Relatório 2: Fotossíntese Reação de Hill em cloroplastos isolados de espinafre

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC
Centro de Ciências Naturais e Humanas (CCNH)
Fisiologia Vegetal I
Fotossíntese – Reação de Hill em cloroplastos isolados de
espinafre
Juliana Bertoli RA 21055514
Profa. Dr. Danilo da Cruz Centeno
Santo André – SP
2019
1. INTRODUÇÃO
Os organismos fotossintetizantes são capazes de produzir seu substrato
energético a partir da incorporação do carbono proveniente do CO2 atmosférico, da
absorção de água do solo e, por fim, da captação de energia luminosa pelos
pigmentos fotossintéticos localizados nos complexos fotossintéticos ancorados na
membrana dos tilacóides, no interior dos cloroplastos de células, sobretudo, foliares
da planta. Quando estes elementos estão presentes no ambiente a fotossíntese
pode ocorrer, obtendo como principais produtos, gás oxigênio e a glicose, tal que a
última é a que será utilizada como substrato energético ou incorporada na biomassa
do indivíduo vegetal.
A fotossíntese ocorre, em termos gerais, em duas etapas: a dependente
e a independente de luz. Na primeira (Figura 1), ocorre a captação da radiação
luminosa pelo complexo antena do fotossistema II (PSII), um conjunto de proteínas
associadas a pigmentos fotossintéticos que absorvem e conduzem o fóton até o
centro de reação do complexo, onde se encontra uma clorofila P680 que se excita e
libera um de seus elétrons. Através de uma série de reações de oxirredução, esse
elétron percorre a membrana do tilacóide até finalmente ser incorporado a uma
molécula de NADP, que será utilizada na próxima etapa da fotossíntese, a
independente de luz, onde ocorre o chamado Ciclo de Calvin, momento em que o
CO2 atmosférico terá seu carbono incorporado ao metabolismo celular da planta.
Ainda nas reações luminosas, ATP é formado devido a um gradiente eletroquímico
estabelecido pela ejeção de prótons no lúmen do tilacóide. Estabelecido este
potencial e considerando a impermeabilidade da membrana, os íons H+ são forçados
a sair através de ATP sintases que se aproveitam da força próton-motriz para
produzir moléculas de ATP. Ainda em relação ao PSII, a clorofila P680 tem seu
número de elétrons restabelecido no orbital deficiente pela oxidação da molécula de
H2O a O2 e incorporação do elétron resultante.
By Somepics - Own work, CC BY-SA 4.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=38088695
Figura 1. Esquema representando o fluxo de elétrons ao longo da membrana do
tilacóide e sua passagem pelos PSII e I. Importante mencionar alguns pontos como
a oxidação da água a oxigênio molecular no PSII, com liberação de prótons ao
lúmen do tilacóide e elétrons, que seguirá seu caminho até a ATP sintase através
de reações de oxi-redução, a produção de NADPH a partir de um NADP e um
próton do estroma pela ferredoxina-NADP redutase e a geração do gradiente
eletroquímico no lúmen, devido ao aumento da concentração de íons H+, que
possibilitará o fluxo para o estroma através da ATP sintase, produzindo ATP no
processo.
A fim de estudar a origem do oxigênio molecular no processo de
fotossíntese, Robert Hill propôs um experimento onde na ausência de CO2 e
presença de aceptores de elétrons, cloroplastos isolados e em suspensão expostos
à luminosidade, produzem O2 . Este foi um importante passo na elucidação dos
processos fotossintéticos nas reações dependentes de luz, uma vez que fornecia
evidências para a argumentação de que esta molécula não seria proveniente do gás
carbônico. A reação que leva seu nome se caracteriza pela redução de um aceptor
de elétrons (A) pela quebra da molécula de água, levando à produção de O2,
quando cloroplastos são expostos a um ambiente luminoso e pode ser
quimicamente escrito como:
https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=38088695
Embora em organismos fotossintetizantes o aceptor final dos elétrons das
reações luminosas seja o NADP, nesta prática foi utilizado o 2,6 diclorofenol –
indofenol (DCIP), o qual recebe os elétrons tanto do PSII como os do PSI e, permite
uma análise qualitativa e quantitativa pois em sua forma reduzida fica incolor, em
contraste com sua forma oxidada, que apresenta uma coloração azulada (Figura 2).
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Figura 2. Reação de redução do DCIP. Dois prótons e dois elétrons são inseridos na
molécula, formando um grupo amina e outro álcool. Uma solução incolor é observada
quando a molécula encontra-se reduzida, enquanto o azul predomina quando a mesma
está oxidada.
2. OBJETIVO
Isolar cloroplastos íntegros de folhas de espinafre e verificar a
transferência de elétrons durante o processo fotossintético utilizando luz branca,
vermelha, azul, verde e a ausência de luz, e posteriormente comparar as diferenças
de absorbâncias entre elas.
3. RESULTADOS
Na primeira parte do experimento, para triturar o espinafre, foi utilizado a
tris-sacarose gelada para que o meio fosse isotônico, fazendo com que as células
do espinafre continuassem do mesmo modo, pois sem o meio isotônico, as células
de espinafre perderiam água para o meio e isso afetaria a turgidez do cloroplasto.
https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=2770173
Posteriormente, adicionou-se nos tubos de ensaio o 2,6
-diclorofenol-indofenol que funciona como um aceptor artificial de elétrons, sendo
que quando oxidado fica azulado e quando reduzido, incolor.
A absorbância de cada solução foi medida e em seguida os tubos de
ensaio foram deixados sobre a irradiação luminosa durante 10 minutos, como
mostra a figura 3 e realizado a mesma medição de absorbância nos tubos.
