RESUMO MICRO ESTÁGIO

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Sumário
Introdução a Microbiologia	4
FUNGOS	5
Leveduras:	5
Filamentosos:	5
VÍRUS	7
BACTÉRIAS	9
Estrutura Bacteriana	10
COLORAÇÃO DE GRAM:	11
Princípio:	11
Técnica de Coloração de Gram:	12
COCOS GRAM POSITIVOS	15
Gênero STAPHYLOCOCCUS	16
Fatores de Virulência:	16
STAPHYLOCOCCUS AUREUS – Doenças	17
Diagnóstico:	19
Tratamento e Controle	20
Outros Staphylococcus e sua importância clínica:	20
Diagnóstico:	20
TESTE DE CATALASE:	21
Procedimento:	22
TESTE DE COAGULASE	23
Finalidade:	23
Técnica:	23
SUSCETIBILIDADE A NOVOBIOCINA (> 15MM).	25
Técnica:	25
TESTE DE FERMENTAÇÃO DE MANITOL	25
ÁGAR DNASE	26
STREPTOCCUS E ENTEROCOCCUS	28
Streptococcus pyogenes	31
Streptococcus pneumoniae ou pneumococo	35
Streptococcus faecalis ou enterococcus	35
Streptococcus - grupo viridanas	36
Streptococcus agalactie	37
Outras espécies de estreptococos e respectivas doenças causadas	37
ENTEROCOCCUS	38
BILE ESCULINA E MTS:	39
PYR:	40
CAMP – Test	40
SUSCETIBILIDADE À BACITRACINA (12 A 17MM)	41
SUSCETIBILIDADE À OPTOQUINA (> 14MM)	42
IDENTIFICAÇÃO DE BACILOS GRAM NEGATIVOS	43
FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE	44
Características:	44
Fatores de Virulência:	44
ESCHERICHIA COLI	46
Principais características das Enterobactérias	47
TESTE DE OXIDASE	47
IDENTIFICAÇÃO PRESUNTIVA:	48
Meio de Rugai	48
Kit para identificação de Enterobactérias:	50
BACILOS GRAM NEGATIVOS NÃO FERMENTADORES	51
Características Gerais:	51
Importância clínica:	52
TRIAGEM INICIAL P/ ID	52
Meio TSI/IAL	52
Caldo TSB (motilidade em lâmina).	52
TESTES ADICIONAIS:	54
MINI KIT PARA NÃO-FERMENTADORES	54
Pseudomonas aeruginosa	55
Acinetobacter baumannii	56
PESQUISA DE B.A.A.R	56
COLETA DE ESCARRO	57
COLETA DE LINFA E RASPADO INTRADÉRMICO	58
CULTURA	60
COPROCULTURA	61
Espécime clínico:	62
MEIOS CONSERVANTES E DE TRANSPORTE MAIS COMUNS	62
Glicerina tamponada:	62
Cary-Blair:	62
PRINCIPAIS MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS:	63
CALDOS DE ENRIQUECIMENTO	63
CULTURA DE SECREÇÕES	66
Orofaríngea:	66
Uretral:	66
Otológica:	66
SECREÇÕES MAIS COMUMENTE PROCESSADAS	66
COLETA DA SECREÇÃO OROFARÍNGEA:	66
SECREÇÃO VAGINAL:	67
MEIOS DE CULTURA:	68
Introdução a Microbiologia
A Microbiologia é uma ciência cujo campo de atuação engloba o estudo de diversos seres vivos eucariotas inferiores e procariotas. A palavra
Microbiologia significa: Mikros (= pequeno) + Bio (= vida) + logos (=
ciência). A Microbiologia era definida, até recentemente, como a área da
ciência que se dedica ao estudo dos microrganismos, um vasto e diverso
grupo de organismos unicelulares de dimensões reduzidas, que podem ser
encontrados como células isoladas ou agrupados em diferentes arranjos
(cadeias ou massas), sendo que as células, mesmo estando associadas, exibiriam um caráter fisiológico independente.
FUNGOS
- São organismos eucarióticos, ou seja, suas células possuem o material genético (DNA e RNA) envolto por um núcleo.
