AULA 8 Técnicas de Coloração e Visualização dos microrganismos

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Curso Técnico em Alimentos Integrado ao Ensino Médio 
2º ano 
Microbiologia de Alimentos 
Profa. Fernanda Teixeira Macagnan 
 
 
 
AULA 8 – TÉCNICAS DE COLORAÇÃO E VISUALIZAÇÃO DOS MICRORGANISMOS 
 
Na aula de hoje vamos aprender os princípios de algumas técnicas de coloração 
relevantes na microbiologia de alimentos, pois nos permitem a visualização dos 
microrganismos no microscópio óptico e, dessa forma, conseguimos identificar 
características estruturais/morfológicas importantes para diferenciá-los. 
Assim, para melhor compreensão deste conteúdo, revise primeiramente alguns 
conceitos da aula de Microscopia (microscópio óptico, campo claro e escuro) e, também, da 
aula sobre Citologia e Morfologia Bacteriana (parede celular de gram-positivas e gram-
negativas). 
Após ler o conteúdo teórico da aula de hoje, assista os vídeos disponibilizados sobre 
Coloração de Gram para melhorar seu aprendizado teórico-prático. 
Bons estudos! 
 
Otimização e aumento do contraste na Microscopia Óptica. 
 
Como a maioria dos microrganismos aparece quase incolor quando observada 
através de um microscópio óptico padrão, muitas vezes devemos prepará-los para a 
observação. Uma das formas pelas quais isso pode ser é através da coloração da amostra. 
Na microscopia óptica, o aumento do contraste melhora a imagem final observada. A técnica 
de coloração (simples ou diferencial) é uma forma rápida e simples de melhorar o contraste 
(Figura 1). 
Coloração significa simplesmente corar os microrganismos com um corante que 
enfatize certas estruturas. Os corantes são compostos orgânicos, sendo que cada classe de 
corantes apresenta afinidade específica por determinados compostos celulares. Vários 
corantes utilizados em microbiologia são carregados positivamente, sendo, por essa razão, 
denominados corantes básicos. Exemplos de corantes básicos incluem o azul de metileno, o 
cristal violeta e a safranina. Corantes básicos se ligam fortemente aos constituintes celulares 
carregados negativamente, como ácidos nucleicos. Uma vez que as superfícies celulares 
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tendem a ser carregadas negativamente, esses corantes também combinam-se com elevada 
afinidade à superfície das células, sendo, assim, excelentes corantes de uso geral. 
Os corantes ácidos não são atraídos pela maioria dos tipos de bactérias porque os 
íons negativos do corante são repelidos pela superfície bacteriana carregada 
negativamente; assim, a coloração cora o fundo. A preparação de bactérias incolores contra 
um fundo corado é denominada coloração negativa. Ela é valiosa para a observação geral 
de formas da célula, tamanhos e cápsulas, pois as células tornam-se altamente visíveis 
contra um fundo escuro contrastante. 
 
 
Figura 1. Tipos de colorações utilizadas em microscopia óptica. 
 
 
Coloração simples X Coloração diferencial 
Uma coloração simples é uma solução de um único corante, e ela pode ser positiva 
ou negativa. A coloração positiva é baseada na utilização de corantes carregados 
positivamente (corantes básicos) e a negativa baseada na utilização de corantes carregados 
negativamente (corantes ácidos). Figura 
 
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Figura 2. Tipos de coloração simples. A. Coloração simples positiva. Esfregaço da forma tripomastigota 
do Trypanosoma cruzi corada pelo corante de Giemsa. A coloração mostra estruturas do parasito. B. Coloração negativa 
do fungo Cryptococcus neoformans utilizando a tinta nanquim. Nota-se que o fundo da lâmina se apresenta mais escuro 
que o microrganismo. 
 
Na coloração diferencial são empregados dois corantes contrastantes que vão gerar 
colorações diferentes em grupos distintos de bactérias. Corantes que conferem diferentes 
cores a diferentes tipos de células são denominados corantes diferenciais. As colorações 
diferenciais são utilizadas para: (a) separação de diferentes grupos de bactérias; (b) 
visualização de estruturas particulares de alguns grupos de bactérias. No primeiro caso, as 
duas colorações diferenciais mais utilizadas para classificação de bactérias são o método de 
Gram e a coloração de resistência ao álcool-ácido (Ziehl-Neelsen). No segundo caso, 
podemos citar a coloração de endósporos, também conhecida como técnica de Schaeffer-
Fulton, o método de Leifson para coloração de flagelos e a coloração de cápsulas. Nesse tipo 
de coloração os corantes se ligam somente a determinadas porções de uma célula, 
facilitando sua identificação. 
Um importante procedimento de coloração diferencial, amplamente utilizado em 
microbiologia, é a coloração de Gram. Esta coloração foi desenvolvida em m 1884 pelo 
bacteriologista Hans Christian Gram. De acordo com sua reação à coloração de Gram, 
bactérias podem ser divididas em dois grupos principais: gram-positivas e gram-negativas. 
Após a coloração de Gram, as bactérias denominadas gram-positivas adquirem cor púrpura 
(roxo), enquanto as gram-negativas apresentam coloração cor-de-rosa. Essa diferença de 
reação à coloração de Gram deve-se às diferenças na estrutura da parede celular das células 
gram-positivas e gram-negativas. 
 
