citoesqueleto

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Citoesqueleto
Ausente nas células procarióticas, mas é um fator crucial na evolução das células eucarióticas.
É uma rede tridimensional de filamentos proteicos que se estende através do citoplasma de todas as células eucarióticas.
Desempenha um papel estrutural, que consiste na determinação da forma da célula, dar suporte estrutural à mesma e organizar, de maneira geral, o citoplasma.
Além disso, desempenha um papel funcional, que é responsável por movimentos celulares e transporte de substâncias no interior da célula.
O citoesqueleto é uma estrutura muito flexível e dinâmica. 
É composto por:
· Microtúbulos.
· Microfilamentos (filamentos de actina).
· Filamentos intermédios.
Os filamentos interligam-se e ligam-se aos organelos celulares bem como à membrana celular através de proteínas de ligação.
Polarização celular
A região apical projeta-se em direção à superfície externa ou ao lúmen de um órgão recoberto por epitélio. Este polo também pode mostrar especializações de membrana apical que alteram a forma dessa superfície, tal como está representado na imagem pelas microvilosidades.
Como tanto a superfície lateral como a basal estão ajustadas para interagir com as estruturas vizinhas, elas são frequentemente mencionadas juntas, como superfície basolateral.
O facto de nós podermos dar estas designações à célula – região apical e região basolateral – é graças ao citoesqueleto.
Estabilidade e propriedades mecânicas
Força de deformação
Deformação
Os componentes do citoesqueleto têm estabilidades e propriedades mecânicas diferentes; nomeadamente, os filamentos intermédios são os mais estáveis, visto que são responsáveis pela integridade do invólucro nuclear, e os menos estáveis são os microtúbulos. 
O microtúbulo é um dímero de tubulina, tendo cerca de 25nm de diâmetro, formando um tubo. Para formar microtúbulos é necessária uma fonte de energia de GTP (dependem de uma fonte de energia).GTP
ATP
Os filamentos intermédios são compostos de proteínas (6 classes), com 10nm de diâmetro, que contém 2 dímeros que se associam para formar um tetrâmero, que podem ser homo ou heterotetrâmeros. Estes filamentos são independentes de uma fonte de energia.
Os microfilamentos são constituídos por monómeros de actina (proteína específica), com um diâmetro de 7nm. Para formar microfilamentos é necessária uma fonte de energia de ATP (dependem de uma fonte de energia).
Microtúbulos
· Estruturas cilíndricas ocas com 25 nm de diâmetro e de comprimento variável.
· Apresentam polaridade: Polo positivo (+) e polo negativo (-).
· Funções:
· determinar a posição dos organelos;
· mobilidade celular:
· transporte intracelular de organelos, vesículas e grânulos diversos;
· locomoção (corpúsculos basais, cílios e flagelos);
· segregação cromossomas (centríolo), construção do fuso mitótico e separação dos cromossomas durante a mitose.
· Diferenças de estabilidade:
· Microtúbulos de cílios e flagelos são muito estáveis;
· Microtúbulos do fuso mitótico são lábeis e transitórios.
Primeira observação dos microtúbulos
A primeira observação destas estruturas foi realizada por Robertis e Franchi, em 1953, no axoplasma das fibras nervosas, com a ajuda do microscópio eletrónico e o fixador glutaraldeído, sendo que os microtúbulos encontravam-se marcados com um anticorpo monoclonal anti-tubulina.
O que se verificou foi que os microtúbulos eram de facto muito importantes para a transmissão do impulso nervoso, quer nas dendrites quer no axónio. No entanto, a forma como eles estão dispostos nas dendrites e no axónio é diferente. No axónio estão todos no mesmo sentido e os polos com a mesma carga estão virados para o mesmo lado, ou seja, o polo positivo está junto aos terminais axonais (anterógrado: favorece o movimento rápido de neurotransmissores e de mitocôndrias), enquanto que o polo negativo está virado para o corpo celular. Por outro lado, nas dendrites, os microtúbulos apresentam as duas orientações.
O impulso nervoso dependa da:
· Map2 – está associada aos microtúbulos nas dendrites;
· MapT (Tau) – está associada aos microtúbulos apenas nos axónios (hiperfosforilação).
Composição
· Formados por polimerização de subunidades proteicas de tubulina.
· Cada subunidade é um heterodímero de moléculas globulares unidas por ligações não covalentes: tubulina α e tubulina β.
· A associação de subunidades forma protofilamentos.
· A associação de 13 protofilamentos leva à formação de 1 microtúbulo.
· Polimeriza e despolimeriza pela adição ou remoção das subunidades às extremidades.
· Contactos proteína-proteína: eixo x: α-β; eixo y: α-α e β-β: estabilidade helicoidal. 
Ultraestrutura
· Apresentam perfil circular com zona central pouco densa de 15nm de diâmetro, limitada por uma parede densa de 5nm de espessura.
· Cada microtúbulo é rodeado por uma zona de baixa densidade eletrónica onde não existem ribossomas.
· Observam-se 13 protofilamentos, separados por uma distância de 4.5nm de centro a centro.
· Isolados ou em feixe, seguem trajetórias retilíneas ou ligeiramente curvas (menos estáveis).
· Comprimento variável: desde 1 micra até alguns milímetros nos axónios das células nervosas.