- Apresentam dimorfismo térmico:
· Fungos que vivem em temperatura de aproximadamente 25°C, são denominados filamentosos (multicelular).
· Fungos que vivem em temperatura de aproximadamente 36°C, são denominados levedura (unicelular).
- São encontrados no solo, na água, nos vegetais, em animais, no homem e em detritos, em geral.
- a sua dispersão é feita por animais, homem, insetos e água. O vento também age como importante veículo
de dispersão de seus propágulos e fragmentos de hifas.
- a maioria dos fungos são aeróbios obrigatórios, alguns aeróbios facultativos, mas nenhum é anaeróbio
obrigatório.
- como todos os fungos requerem uma fonte orgânica de carbono pré-formada (associação com material em
decomposição), o habitat natural da maioria dos fungos é o meio ambiente. A exceção é a Candida albicans,
que faz parte da microbiota normal humana (boca, tubo digestivo, orofaringe, vagina, pele, etc).
São utilizados em fermentações industriais:
- Fabricação de cerveja, vinho (leveduras como a Saccharomyces cerevisiae);
- Produção de antibióticos (ex. penicilina pelo Penicillium notatun);
- Fabricação de pães e amadurecimentos de queijos (Roquefort, Camembert, Gorgonzola).
Leveduras:
- São microrganismos unicelulares, e a própria célula cumpre as funções vegetativas e reprodutivas. As leveduras crescem como células únicas e se reproduzem de modo assexuado pelo processo de brotamento.
Exemplo: Saccharomyces cerevisiae e Candida albicans.
Filamentosos:
- São constituídos por elementos multinucleares em forma de tubo, chamado hifas.
- Hifas são filamentos tubulares ramificados e filiformes, formados pela reunião de muitas células e que se alongam em suas extremidades por um processo de extensão apical.
As hifas podem ser:
- contínuas (não-septadas ou cenocíticas), que são multinucleadas; sendo essencialmente uma célula longa contendo muitos núcleos;
- septadas (tabicadas), divididas em compartimentos formados por invaginação da parede celular entre as células que formam um longo filamento. Estas hifas tem um septo que divide os filamentos em células distintas contendo núcleos.
- As conjunto de hifas dá-se o nome de micélio, que formam um emaranhado como em uma esteira.
- O micélio que se desenvolve no interior do substrato, funcionando como elemento de sustentação e de absorção de nutrientes é chamado micélio vegetativo e as hifas são chamadas vegetativas.
- O micélio que se projeta na superfície e cresce acima do meio é o micélio aéreo e as hifas chamadas aéreas. Estas hifas produzem estruturas especializadas, os propágulos, envolvidos na reprodução.
- Estes fungos podem ter reprodução assexuada e sexuada.
- A reprodução sexual envolve a fusão nuclear de dois gametas e sua divisão em esporos sexuais. Algumas espécies de fungos produzem esporos sexuados e assexuados. Os esporos assexuados são denominados conídios.
- A maioria dos fungos de interesse médico se propagam assexuadamente formando conídios. Os esporos são estruturas muito resistentes que podem ser levadas pelo vento a grandes distâncias.
- São resistentes ao frio, ao aquecimento, a ácidos, a bases e outros produtos químicos.
Ex: Penicillium notatum; Aspergillus flavus; Trichophyton sp.
Diagnóstico:
- Micológico direto (restrito a dermatofitoses), pele e anexos – KOH (clarificar).
- Raspagem;
- Microscópico – cultura de células e tecidos – lactofenol, azul de algodão.
VÍRUS
A palavra vírus vem do latim e significa “veneno” ou “fluido venenoso”. As partículas virais maduras (corpo) são chamadas “vírion”. Os vírus são extremamente pequenos (menores que as células) e visíveis apenas ao microscópio eletrônico. Os vírus podem parasitar células de bactérias, vegetais e animais.
Vírus nus ou desnudos:
- quando a partícula viral consiste apenas de um nucleocapsídeo.
- exemplos: hepatite A, rotavírus, poliomielite.
Vírus envelopados:
- quando a partícula viral consiste de um nucleocapsídeo circundado por um envelope externo (membrana lipoprotéica).
