Slides Teste western blot

Prévia do material em texto

TESTE WESTERN 
BLOT
Cicero Neto, Daniel de Souza, Gabriela 
Cartaxo, Rebeca Costa, Yasmin Matos.
Medicina Veterinária 106.3
Imunologia Veterinária
Na década de 70, possibilitou que proteínas separadas pela eletroforese fossem detectadas, caracterizadas 
e quantificadas;
Marcou grande avanço na técnica de diagnóstico de diversas doenças, como a AIDS (em humanos) ou 
encefalopatias espongiformes transmissíveis (EETs);
É um exame que se trata de alta sensibilidade e especificidade;
É um método de rápida execução, precisão e acessível aos laboratórios de pesquisa e de serviço de rotina 
diagnóstica.
O WB é um teste imunoenzimático que utiliza membrana de nitrocelulose como fase sólida e detecta 
anticorpos contra proteínas virais específicas. 
Como vantagens:
◦ membranas úmidas são maleáveis e de fácil 
manuseio; 
◦ as proteínas imobilizadas na membrana são 
rapidamente e uniformemente acessíveis a 
diferentes ligantes; 
◦ somente uma pequena quantidade de 
reagentes é necessária para a análise de 
transferência; 
◦ é possível fazer múltiplas réplicas do gel; 
◦ o armazenamento da amostra transferida 
pode ser prolongado, antes de ser usada e a 
mesma proteína transferida pode ser usada 
para múltiplas análises sucessivas. 
Protocolo básico
◦ preparação das amostras e fracionamento 
de proteínas;
◦ execução da eletroforese em gel;
◦ transferência das proteínas separadas do 
gel para uma membrana adsorvente;
◦ bloqueio de ligações inespecíficas
◦ adição de anticorpo específico e detecção 
da reação.
Preparação
do tecido;
Eletroforese
em gel;
Transferência;Bloqueio;
Detecção; Análise.
Preparo
◦ A preparação de amostras é um dos passos cruciais do processo de separação de proteínas;
◦ Os resultados do experimento dependem das condições iniciais do material;
◦ Cada tecido possui sua particularidade e alguns agentes acometem órgãos-alvo, os quais devem ser 
escolhidos para a realização de um correto diagnóstico;
◦ Homogeneização - obtenção de amostras com mesma composição e estrutura em seu volume. Este 
processo deve alterar as propriedades físicas sem provocar qualquer mudança na composição 
química da amostra. 
Os métodos de homogeneização usados podem ser divididos em cinco categorias: 
1. por homogeneização mecânica
2. Ultrassônica
3. por pressão
4. por descongelamento e osmótica
5. lise por detergentes
Fracionamento
◦ Pré-fracionamento - isolar amostras em 
frações distinguíveis contendo número 
restrito de moléculas;
◦ Proteínas pouco abundantes possuem 
valiosas informações diagnósticas e são 
responsáveis por processos importantes na 
célula.
Eletroforese
A eletroforese é um processo analítico de separação de proteínas e outras moléculas, em que a migração 
de partículas acontece em um campo elétrico (matriz). 
O fracionamento de proteínas por eletroforese começou no início do século 20 com a técnica de 
eletroforese livre em solução tampão, criada por Arne Tiselius em 1937, a qual foi substituída pelo uso de 
géis de poliacrilamida e agarose
A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) é um método simples e rápido que separa pequenas 
proteínas de tamanhos diferentes usando enzimas de restrição.
Transferência para
membrana
• A fim de tornar as proteínas 
acessíveis à detecção por 
anticorpos realiza-se a 
transferência destas de um 
gel para uma membrana 
adsorvente;
• O principal método de 
transferência de proteínas 
do SDS-PAGE para uma 
membrana de nitrocelulose 
ou de PVDF tem sido o de 
electroblotting
11/06/2020
Adição do anticorpo – ligações específicas
a) Conjugação do anticorpo com uma enzima: 
11/06/2020
b) Associação do anticorpo com um fluoróforo:
11/06/2020
11/06/2020
Diagnóstico
A leitura é realizada por observação das bandas identificadas nas tiras, sem a necessidade de uso de 
qualquer tipo de aparelho. 
Como fazer a leitura:
◦ T Inicie pela tira do controle negativo para avaliar se existem erros operacionais. 
◦ No controle negativo não deve haver nenhuma banda. 
◦ T Observe a tira do controle positivo, verificando se estão presentes todas as bandas descritas pelo 
fabricante. 
◦ T Após a validação dos controles, faça a leitura das amostras de soro testadas por comparação e 
identificação das bandas. 
Para a interpretação dos resultados, os critérios a ser seguidos estão descritos nas instruções do 
conjunto diagnóstico – padrões base de como as faixas devem aparecer. A interpretação do WB 
depende do número e principalmente da combinação das proteínas virais detectadas. 
11/06/2020
Exemplo de 
resultados do WB 
para HTLV-I/II (vírus 
humano)
11/06/2020
Padrão de bandas Resultado
Se segue padrão de bandas do controle positivo/fab Positivo
Ausência de bandas Negativo
Qualquer outro padrão Indeterminado
11/06/2020