Corte longitudinal
Corte transversal
Polimerização
Cada monómero de tubulina tem um local de ligação para uma molécula de GTP. Na tubulina α nunca é hidrolisado, mas na tubulina β pode estar nas formas de GTP ou GDP (dinâmica do microtúbulo).
O processo de hidrólise de GTP em GDP efetiva a ligação entre as subunidades α e β. No entanto, como a velocidade com que se associam as novas subunidades é maior do que a velocidade com que se hidrolisa o GTP em GDP, forma-se, na região central do microtúbulo, uma GTP cap, isto é, um conjunto de subunidades cuja componente β ainda não teve tempo de hidrolisar o GTP em GDP. Este GTP gap ajuda na polimerização do microtúbulo, pois funciona como um íman para atrair novas subunidades. 
Sabe-se que o processo de hidrólise de GTP em GDP, apesar de efetivar a ligação, torna esta ligação mais fraca do que a ligação no GTP cap, pois esta última é muito mais estável e tem um grau de liberdade muito maior para puder polimerizar e, de seguida, despolimerizar.
· A montagem dos microtúbulos a partir dos heterodímeros de tubulina é um processo especificamente orientado e programado.
· A quantidade de tubulina a ser polimerizada varia conforme as necessidades da célula.
· Em condições normais, os microtúbulos encontram-se em equilíbrio com a quantidade de tubulina livre.
· A extremidade + é constituída por tubulina β.
· GTP tem de estar ligado a ambas as subunidades, α e β para os heterodímeros se associarem em protofilamentos.
· A tubulina β ao entrar em contacto com α de outro dímero, provoca a hidrólise do GTP.
· Extremidade (-) serve assim como GAP (GTPase activating protein) para a tubulina β do dímero adjacente no protofilamento.
· Hidrólise do GTP a GDP acontece depois da ligação da tubulina e enfraquece as pontes que mantêm os microtúbulos unidos.
Polaridade estrutural
Extremidade positiva (+):
· Crescimento mais rápido.
· Geralmente voltada para o exterior.
· Ligam-se os heterodímeros.
· Tubulina β.
Extremidade negativa (-):
· Crescimento mais lento.
· Geralmente próxima do núcleo (imersa na matriz pericentriolar).
· Necessita de ser estabilizada.
· Tubulina α.
Polimerização vs Despolimerização
Na extremidade (+) forma-se o GTP cap uma vez que a velocidade com que as moléculas de tubulina β se unem é maior do que a da hidrólise do GTP. Assim sendo, o GTP cap é a zona mais estável dos microtúbulos favorecendo a polimerização.
Despolimerização
Polimerização
GDP ligado a moléculas de tubulina β provoca encurvamento protofilamentos, favorecendo a despolimerização.
GTP estimula uma polimerização linear, aumentando a taxa de crescimento.
Polimerização vs Despolimerização: fatores influenciadores
Despolimerização
· Falta de GTP (presença de GDP).
· Diminuição da temperatura.
· Iões Ca2+
· Ausência de proteínas MAP.
· Drogas (Colchicina).
· Vinblastina: impede a polimerização.
Polimerização· Presença de GTP.
· Aumento de temperatura.
· Iões Mg2+
· Proteínas MAP.
· Drogas (Placlitaxel).
Instabilidade dinâmica
Todos os microtúbulos têm um ciclo de vida, que está representado na imagem. Quando temos o início de formação de uma célula, há uma primeira fase de nucleação de microtúbulos, que corresponde à fase mais difícil e mais lenta da criação dos mesmos, visto que para formar um núcleo, apesar de ser necessário juntar apenas cerca de meia dúzia de subunidades, há um gasto energético muito grande. 
É muito mais fácil adicionar subunidades a um microtúbulo existente (elongação) do que começar um de novo (nucleação). Deste modo, a fase de nucleação pode ser reduzida ou suprimida pela adição de núcleos “pré-feitos”, como fragmentos de microtúbulos já polimerizados, tornando o processo muito mais eficiente.
Depois desta fase, há um crescimento exponencial bastante grande dos microtúbulos, passando pela fase de elongação e atingindo, por fim, a fase de equilíbrio, na qual o crescimento cessa. No alongamento, ou seja, durante a rápida fase de polimerização, a elevada concentração de tubulina livre induz o microtúbulo a polimerizar-se mais rapidamente do que a despolimerizar-se. 
A capacidade que os microtúbulos contêm de polimerizar e despolimerizar, de uma forma extremamente rápida, faz com que a célula atinja uma fase de equilíbrio, em que, para o resto da sua vida, a taxa de polimerização iguala a taxa de despolimerização. Assim sendo, a fase de equilíbrio é alcançada quando o crescimento do microtúbulo, devido à adição de monómeros, balança o encolhimento do microtúbulo, devido à sua despolimerização.
No patamar de polimerização nem toda a tubulina livre está polimerizada, porque as subunidades estão a dissociar-se nas extremidades, assim como, estão a ligar-se. A taxa de polimerização diminui com o tempo, porque é proporcional à concentração de tubulina livre. A concentração final de tubulina livre, no patamar, é balanceada de modo exato e é denominada concentração crítica.
Considerações gerais sobre a instabilidade dinâmica:
· Comportamento típico dos microtúbulos que traduz as flutuações polimerização/despolimerização.