- exemplos: hepatite B e C, herpes, aids.
- Sua visualização é através da microscopia óptica;
- Apresenta efeito citopático;
- Seu cultivo é através de cultura de células e tecidos;
- Diagnóstico é feito por testes sorológicos;
BACTÉRIAS
As bactérias de interesse médico podem apresentar formas esféricas, cilíndricas e espiraladas, chamadas respectivamente de cocos, bacilos e espirilos.
Os cocos são redondos, mas podem ser ovais, alongados ou achatados em uma das extremidades. Quando as bactérias em forma de cocos se dividem, as células podem permanecer unidas umas às outras, surgindo em decorrência cocos aos pares (diplococos), cadeias (estreptococos) e cachos (estafilococos). Menos frequentes são aqueles cocos que se dividem em dois ou três planos e permanecem unidos em grupos cúbicos de oito indivíduos (sarcina).
Os bacilos, ao contrário dos cocos, só se dividem no plano sobre seu eixo menor de tal forma que são poucos os arranjos ou agrupamentos: os diplobacilos aparecem aos pares e estreptobacilos ocorrem em cadeias. Alguns bacilos assemelham-se a lanças, outros têm extremidades arredondadas ou, então, retas.
Estrutura Bacteriana:
Bactérias são microrganismos vivos unicelulares e procariontes queconstituem o Reino Monera. Algumas causam doenças, mas muitas são importantes para o equilíbrio ecológico.
COLORAÇÃO DE GRAM:
A coloração de Gram foi desenvolvida em 1884, por Hans Christian Gram. É um dos procedimentos de coloração mais utilizados dividindo as bactérias em dois grandes grupos: as bactérias Gram positivas, ou Gram (+), e as bactérias Gram negativas, ou Gram (-).
Gram (+):
- Apresentam a camada de peptidoglicano espessa;
- Grande parte da parede é formada de peptidoglicano, representando 40-90% da parede celular;
- Quando se examina ao microscópico um esfregaço bacteriano corado pelo método de Gram, as bactéria gram (+) se apresentam de cor roxa.
Gram (-):
- Apresentam camada de peptidoglicano mais estreita;
- A quantidade de peptidoglicano na parede é pequena, apenas 10%;
- Quando se examina ao microscópico um esfregaço bacteriano corado pelo método de Gram, as bactéria gram (-) se apresentam de cor vermelha.
Princípio:
A finalidade da coloração é facilitar a observação microscópica das bactérias e diferenciá-las de acordo com suas características tintoriais. Na prática, os corantes são divididos em dois grupos: os ácidose os básicos. Os corantes básicos são sais com base corada que se unem eficazmente a substratos ácidos, tendo uma grande afinidade para corar material nuclear. As bactérias comportam-se como material nuclear e, desse modo, todos os corantes utilizados em bacteriologia são corantes básicos. Os corantes ácidos tendem a corar mais eficientemente os substratos básicos como o citoplasma. Em todo método de coloração há vários fatores que podem influenciar nos resultados como, por exemplo, o pH das soluções de lavagem, a limpeza das lâminas, a pureza dos reagentes, o modo de preparação do corante e mesmo o tempo dispendido na preparação desse corante.
O mecanismo da coloração de Gram se refere à composição da parede celular, sendo que as Gram- positivas possuem uma espessa camada de peptidoglicano e ácido teicóico, e as Gram-negativas, uma fina camada de peptidoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta por lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e lipopolissacarídeos. Durante o processo de coloração, o tratamento com álcool (ou álcool acetona) extrai os lipídeos, daí resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das bactérias de Gram-negativas. Assim, o complexo cristal violeta-iodo (CV-I) pode ser retirado e as bactérias Gram-negativas são descoradas. A parede celular das bactérias Gram-positivas, em virtude de sua composição diferente, torna-se desidratada durante o tratamento com álcool, a porosidade diminui, a permeabilidadeé reduzida e o complexo CV-I não pode ser extraído.
