 30 pessoas, dividias na metade em duas subgrupos, um que tomara a vacina e outro que tomara placebo. Os pacientes podem ser saudáveis, avaliando assim a possível exposição do mesmo à doença, ou ja doentes para uso da vacina como tratamento terapêutico. Esta fase pode durar cerca de 1 ano ou mais. Os testes realizados serão os mesmos da etapa in-vivo dos estudos pré-clínicos. �13 3.2 Fase II Na segunda fase dos estudos clínicos o objetivo é avaliar a segurança e a presença de qualquer efeito adverso. Nesta fase o numero de pessoas testadas aumenta bastante, sendo testadas centenas de pessoas, mantendo os mesmos grupos e especificações. Sao necessários resultados positivos nesta fase para se se parta para a Fase III, caso contrario os testes devem ser repetidos. 3.3 Fase III Nesta fase a eficácia da vacina contra HIV será propriamente testada, além dos efeitos adversos, pois grupos de milhares de pessoas serão testadas, principalmente àquelas com probabilidade de contagio da doença, portanto serão selecionadas pessoas de áreas e com características de risco. Esse testo pode durar ate 12 anos, que e o tempo registrado máximo de incubação do vírus HIV. Após os testes fase III, caso se obtenha resultados favoráveis o produto testado devera passar por regulamentação pela ANVISA, que analisará de forma minuciosa todos os testes e resultados apresentados, para liberação da comercialização. 3.4 Fase IV A fase IV é conhecida também como fase de vigilância, que será os estudos epidemiologicos após o inicio da comercialização da vacina, tanto em pessoas saudáveis vacinadas quanto em doentes que usem a vacina como tratamento terapêutico. Essa será a ultima etapa dos estudos para desenvolvimento da vacina de DNA recombinante contra o vírus HIV e durará enquanto a doença existir e a vacina e variantes forem comercializada. �14 REFERÊNCIAS BARRÉ-SINOUSSI F. HIV as the cause of AIDS. Lancet. 1996 BORGO, A. C., FONSECA, S. G., Estudo de subpopulações de linfocitos T de memória de indivíduos infectados pelo vírus da imunodeficiencia humana em resposta a epitopos não-descritos T CD4+ derivados do HIV-1. Bolsas no Brasil - Doutorado Direto. 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