· Treadmilling: ocorre quando uma extremidade de um microtúbulo cresce em comprimento enquanto que a outra encolhe, resultando em uma secção do filamento aparentemente "movendo-se" através de um estrato ou do citosol . Isso deve-se à constante remoção das subunidades de proteína desses filamentos em uma extremidade do filamento, enquanto que as subunidades de proteína são constantemente adicionadas na outra extremidade. 
· Consequência do GTP cap: regiões que contêm tubulina β–GDP despolimerizam mais rapidamente do que as β–GTP.
Relativamente à instabilidade dinâmica, existem concentrações de proteínas que são limitantes. Isto significa que, quando a célula está em condições de stress ocorre, momentaneamente, a despolimerização de todos os microtúbulos, ou seja, ocorre a transição de um estado de polimerização para a um estado de despolimerização, que se denomina catástrofe. A catástrofe é atribuída à perda súbita do GTP cap, abaixo de uma concentração crítica de tubulina na extremidade (+). Por outro lado, a mudança para crescimento do filamento é designada de salvamento, que corresponde à transição entre o estado de despolimerização e o estado de polimerização.
Estruturas formadas por microtúbulos
· Centríolos (associam-se em estruturas de 9x3 – 9 tripletos de microtúbulos): nas células animais, há o Centro Organizador de Microtúbulos – MTOC.
· Flagelos (associam-se em estruturas de 9x2+2): espermatozoide.
· Cílios (associam-se em estruturas de 9x2+2): epitélio das vias aéreas.
· Corpúsculo basal (associam-se em estruturas de 9x3): ancoragem e origem dos cílios.
Centro organizador de microtúbulos (MTOC)
Os microtúbulos organizam-se perpendicularmente a partir do centro organizador de microtúbulos, designado por centrossoma nas células animais. Logo ao microscópio, um corte aparece transversalmente e outro longitudinalmemte.
Durante a interfase, o MTOC está geralmente localizado perto do núcleo.
O centrossoma é composto por 2 centríolos, dispostos perpendicularmente, rodeados pela matriz pericentriolar.
A matriz pericentriolar possui tubulina γ, onde ocorre a nucleação dos microtúbulos.
Nem todos os MTOC têm centríolos como é o caso das plantas e dos ovócitos.
Centríolos
· Protofilamentos comuns nas “paredes” dos microtúbulos.
· O microtúbulo representado por A é um microtúbulo completo constituído por 13 protofilamentos.
· B e C são constituídos por menos de 13 protofilamentos: geralmente 10.
· O B associa-se ao A e o C associa-se ao B.
A
B
C
Replicação dos centríolos durante a divisão mitótica
· Separação dos dois centríolos perpendiculares um ao outro;
· Um centríolo filho cresce a partir de uma pequena estrutura, em forma de disco em ângulo reto, em relação ao centríolo pai;
· Seguindo igualmente duplicação, o material pericentriolar inicialmente é associado apenas a cada um dos centríolos pai;
· Proteína responsável: centrobina.
Centriole cylinders separate.
Shorter cylinders of same diameter appear at right angles & lengthe
Mitose e tipos de microtúbulos
· Polares: da matriz pericentriolar até ao “equador” da célula; têm a “ancher point” fixa na extremidade negativa (centrossoma).
· Cinetocorianos: formam-se a partir da matriz pericentriolar ligando-se ao cinetocoro sendo responsáveis pela organização da placa equatorial e segregação dos cromatídeos durante a anafase.
· Astrais: formam-se da matriz pericentriolar até à periferia da célula. O áster é formado pelo auxílio da proteína cinase denominada fator promotor da mitose.
Axonema (cílios e flagelos)
Os cílios e os flagelos associam-se em microtúbulos de 9x2+2, ou seja, na periferia têm 9 dupletos de microtúbulos e no centro têm mais dois microtúbulos (mais um dupleto). O dupleto central não se encontra acoplado como os dupletos da periferia, mas estão unidos por uma ponte central e rodeados por uma bainha central. Além disso, este dupleto apresenta-se ligado aos outros da periferia por uma projeção radial mediana e os dupletos da periferia estão ligados entre si por pontes de nexina. 
De cada microtúbulo A saem dois braços de dineína que são importantes para a motilidade (capacidade de se movimentarem) do cílio e do flagelo e no meio do microtúbulo A e B há projeções radiais periféricas (não está representado na imagem).
Corpúsculo basal
O corpúsculo basal associa-se em microtúbulos de 9x3 (tripletos) e não contêm nada no interior.
· Liga o axonema dos cílios ao restante citoesqueleto.
· Estrutura idêntica ao centríolo.
MAPs (Proteínas associadas aos microtúbulos – Microtubule-associated proteins)
· As MAPs têm um papel estrutural (estabilizando ou destabilizando os microtúbulos):
· regulam o comprimento dos microtúbulos;
· permitem a associação simultânea de várias moléculas de tubulina;
· estabelecem ligações entre os microtúbulos e outros componentes celulares.
· Um grande número de MAPs já foram identificadas e sabe-se que variam conforme o tipo de célula:
· MAP1 e MAP2 (células nervosas) e MAP4 (restantes células).
· Proteína Tau (55-62kDa): células nervosas.
· Proteínas motoras (dineínas e cinosinas).