Outra explicação baseia-se também em diferenças de permeabilidade entre os dois grupos de bactérias. Nas bactérias Gram-posirivas, o complexo CV-I é retido na parede após tratamento pelo álcool- acetona, o que causa, provavelmente, uma diminuição do diâmetro dos poros da camada de peptidoglicano da parede celular. A parede das bactérias G ram-negativas permanece suficientemente grande, mesmo depois do tratamento com o álcool acetona, possibilitando a extração do complexo CV-I.
Segundo Trabulsi, na etapa diferencial com o álcool acetona, as bactérias Gram-negativas devido à pequena espessura da camada basal e às descontinuidades existentes nesta camada, em pontos de aderência entre a membrana externa e a membrana celular, têm o complexo corado extraído pelo álcool, que deixa as células descuradas.
Técnica de Coloração de Gram:
Realizar a coloração de Gram em lâminas preparadas contendo microrganismos e em seguida observa-las ao microscópio.
a) cobrir toda a lâmina com solução de cristal violeta, aguardar um minuto e desprezar o corante na pia;
b) cobrir a lâmina com lugol, aguardar um minuto e 30 segundos, e desprezar o corante;
c) inclinar a lâmina e gotejar álcool acetona até que não haja desprendimento de corante (cerca de 30 segundos). Lavar a lâmina rapidamente em água corrente;
d) cobrir com fucsina de Gram e aguardar 30 segundos. Lavar a lâmina e secar (sem esfregar). Notas
1. O etanol poderá ser usado como agente descorante fraco.
2. O material dos corantes empregados na técnica, principalmente sedimento do cristal violeta, poderá aparecer como artefato.
3. O descoramento para mais ou para menos é resultante da incorreta diferenciação pelo álcool acetona.
4. A idade da cultura bacteriana tem importância fundamental na coloração de Gram. Em culturas envelhecidas, células Gram-positivas frequentemente se tornam Gram-negativas.
Enzimas líticas excretadas normalmente por culturas envelhecidas podem causar danos à membrana da célula, como, por exemplo, alterando a permeabilidade aos solventes (álcool acetona). Consequentemente, o complexo iodo- cristal violeta poderá ser retirado da célula.
	Se houver um questionamento acerca da Gram-positividade ou da Gram-negatividade da cultura, uma coloração de Gram paralela é aconselhável. Para isto, deve-se usar culturas bacterianas conhecidas como Gram-positivas (Staphylococcus aureus) e Gram-negativas (Escherichia coli) com o controles.
Utilizar a co1oração de Gram do material obtido de colônias isoladas para obter através de observação ao microscópio óptico maiores informações sobre a morfologia celular. A maioria das bactérias pode ser dividida em dois grupos distintos de acordo com os resultados apresentados pelo Gram:
- Bactérias Gram-positivas — coram-se em violeta escuro;
- Bactérias Gram-negativas — coram- se em vermelho.
Essa diferença na coloração está relacionada com a espessura e estrutura das paredes celulares das bactérias.
COCOS GRAM POSITIVOS
	Grupos
	Aeróbios ou Anaeróbios Facultativos
	Anaeróbios obrigatórios
	Catalase + : Staphylococcus
	Peptostreptococcus
	Catalase - : Strepyococcus e Enterococcus
	
Gênero STAPHYLOCOCCUS
- Cocos Gram-positivos dispostos em cachos.
- Microrganismos imóveis.
- Anaeróbios facultativos.
- Catalase-positivos.
- Coagulase-positivos (S. aureus). 
- São encontrados comumente no ambiente, sobre a superfície de objetos inanimados (fomites), e algumas espécies são membros da microbiota normal de indivíduos saudáveis e as vezes são tornam-se patogênicos ao homem.
Contato: após ao nascimento colonizam a pele e a mucosa, através do contato com o ambiente ou com indivíduos portadores
Entrada: Penetram no organismo quando há descontinuidade do tecido.
Três espécies possuem importância médica:
- Staphylococcus aureus;
- Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus saprophyticus.
Fatores de Virulência:
- Cápsula polissacarídica; peptidoglicano; ácido teicóico; proteína A.
- Toxinas alfa, beta, ômega e gama; toxinas esfoliativas (SPE); toxinas-1 (SCTE); enterotoxinas (IA).