Figura 3- Irradiação luminosa por lâmpada incandescente sobre cada um dos grupos amostrais.
A tabela 1 e 2, mostram os resultados da absorbância nos tubos de
ensaio no tempo 0 min e após o período de 10min sobre irradiação luminosa.
Entretanto, foi subtraído a quantia de -0,023 de cada amostra, pois este foi o valor
medido para o tubo de ensaio sem o DCPIP.
Tabela 1: Resultados do Grupo 1
Luz Tempo 0
minutos
Tempo 10
minutos
∆abs
Escuro 0,324 0,306 0,018
Branca 0,305 0,011 0,294
Vermelha 0,305 0,013 0,269
Azul 0,308 0,002 0,243
Verde 0,310 0,023 0,267
Tabela 2: Resultados do Grupo 2
Luz Tempo 0
minutos
Tempo 10
minutos
∆abs
Escuro 0,306 0,333 -0,027
Branca 0,346 -0,004 0,350
Vermelha 0,337 0,001 0,336
Azul 0,351 0,299 0,052
Verde 0,339 0,132 0,207
4. DISCUSSÃO
Diante de todas as informações conhecidas sobre Fotossíntese,
especificamente as reações de fotofosforilação e de como as soluções contendo os
cloroplastos isolados e o DCIP se apresentariam após dez minutos de interação
com a fonte luminosa, é possível afirmar que o experimento baseado na Reação de
Hill, obteve sucesso em mostrar empiricamente a ocorrência de redução do DCIP
como mediador dos produtos da fotossíntese.
A leitura da absorbância da amostra controle escuro de ambos os
grupos, a qual durante todo o procedimento permaneceu sob mínima influência
luminosa, protegida pelo revestimento de papel alumínio, revelou pouca ou quase
nenhuma atividade fotossintética passados os 10 minutos, tal como era esperado.
Isso porque, na ausência de luz, não ocorre atividade fotossintética nos cloroplastos
isolados justamente por não haver excitação do elétron das clorofilas P680, não
dando início à fotofosforilação e por consequência, sem redução do DCIP.
No grupo 1, a segunda medição (após 10 minutos de exposição à luz)
referente ao tubo de ensaio transparente (branca) resultou num valor de
absorbância pouco menor do que a primeira medida referente ao tempo inicial no
escuro. Passados os 10 minutos, observou-se pelo valor obtido da absorbância,
uma diminuição de seu valor comparado ao tempo inicial. Isto reflete o fato de que o
tubo transparente ao receber a luz incidente, foi capaz de reduzir o aceptor de
elétrons em estudo (DCIP) numa reação fotossintética. O grupo 2 para o tubo
transparente obteve um resultado similar ao encontrado pelo grupo 1, porém com
um valor de absorbâncianegativo que pode vir a indicar algum erro de
procedimento experimental ou de leitura mas que de todo modo, ainda é coerente
com o esperado para o tubo transparente.
No que concerne aos tubos cobertos com papel vermelho e azul tanto
para os grupo 1 e 2, observa -se uma diminuição do valor de absorbância similar ao
encontrado para os tubos transparentes. Esse resultado indica portanto que a
coloração vermelha e azul entram nos comprimentos de onda possíveis para o
cloroplasto captar a energia luminosa e realizar a fotossíntese, reduzindo nosso
aceptor de elétrons. Para o grupo 2, no entanto, a coloração azul do papel
desencadeou uma diferença de absorbância muito baixa comparada ao branco e ao
vermelho, fato que evidencia algum provável erro experimental. Isto porque, este
resultado ilustra que o comprimento de onda azul não mostrou-se efetivo para o
grupo 2 na realização da redução do aceptor, divergindo do esperado.
Por fim, para os tubos encapados com papel de cor verde, obteve-se
para o Grupo 2 um valor de diferença de absorbância entre o tempo inicial e final
menor quando comparado às cores transparente (branca), vermelho e azul. Este
resultado mostra portanto que a existência de um comprimento de onda verde na
interface entre a fonte luminosa e os cloroplastos do espinafre não é tão potente
para a redução do DCIP. Logo, uma iluminação esverdeada tem capacidade inferior
de promover a reação de Hill nos cloroplastos. Para o grupo 1, no entanto, observou
-se um aumento de absorbância para a cor verde quando comparado ao tubo
revestido de cor azul, o que não seria esperado. O resultado obtido pelo Grupo 1
neste caso, pode indicar um erro de leitura ou mesmo uma brecha no revestimento
de papel que pode ter levado a incidência direta da luz visível para o cloroplasto, o
que justificaria esse aumento da redução do DCIP observado.
Com base nos resultados obtidos pelos grupos amostrais envoltos em
diferentes condições de coloração que interferiram ou não na captação da luz visível
pelos cloroplastos do espinafre, pode-se vislumbrar a relevância deste tipo de
experimento para evidenciar a formação de O2 no processo fotossintético.
4. Bibliografia
MAJEROWICZ N., FRANÇA M., PERES L., MÉDICI L., Figueiredo S. 2003.
Fisiologia vegetal. Curso prático. Âmbito Cultural Ed. Ltda. Rio de Janeiro, RJ. p.
138.
PRADO C.H., CASALI C.A. 2006. Fisiologia vegetal. Práticas em relações hídricas,
fotossíntese e nutrição mineral. Ed. Manole. Baruieri, SP. p. 466.
RAVEN P., EVERT R., EICHHORN S. 2005. Biology of Plants (7th ed.). New York:
W. H. Freeman and Company. pp. 124–127.