Proteínas motoras
As proteínas motoras promovem o transporte de vesículas e organelos ao longo dos microtúbulos.
As dineínas e as cinosinas apresentam um polo que se liga ao microtúbulo e outro polo que se liga à vesícula ou organelo que têm de transportar e depois “caminham” sobre o microtúbulo até ao local onde têm de levar aquilo que transportam.
Fármacos que podem modelar a função dos microtúbulos
Estes fármacos vão-se associar ao microtúbulo favorecendo a sua despolimerização ou impedindo a sua polimerização.
· Colchicina:
· provoca a despolimerização do fuso mitótico, inibindo a apoptose;
· in vitro inibe a polimerização da tubulina;
· in vivo provoca a dissociação dos microtúbulos citoplasmáticos.
· Vinblastina:
· agente antimitóticousado no tratamento antitumoral.
· Taxol:
· alcaloide, usado no tratamento antineoplásico;
· interfere na formação do fuso acromático, impedindo a despolimerização dos microtúbulos de forma a não haver tubulina livre no citoplasma para formar os microtúbulos do fuso pelo que a mitose não se processa.
Microfilamentos
· Filamentos proteicos de 6 a 8 nm de diâmetro e de comprimento variável.
· Apresentam polaridade: Polo positivo (+) e polo negativo (-).
· Não são nucleados a partir de um centro.
· Funções:
· estabelecer, modificar e manter a forma das células;
· envolvidos na contração muscular/celular, endocitose, exocitose e pinocitose;
· locomoção:
· ciclose (tipo de movimento de geração de correntes citoplasmáticas);
· movimento ameboide (a célula troca de forma ativamente enviando pseudópodes citoplasmáticos na direção do movimento).
· Os microfilamentos (Actina F) são estruturas quaternárias que se formam pela polimerização de monómeros globulares de proteína actina G. Quando estas proteínas se associam para formar um microfilamento, então passamos a designar microfilamento de actina F.
· Existe um equilíbrio entre a forma monomérica (actina G) e a forma polimerizada (actina F).
· A actina G é um monómero quaternário que tem locais de ligação a moléculas de energia de ATP, que é a fonte de energia necessária para que estas moléculas se associem, e locais de ligação a iões, pois a formação destas moléculas é dependente desses iões.
· São fibras flexíveis que se organizam ou em redes tridimensionais (network) ou em feixes paralelos (bundles) formando uma estrutura tridimensional tipo gel.
	
· A rede tridimensional tem uma vantagem em relação aos feixes paralelos, pois conseguem criar espaços que permitem uma maior concentração de sais e esta concentração de sais permite uma maior retenção de água. Logo quando há uma maior disposição dos microfilamentos em rede tridimensional, em relação aos feixes paralelos, o citoplasma é mais viscoso.
· As cadeias de microfilamentos, na rede tridimensional e nos feixes paralelos, estão ligadas por proteínas de ligação cruzada (cross-link protein).
Modelo de Organização Estrutural
Admitia-se que os microfilamentos eram constituídos por duas cadeias de actina F enroladas helicoidalmente.
Atualmente, o modelo mais provável é aquele que se trata de apenas um filamento formado por uma cadeia simples de monómeros que se dobra sobre si mesma e depois enrola-se sobre si mesma.
Polimerização
ACTINA G
· Molécula globular bipartida unida por uma fenda onde se encontra o ião Mg2+ ligado a ATP ou ADP.
· A molécula está ainda dividida em quatro subdomínios.
· O ATP hidrolisa em ADP + Pi quando a actina G polimeriza, ocorrendo o inverso no processo de despolimerização.
· De formato globular, é mais frequente em soluções de baixa concentração em iões metálicos. 
ACTINA F
· Constituída por uma cadeia de monómeros de actina G.
· Estrutura polarizada.
· No polo positivo (barbed end) associam-se com facilidade os monómeros de actina G ligados a ATP, permitindo o aumento do polímero de actina F. Neste polo também se encontram os grupos amino e ácido dos aminoácidos.
· No polo negativo (pointed end) ocorre com facilidade a saída de actina ligada a ADP, permitindo a diminuição do polímero de actina F.
· A extremidade positiva está normalmente em regiões de elevada concentração de monómeros de actina G, enquanto a extremidade negativa está exposta à solução envolvente.
Treadmilling
Nucleação
· Fase mais lenta da polimerização;
· Fase de formação de um dímero;
· A formação de um trímero leva à estabilização das interações moleculares.
Alongamento
· Adição de actina G nos polos (+) e (-);
· Formação de filamento de actina F (polímero helicoidal longo).
Equilíbrio
· Troca de ATP/ADP e vice-versa – tal como os microtúbulos, também há uma efetivação da ligação, mas esta também se torna mais fraca para favorecer depois a despolimerização.
· Taxa de polimerização iguala a taxa de despolimerização;
· Comprimento do polímero mantém-se constante.
· No polo (+), as subunidades associam-se e, por isso, favorece a polimerização.
· O polo (-) é o local de saída das subunidades e, por isso, favorece a despolimerização.
	
Na Fase de Equilíbrio atinge-se uma concentração crítica de monómeros de actina G, podendo ocorrer três situações distintas:
· Quando a concentração em actina G é menor que a concentração crítica da extremidade positiva, não ocorre polimerização de actina F em nenhum dos extremos.