A B 
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Coloração de Gram 
1º Preparação e fixação do esfregaço (Figura 3): 
Antes que os microrganismos possam ser corados, devem ser fixados (aderidos) à 
lâmina do microscópio. A fixação simultaneamente mata os microrganismos e os fixa na 
lâmina. Ela também preserva várias partes dos microrganismos em seu estado natural com 
apenas um mínimo de distorção. 
Dessa forma, um filme delgado de material contendo os microrganismos é espalhado 
sobre a superfície da lâmina. Esse filme, denominado esfregaço, é deixado secar ao ar. A 
lâmina é então fixada pela passagem, várias vezes, sobre a chama de um bico de Bunsen, 
com o lado do esfregaço para cima. Pronto, agora o procedimento de coloração pode ser 
aplicado, lavado e seco. 
 
 
Figura 3. Preparação e fixação do esfregaço. 
 
2º Procedimentos para a Coloração de Gram (Figura 4): 
1. Um esfregaço fixado pelo calor é recoberto com um corante básico púrpura, 
geralmente o cristal violeta. Uma vez que a coloração púrpura impregna todas as 
células, ela é denominada coloração primária. 
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2. Após um curto período de tempo, o corante púrpura é lavado, e o esfregaço é 
recoberto com iodo, um mordente (substância química utilizada para intensificar 
a coloração). Quando o iodo é lavado ambas as bactérias gram-positivas e gram-
negativas aparecem em cor violeta escuro ou púrpura. 
3. A seguir, a lâmina é lavada com álcool ou uma solução de álcool-acetona. Essa 
solução é um agente descolorante, que remove o púrpura das células de algumas 
espécies, mas não de outras. O tratamento com o etanol descora as células gram-
negativas, mas não as gram-positivas. 
4. O álcool é lavado, e a lâmina é então corada com safranina, um corante básico 
vermelho. O esfregaço é lavado novamente, seco com papel e examinado 
microscopicamente. 
5. Resultado no microscópio: as bactérias denominadas gram-positivas adquirem 
cor púrpura (roxo), enquanto as gram-negativas apresentam coloração cor-de-
rosa. 
 
 
 
 
Figura 4. Coloração de Gram. (a) 
Procedimento. (b) Micrografia de bactérias 
coradas pelo Gram. Os bastonetes e os cocos 
(roxo) são gram-positivos, e os vibriões (rosa) 
são gram-negativos. 
 