- Enzimas: coagulase, catalase, penicilinase, hialuronidase, estafiloquinase, lipase, nuclease. 
STAPHYLOCOCCUS AUREUS – Doenças
Multiplicação: A colonização do tecido ocorre por divisão binária.
Fatores de Virulência: Garantem estabilização da infecção e a sobrevivência dos Staphylococcus no tecido e a sua disseminação para outros locais no organismo.
Fatores de virulência
Mediadas por toxinas:
- Síndrome do Choque Tóxico;
- Síndrome da Pele Escaldada;
- Intoxicação Alimentar.
Infecções Supurativas:
- Impetigo;
- Foliculite;
- Furúnculo;
- Carbúnculo.
Outras infecções:
- Pneumonia;
- Osteomielite;
- Endocardite;
- Atrite séptica.
Diagnóstico:
Clínico e Laboratorial
- Bacteriológico: coloração, isolamento e identificação bioquímica.
Tratamento e Controle
Outros Staphylococcus e sua importância clínica:
Staphylococcus epidermidis
- Estafilococos coagulase-negativos que produz biofilme.
- Doenças: infecções de articulações artificiais (próteses);
septicemia; infecções de cateteres.
Staphylococcus saprophyticus
- Estafilococos coagulase-negativos.
- Doença: infecção do trato urinário (mulheres).
Diagnóstico:
Clínico e Laboratorial
- Bacteriológico: coloração, isolamento e identificação bioquímica.
TESTE DE CATALASE:
- O teste da catalase identifica bactériasque produzem esta enzima.
- Todos os estafilococos produzem catalase.
- Diferencia Staphylococcus spp (catalase +) de Streptococcus spp (catalase -).
- Quando H202 entrar em contato com colônias de Staphylococcus spp pré cultivadas, ocorrerá a formação de bolhas (02) indicando que as bactérias são produtoras de catalase.
Procedimento:
- Em uma lâmina (ou cartão teste), pingar uma gota de reativo de catalase (H2O2 3%). Com auxílio de uma alça bacteriológica, colocar algumas colônias e esfregá-las no reativo de catalase.
TESTE DE COAGULASE
- Teste que tem como objetivo verificar se a bactéria produz a enzima coagulase.
- Serve para diferenciar a espécie S. aureus (coagulase +) de S. epidermidis e S. saprophyticus (coagulase -).
- A ação da enzima culmina na conversão do fibrinogênio em fibrina (trombo).
- Utiliza-se o plasma de coelho para o teste.
- O teste pode ser realizado em lâminas – ligada (rápido) ou em tubos - livre (lento).
- Observa-se a cada 3 minutos se há a formação de coágulo (+) ou não (-).
Finalidade: Verificar se o microrganismo isolado é capaz de produzir a enzima coagulase, a qual, a partir do fibrinogênio forma um coágulo de fibrina.
Técnica:
- Reconstituir o plasma liofilizado de coelho, adicionando ao frasco 3 ml de solução fisiológica. Homogeneizar.
- Transferir, para um tubo estéril, uma alíquota de 500Ul.
- Com o auxílio de uma pinça bacteriológica, coletar algumas colônias bacterianas e misturá-las com o plasma reconstituído. Homogeneizar.
- Incubar por 3 a 4 horas (aprox. 36°C) ou por 24 horas (aprox. 36°C ou T.A).
SUSCETIBILIDADE A NOVOBIOCINA (> 15MM).
Técnica:
- Preparar um inóculo (com salina e colônia da bactéria) e ajustar com a escala 0,5 de MacFarland.
- Passar com swab em ágar Muller-Hinton, e aguardar o inóculo secar – 5 à 15 minutos.
- Aplicar o disco de Novobiocina e incubar em estufa (aprox. 36°C por 24horas).
- Realizar leitura do halo de inibição.
· Sensível - Halo > 15mm – Staphylococcus spp.
· Resistente – Halo < 15mm – Staphylococcus saprophyticus.
TESTE DE FERMENTAÇÃO DE MANITOL
- Ágar manitol ou ágar salgado (7,5% de NaCl) ou meio chapmen;
- Indicador de pH vermelho de fenol:
 pH > 7.0: Rosa
 Ph < 7.0: Amarelo.