· Quando a concentração de actina G é maior que a concentração crítica para a extremidade negativa, há crescimento da actina F em ambos os extremos, só que mais rapidamente a partir da extremidade positiva.
· Quando a concentração em actina G está entre os níveis das concentrações críticas das extremidades positiva e negativa, ocorre crescimento de actina F apenas na extremidade positiva.
	
Nota:	nos microfilamentos, apesar do gráfico ser igual, não se fala em instabilidade dinâmica, mas sim em Treadmilling. O processo é igual, ocorrendo na mesma um crescimento exponencial, depois da nucleação.
Time
Extent of Polymerization
Lag phase
Extention
Equilibriu
Extensão de polimerização vs Tempo
ABPs (Proteína de ligação à actina – Actin Binding Proteins)
A partir do estudo aprofundado dos eritrócitos, tem sido possível conhecer as proteínas que se ligam à actina.
Os eritrócitos possuem características que facilitam esse estudo:
· são células desprovidas de núcleo e organelos celulares;
· as proteínas associadas à membrana plasmática podem ser facilmente isoladas;
· o citoesqueleto é apenas constituído por actina, não existindo os outros componentes do citoesqueleto, tais como microtúbulos e filamentos intermédios.
Existem cerca de 100 ABP’s.
As ABP’s podem interferir com a dinâmica de despolimerização e polimerização dos microfilamentos ou promover ligações entre diferentes microfilamentos, modificando a estabilidade estrutural dos mesmos
As ABP’s mediam as ações entre microfilamentos e outros organelos/membranas ou funcionam como motores (ex.: microfilamentos associados à ABP miosina, são determinantes na citocinese e fagocitose).
Proteínas Transmembranares
A elevada concentração de filamentos de actina na periferia da célula favorece a associação das proteínas transmembranares o que leva a que:
· Proteínas encontrem um substrato de fixação.
· A membrana adquira uma forma mais estável.
· A membrana funcione mais eficazmente na condução de informação do meio intra para extracelular e vice-versa.
· A rede de espectrina-actina liga-se à membrana plasmática através da Anquirina. Esta por sua vez, liga a espectrina à proteína transmembranar Banda 3 e esta liga o citosqueleto à membrana celular. Uma outra ligação adicional entre a membrana plasmática e os filamentos de actina pode ser conferida pela Banda 4.1. Esta liga-se às junções de espectrina-actina e reconhece os domínios citoplasmáticos da Banda 3 e da glicoforina, outra proteína transmembranar.
	
Espectrina:
· É uma proteína que permite a manutenção da integridade da membrana plasmática e da estrutura do citosqueleto;
· É uma proteína membranar periférica citosólica;
· Representa o citosqueleto submembranar. A sua disrupção origina a desintegração da membrana celular.
Integrinas:
· Formam heterodímeros de duas cadeias (α e β);
· Uma das funções das integrinas é a adesão da célula à matriz extracelular;
· A maioria das integrinas estabelece ligação com os filamentos de actina.
Actinina α:
· Família de proteínas de ligação à actina;
· São encontradas em grande quantidade numa variedade de tecidos e organismos;
· A localização subcelular mais bem conhecida para esta proteína é o disco Z do músculo estriado onde liga de forma cruzada filamentos de actina antiparalelos, formando a banda I;
· No músculo liso, podem ser encontradas no citoplasma e nas placas de adesão associadas à membrana;
· Nas células não musculares surge nas fibras de stress e nas adesões focais;
· A actinina α é composta por duas cadeias peptídicasidênticas e antiparalelas, sendo, por isso, um homodímero;
· São proteínas tipicamente sensíveis ao cálcio nas células musculares e insensíveis ao cálcio nas restantes células;
· O seu mecanismo de atuação ao nível da regulação da dinâmica de polimerização dos microfilamentos consiste na sua ligação a uma das extremidades, impedindo o seu crescimento ou a sua dissociação;
· Na organização espacial dos microfilamentos favorece a formação de redes.
Titina:
· Proteína de grandes dimensões;
· Abundante no músculo esquelético e com isoformas presentes no músculo liso;
· Presentes também em algumas células não musculares;
· São um componente estrutural do núcleo;
· Contactam com a actinina α no disco Z para estimular o sarcómero durante o desenvolvimento muscular.
Caderinas:
· Existem 2 classes de adesão entre células (Ca2+ dependentes e Ca2+ independentes);
· São glicoproteínas integrais contendo cerca de 700 aa;
· Existem mais de 12 caderinas conhecidas que medeiam a adesão célula-célula dependente de Ca2+.
Cross linking proteins
Filamina:
· Faz com que os filamentos de actina se associem em redes (networks) espaçosas, responsáveis pela consistência em gel de alguns locais do citosol.
Proteína ARP 2/3
· Medeia a nucleação;
· É abundante nos lamelipodia;
· O complexo ARP2/3 liga-se aos lados de um filamento de actina já existente, e favorece a formação de um novo filamento de actina. A estrutura ramificada resultante tem uma conformação em Y.
Família Rho
Família de pequenas proteínas que se ligam ao GTP, regulando o citosqueleto de actina.
Alguns membros da família Rho:
· Rac ativa a formação de lamelipodia;
· Cdc42 ativa a formação de filipodia;
· Rho ativa a formação de adesões focais e fibras de stress.