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E qualo mecanismo da Coloração de Gram? 
O mecanismo tem como base as diferenças nas estruturas da parede celular das 
bactérias gram-positivas e gram-negativas e como cada uma dessas estruturas reage aos 
vários reagentes (substâncias utilizadas para produzir uma reação química). Sabemos hoje 
que as bactérias gram-positivas possuem uma parede celular mais espessa e diferente da 
parede das bactérias gram-negativas. 
• Cristal violeta, o corante primário, cora as células gram-positivas e gram-negativas de 
púrpura, pois penetra no citoplasma de ambos os tipos celulares. 
• Quando o lugol (solução iodo - o mordente), é aplicado, forma cristais com o corante 
que são muito grandes para escapar pela parede celular. 
• Durante a utilização do álcool é que a diferença na composição da parede celular das 
bactérias será de extrema importância para definir os dois grupos de bactérias. O álcool 
terá duas funções: dissolver lipídios e desidratar as células. 
• A aplicação de álcool desidrata a peptideoglicana das células gram-positivas para torná-
la mais impermeável ao cristal violeta-iodo, pois o corante associado à parede das 
bactérias gram-positivas que possui alto peso molecular, não consegue se difundir de 
volta para o meio externo durante a lavagem com o álcool. Dessa forma, a célula gram-
positiva permanece corada na cor roxa. 
• O efeito nas células gram-negativas é bem diferente. Sabemos que a camada de parede 
é extremamente mais delgada e que sobre a parede encontramos outra membrana, a 
externa, de natureza lipídica. Ao utilizar o álcool, a membrana externa das bactérias 
gram-negativas é solubilizada e, como a camada de parede celular é mais fina, o álcool 
deixa também pequenos buracos na fina camada de peptideoglicana, pelos quais o 
cristal violeta-iodo se difunde, deixando a célula descorada. 
• Como as bactérias gram-negativas ficam incolores após a lavagem com álcool, a adição 
de safranina (contracorante) torna as células cor-de-rosa. A safranina fornece a cor 
contrastante à coloração primária (cristal violeta). 
• Embora as células gram-positivas e gram-negativas absorvam a safranina, a coloração 
rosa da safranina é mascarada pelo corante roxo-escuro previamente absorvido pelas 
células gram-positivas. 
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Coloração de endósporos/esporos (técnica de Schaeffer-Fulton) 
Um endosporo é uma estrutura especial resistente, dormente, formada dentro de 
uma célula que protege uma bactéria das condições ambientais adversas. Embora os 
endosporos sejam relativamente incomuns nas células bacterianas, podem ser 
formados por alguns gêneros de bactérias. 
Bactérias anaeróbicas dos gêneros Clostridium e aeróbicas do gênero Bacillus são 
exemplos de microrganismos que desenvolvem tais formas de resistência, que se 
formam no interior da célula vegetativa, sendo liberados com seu rompimento. Uma 
das características mais importantes do endósporo é a resistência a altas temperaturas 
(resiste à água fervente por duas horas), congelamento, radiação, dessecação e agentes 
químicos. Tal resistência se deve à presença de peptideoglicanos no seu envelope 
externo, que é multilaminar, e de dipicolinato de cálcio no seu interior. 
Os endosporos não se coram facilmente e, assim, não podem ser corados pelos 
métodos comuns, como a coloração simples e a coloração de Gram, pois os corantes 
não penetram a parede do endosporo. Dessa forma, os métodos de coloração de 
endósporos normalmente utilizam o calor como forma de facilitar a penetração do 
corante. Uma vez corado, o endósporo retém o corante, enquanto a lavagem remove a 
coloração das células vegetativas. A identificação de endósporos é muito importante 
para a indústria alimentícia, na qual normalmente o calor é utilizado como forma de 
esterilização. 
A coloração mais comumente usada para endosporos é a técnica de Schaeffer-
Fulton. O verde malaquita, a coloração primária, é aplicado a um esfregaço fixado com 
calor. O calor auxilia a coloração a penetrar na parede do endosporo. Então, a 
preparação é lavada com água, para remover o verde malaquita de todas as partes da 
célula, exceto dos endosporos. A seguir, a Safranina (vermelha), um contracorante, é 
aplicada ao esfregaço para corar as porções da célula que não os endosporos. Assim um 
esfregaço corretamente preparado, os endosporos aparecem em verde e as células 
vegetativas vermelhas ou rosadas. 
 
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Figura 5. Bacillus megaterium. Coloração de Schaeffer-Fulton para evidenciação de 
endósporos 
 
Coloração negativa para cápsulas 
 Utilizada para evidenciar a presença de cápsula que se apresentam como halos 
incolores em torno das células bacterianas, destacando-se sobre um fundo escuro (Figura 
2B e Figura 6). Demonstração da presença de uma cápsula é um modo de determinar a 
virulência do organismo, o grau em que um patógeno pode causar doença. 
 
Figura 6. Coloração negativa para cápsulas. coloração da cápsula fornece um fundo 
contrastante; assim, as cápsulas dessa bactéria, Klebsiella pneumoniae, apresentam-se 
como áreas claras circundando as células coradas. 
 
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Coloração dos flagelos 
Demonstração da presença de flagelos A deposição continuada do corante sobre a 
estrutura flagelar com o auxílio do mordente aumenta o seu diâmetro, tornando-o visível ao 
microscópio óptico (Figura 7). 
 
Figura 7. Coloração para flagelos. 
 
Referências 
MADIGAN, M.T.; MARTINKO, J.M.; PARKER, M.M. Microbiologia de Brock. 10. ed. São Paulo: 
Prentice-Hall, 2004. 1160p. 
TORTORA,G.J.; FUNKE, B.J.; CASE, C.L. Microbiologia, 8. ed. Porto Alegre: Artmed, 2005. 
894p. 
VERMELHO, A.B.; PEREIRA, A.F.; COELHO, R. R. R; SOUTO-PADRON,T. Práticas de 
Microbiologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006. 
 
Vídeos indicados para estudo: 
• https://www.youtube.com/watch?v=gMQUsh2c0zQ 
• https://www.youtube.com/watch?v=dQhDlrtf-aw 
 
 
https://www.youtube.com/watch?v=gMQUsh2c0zQ
https://www.youtube.com/watch?v=dQhDlrtf-aw