Proteínas estabilizadoras estruturais “Capping”
· Anexam-se aos extremos das cadeias de actina. Essa ligação depende do polo da actina;
· Podem estabilizar ou promover a desintegração do filamento;
· Exemplos:
· A citocalasina liga-se ao polo (+) da actina F e bloqueia a adição de subunidades provocando a despolimerização na extremidade (–);
· Tropomodulinas limitam o polo (-), estabilizando os filamentos;
· CapZ capping protein liga-se ao polo (+), inibindo a polimerização.
Proteínas estabilizadoras estruturais “Severing”
· Controlam o comprimento das cadeias de actina alterando a sua dinâmica;
· Dividem as cadeias de actina em segmentos menores;
· A ligação do filamento com a proteína é forte e estável;
· Pode ocorrer “capping” após a segmentação do filamento;
· A Gelsolina e a Profilina intervêm tanto em processos de “Severing” como “Capping”;
· Os processos de “Severing” são importantes tanto na locomoção como na citocinese.
Especialização da membrana
Microvilosidades
· São extensões da superfície celular (projeções da membrana), estando cada uma associada a um córtex central e denso de filamentos de actina (“longitudinal bundles”);
· No seu interior, os microfilamentos de actina estão dispostos paralelamente e encontram-se unidos por ABP’s como a fimbrina;
· São extremamente pequenas (< 500 nm) e finas (“hairlike”);
· Apresentam um diâmetro de 0,08 μm;
· Aumentam a área da superfície da célula, facilitando a absorção e secreção;
· Formam estruturas estáveis, funcionando como “building blocks” para a formação de outras especializações;
· Na base das microvilosidades são observáveis mais filamentos de actina, perpendiculares, formando uma rede terminal (“terminal web”);
· A ponta da microvilosidade é constituída por uma substância amorfa, na qual está imersa a extremidade (+) da actina, e a extremidade (-) está conectada ao córtex.
	
	
		
Estereocílios
Presentes nos:
· Canais excretores genitais masculinos (epidídimo e canal deferente):
· Estereocílios são mais longos que as microvilosidades, sendo preenchidos por um feixe maior de actina. A fimbrina mantém os feixes paralelos e firmes e a vinculina prende-os à membrana celular. O polo (+) reside no topo do estereocílio, facilitando a polimerização. Formam uma rede, que facilita a progressão do sémen e que ajuda na remoção dos espermatozoides alterados.
· Ouvido Interno:
· Os estereocílios auditivos situam-se nas células ‘cabeludas’ do ouvido interno [aglomerados de estereocílios], sendo maiores e mais largos do que os que encontramos nos canais excretores genitais masculinos. Estes, porém, não se encontram ramificados.
Papel na contração
· As células musculares esqueléticas são multinucleadas, formadas por microfilamentos denominados de miofibrilas. Estas são formadas por unidades que se repetem, denominadas sarcómeros, que confere ao músculo esquelético, uma aparência estriada.
· A contração muscular corresponde a um encurtamento das fibras musculares como resposta normal a um estímulo nervoso.
Papel na citocinese
· A Citocinese, em células animais, ocorre de forma centrípeta e deve-se à formação de um anel contrátil que provoca um estrangulamento progressivo até à divisão do citoplasma. Esse anel é composto por 2 cadeias pesadas de miosina II e microfilamentos de actina F.
· Experiências comprovaram que a citocinese depende da miosina II, pois ela desliza sobre os filamentos de actina em direções opostas, causando a divisão celular.
Papel na motilidade celular
· Migração de células embrionárias durante o desenvolvimento.
· Invasão dos tecidos pelos leucócitos durante uma infeção (diapedese).
· Migração de células envolvidas na cicatrização.
· Fagocitose.
· Através de projeções membranares: filipódios, lamilepódios e pseudópodes.
Fármacos que podem modelar a função dos microfilamentos 
· Faloidina:
· Alcaloide produzido por uma espécie de cogumelos (Amanita phaloides).
· Estabiliza os microfilamentos, pois ao se ligar a uma extremidade do microfilamento impede a sua despolimerização.
· Citocalasinas:
· Destabilizam os microfilamentos,	pois ao se associarem aos microfilamentos impedem a sua polimerização.
Filamentos intermédios
· Designam-se assim uma vez que o seu diâmetro (10nm) está compreendido entre o dos microtúbulos e o dos microfilamentos.
· Não apresentam polaridade, pois não dependem de uma fonte de energia para se associarem às subunidades.
· Não são nucleados a partir de um centro.
· Funções:
· Sustentação: desmossomas e hemidesmossomas;
· Apoio, resistência e estabilidade mecânica às células;
· Estabilidade estrutural e posicionamento do núcleo;
· Diminuem a probabilidade de ocorrência de apoptose, visto que os filamentos intermédios estão a suster o invólucro nuclear das células eucarióticas.
· Não há instabilidade dinâmica nem treadmilling.
· O processo de formação é muito eficaz e muito limitante.
Estrutura e organização bioquímica
· São encontrados em quase todas as células eucarióticas e na maioria das células animais formam uma rede por todo o citoplasma, circundando o núcleo e estendendo-se para a periferia da célula.
· Estão com frequência agregados à membrana plasmática nas junções célula-célula onde a face externa da membrana está conectada com a célula vizinha.
· São evidentes no interior do núcleo ao nível da lâmina nuclear, constituinte de todas as células eucarióticas, revestindo internamente o invólucro nuclear e reforçando-o.
· São os mais recentes na escala filogenética.
· Parecem específicos dos organismos multicelulares.
· A rede de filamentos intermédios, extremamente insolúvel (solúvel apenas em ureia), não é facilmente deformada conseguindo suportar grandes tensões sem entrar em rutura (extremamente estável).
Polimerização / Despolimerização
· Semelhantes a cabos formados por muitos “fios” longos enrolados, o que proporciona elevada resistência às tensões mecânicas.
· Os “fios” desse cabo são monómeros de proteínas fibrosas de cadeia longa (proteínas filamentares).
· Cada monómero é composto por uma hélice α central mais longa, comum a todos os FI, e limitada por uma cabeça (terminal amino) e uma cauda (terminal hidróxido), com estrutura mais flexível e variável.
· As subunidades são tetrâmeros, ou seja, têm 4 monómeros. Este tetrâmero pode ser um homotetrâmero(4 subunidades proteicas idênticas) ou um heterotetrâmero (4 subunidades proteicas diferentes).
Região central hélice α
· A cadeia central em hélice α das diferentes proteínas que formam os FI são similares em tamanho e sequência de aminoácidos (300-330 aa, heptad repeat), deste modo a sua união forma sempre filamentos com diâmetro e estrutura interna semelhantes.
· Os heptad repeat correspondem às sequências de aminoácidos repetidas nos quatro subdomínios da hélice α que se repetem ao longo da cadeia, intervalados por três regiões não-helicais denominadas spacers. Também é normalmente reconhecida na cadeia central em hélice α uma descontinuidade chamada stutter que pode alterar o carácter da hélice α localmente.
spacer s
Região terminal
· Expostas na superfície do filamento.
· Envolvidas principalmente em interações com outros componentes do citoplasma.
· Específicas para cada tipo de proteína.
· Apresentam grande variação entre as diferentes proteínas, tanto no tamanho como na sequência de aminoácidos.
· A região carboxilo é a mais variável.
Terminal amino
Terminal carboxilo
· A cabeça (terminal amino) e a cauda (terminal carboxilo) não-helicais são normalmente constituídas por 3 regiões distintas:
· E1 (cabeça) e E2 (cauda) - subdomínios nos extremos do monómero com carga muito acentuada;
· V1 (cabeça) e V2 (cauda) - domínios variáveis que contém sequências repetitivas soltas [normalmente similares em proteínas expressas em tecidos similares];
· H1 (cabeça) e H2 (cauda) - extensões hipervariáveis que normalmente contém possíveis locais de fosforilação. São os locais de ligação entre monómeros.
Dímeros
· Os monómeros enrolam-se aos pares (dímeros), formando uma estrutura espiral em coiled coil, constituída por duas cadeias polipeptídicas idênticas.
· Os dímeros formados possuem orientações paralelas (os terminais NH2 e COOH estão alinhados). Esta evidência, foi comprovada através de experiências de labeling com anticorpos para os terminais NH2 e COOH, e medem 48 nm.
· As moléculas de NH2 interagem uma com a outra, tal como acontece com as moléculas de COOH, devido ao enrolamento dos monómeros. Só depois desta fase é que se forma a subunidade – tetrâmero.
Tetrâmeros
· O tetrâmero faz com que os dímeros se associem lado a lado, antiparalelamente, conferindo uma simetria quanto aos seus terminais NH2 e COOH o que faz com que os filamentos intermédios sejam apolares. No entanto, há um desfasamento na ligação, ou seja, o terminal amina não interage diretamente com o terminal carboxilo, mas permite que haja um encaixe entre as subunidades de tetrâmeros, tornando a ligação mais forte
· Os tetrâmeros existem individualmente, em pequenas quantidades, na célula, sendo vistos como a subunidade básica solúvel dos filamentos intermédios.
Protofilamentos
· Os tetrâmeros ligam-se uns aos outros pelas extremidades, formando protofilamentos.
· Filamento Intermédio é formado pela associação de 8 protofilamentos.
Em (A) representa-se uma proteína monomérica do filamento intermédio. Os monómeros associam-se aos pares para formar um dímero (B), e dois dímeros alinham-se formando um tetrâmero (C). Os tetrâmeros podem reunir-se pelas extremidades (D), organizando-se em disposição helicoidal, produzindo o filamento completo em forma de corda (E). 
As proteínas podem formar:
· Homopolímeros.
· Heteropolímeros.
A variedade de ligações que as proteínas podem realizar para hormar homo ou heteropolímeros depende das interações hidrofóbicas nos segmentos em hélice α, mas, principalmente, das sequências spacer e das sequências terminais NH2 e COOH do filamento intermédio em questão. Mutações nestas zonas provocam a formação de hetero-oligómeros com proteínas, bloqueando a polimerização num estado intermédio.
Controlo dos processos
· Terminais NH2 – processo de polimerização.
· Terminais COOH – afetam a estabilidade dos filamentos intermédios.
A polimerização dos FI é quase total, ou seja, quase todas as proteínas dos FI constituem FI completos.
Exceção: tetrâmeros livres no citoplasma das células que se podem polimerizar rapidamente e juntar-se a uma rede de FI já existente.
A introdução de proteínas de filamentos intermédios mutantes bloqueia a formação dos filamentos intermédios.
A fosforilação de um aminoácido no terminal NH2 de diversos FI leva à despolimerização do filamento. Embora também possa ocorrer fosforilação ao nível do terminal COOH, mas esta não é determinante para a despolimerização.
As queratinas são uma exceção, pois formam filamentos mesmo se ambos os domínios terminais estiverem ausentes.
Portanto, o terminal NH2 tem um papel importante na formação da maioria dos FI, assim como o terminal COOH, já que parece afetar a estabilidade do filamento, assim como as interações entre FI e outros componentes celulares.
Apesar de terem propriedades dinâmicas, os FI são os componentes mais estáveis do citoesqueleto, isto é, quando se formam adquirem o tamanho no qual permanecerão.
Estas propriedades são mantidas à custa de um mecanismo que assegura a constante troca de partículas entre a fração polimerizada e despolimerizada, isto é, os filamentos alternam continuamente (equilíbrio) entre pequenas frações de proteína de FI despolimerizada e FI completamente polimerizados. A fosforilação reversível é um dos processos que possibilita este equilíbrio.
Atuação nos filamentos da lâmina nuclear (rede de FI da periferia do nucleoplasma)
Um dos mecanismos que promovem o controlo dos processos de polimerização e despolimerização é essencial para ultrapassar as dificuldades a nível da mitose (tais como a grande estabilidade dos FI da célula que dificultam a reorganização do citoesqueleto) e trata- se da fosforilação de resíduos específicos de serina no terminal NH2 do FI por ação da cdc2-cinase. Se isso ocorrer nas proteínas envolvidas na formação das lâminas nucleares, verifica-se o seu desmantelamento total durante a mitose, reconstruindo-se a lâmina nuclear. 
Lâmina nuclear
Fosforilação
Dímeros de lamina
Mutações nas proteínas que servem de alvo à serina fazem com que seja impossível a sua fosforilação e levam a que os FI fiquem intactos e não se despolimerizem imediatamente na mitose. Por outro lado, a administração de substâncias inibidoras das fosfatases proteicas provocam um colapso rápido da rede de lâminas à volta do invólucro nuclear.
O processo de polimerização e despolimerização dos FI é regulado por um equilíbrio entre fosfatases e cinases. Esta regulação é baseada na fosforilação reversível de um certo número de locais de fosforilação localizadas, maioritariamente no terminal NH2.
A polimerização é ainda influenciada pela concentração salina e pelo pH.
Tipos de filamentos intermédios
· Tipo I: filamento intermédio de queratina ácida;
· Tipo II: filamento intermédio de queratina básica;
· Tipo III: proteínas presentes em tecidos conjuntivos e musculares;
· Tipo IV: proteínas que pertencem essencialmente ao sistema nervoso;
· Tipo V: lâmina nuclear;
· Tipo VI: filamento intermédio de nestina.
As proteínas apresentam diferenças ao nível do DNA e, consequentemente, dos aminoácidos, o que permite distingui-las em diferentes tipos. No entanto, dentro de um mesmo grupo existem semelhanças entre aminoácidos.
Apesar das divergências existentes, verifica-se a existência de complementaridade entre os vários grupos de FI. Para tal contribui a organização estrutural comum, bem como as semelhanças morfológicas devido à hélice a e aos domínios NH2 e COOH.
Aplicação dos FI no diagnóstico diferencial
Filamentos intermédios:
· São específicos de algumas células e da sua fase de desenvolvimento, o que se torna útil na caracterização por imunofluorescência de tumores de origem desconhecida e de diagnóstico histológico difícil pelos métodos habituais;
· A diversidade das suas funções no interior das células faz com que tenha muito interesse para estudos sobre embriogénese, fisiologia e patologia de origem animal;
· A identificação das suas proteínas nas célulastumorais auxilia na escolha do tratamento, pois os tumores epiteliais e mesenquimatosos são sensíveis a tratamentos diferentes, podendo escolher-se o mais eficiente..
Células tumorais:
· Perdem a forma pelo que não podem ser identificadas através da sua morfologia
· Contudo, mantêm algumas propriedades das células originais, como a expressão das proteínas de FI
· Assim, introduzindo anticorpos fluorescentes específicos dessas proteínas, pode determinar-se se o tumor foi originado no tecido epitelial, mesenquimatoso ou neuronal.
· Exemplo: os tumores malignos da mama e do trato gastrointestinal contêm queratinas e não vimentinas, logo derivam de células epiteliais (que contêm queratinas e não vimentinas), e não de células mesenquimatosas (que contêm vimentinas e não queratinas).
IFAPs (Proteínas associadas a filamentos intermédios – Intermediate Filaments-Associated Proteins)
Objetivo: ligar os FI entre si ou a outras estruturas celulares. 
Variedade: existem diferentes tipos e têm funções distintas.
Estruturas associadas aos FI
Adesões celulares
· Constituem uma especialização da superfície celular, formando regiões pontuais de adesão entre células.
· Os tipos de FI ligados aos desmossomas dependem do tipo de célula: filamentos de queratina nas células epiteliais, filamentos de desmina nas células do músculo cardíaco…
· A existência de desmossomas e consequente ligação entre células promove a resistência à tração e à pressão por parte das células.