- Finalidade: Verificar se o microrganismo que está sendo identificado fermenta o açúcar manitol.
Técnica:
- Semear, com uma alça estéril, uma amostra de microrganismo na superfície do ágar e incubar na estufa por aprox. 24 horas ou aprox. 36°C.
Colônias e ágar amarelo fermentação deste açúcar;
Colônias brancas ou transparentes e ágar rosado não houve fermentação deste açúcar.
Ágar DNAse
- Verificar se o microrganismo é capaz de hidrolisar o DNA (presente no meio) por ação da enzima desoxirribonuclease (DNAse);
- Dentre os estafilococos, a espécie S. aureus representa um dos principais microrganismo isolado com essas características.
* Leitura:
- Após a incubação, com o auxilio de uma pipeta de Pasteur, cobrir as colônias com a solução de HCl (ácido clorídrico) a 1N;
- Aguardar até 1 minuto:
DNAse +: surge, em torno das colônias, uma zona clara.
DNAse -: após adição do HCl, toda a superfície do meio ficará com um aspecto leitoso-opaco
STREPTOCCUS E ENTEROCOCCUS
- Cocos Gram-positivos dispostos aos pares ou em cadeia.
- Anaeróbios facultativos (maioria).
- Catalase-negativos (diferente do gênero Staphylococcus).
- Fermentam carboidratos (produção de ácido lático).
Habitam diferentes tipos de ambiente, alguns fazem parte da microbióta normal, principalmente das vias aéreas superiores e do TGI. Alguns são patógenos primários outros são classificados como oportunistas.
· Beta – hemolíticos, fazem hemólise total (S. pyogenes; S. agalactiae)
· Alfa – hemolíticos, fazem hemólise parcial (S. pneumoniae)
· Gama – hemolíticos, não fazem hemólise (S. faecalis; S. viridans)
Padrão hemólise:
- Alfa hemólise: parcial – colônias com leve pigmento esverdeado.
- Beta hemólise: total – colônias transparentes e com halo amarelo.
- Gama hemólise: sem lise – colônias transparentes.
Streptococcus pyogenes
- Beta hemolíticos
Contato: vive na pele e mucosa de indivíduos saudáveis e pode ser transmitido por contato direto, aerossóis ou fomites contaminados.
Entrada: Penetram no organismo quando há descontinuidade do tecido.
- Espécie mais importante do grupo A (Lancefield).
- Causa uma variedade de doenças supurativas e não-supurativas.
- Maior responsável pela faringite bacteriana.
- Conhecida como “bactéria carnívora”.
Streptococcus pneumoniae ou pneumococo
Alfa - hemolíticos 
Habita normalmente as vias aéreas superiores de 5 a 70% dos indivíduos
Contato: Acredita-se que a infecção seja decorrente da instalação de novos sorotipos adquiridos por contato direto com indivíduos infectados através de aerossóis ou perdigotos ou quando há diminuição da imunidade com perda da resistência natural.
Manifestação Clínica:
Pneumonia e empiema
A infecção provoca o extravasamento de líquido e edema no interior dos alvéolos, levando a resposta inflamatória com grande produção de pus.
Sintomas:
• Dificuldade de respirar
• Dor pleural
• Febre, calafrios
• Expectoração com escarro sanguinolento
Streptococcus faecalis ou enterococcus
Gama – hemolíticos
Habitam normalmente a pele e mucosa dos TGI e TG
- Patógeno oportunista - Infecção hospitalar
- Adquiriu resistência a múltiplos antibióticos, inclusive a vancomicina
Patogenia e Manifestação Clínica:
A infecção surge quando a bactéria é transmitida do seu habitat normal para outros órgão e tecidos. Frequentemente causam infecções no TU decorrentes de feridas causadas durante cirurgias e/ou uso de cateter.
Streptococcus - grupo viridanas
Gama - hemolíticos
Diagnóstico:
Clínico e Laboratorial
- Bacteriológico: coloração, isolamento e identificação bioquímica.
- Sorológico: pesquisa de anticorpos contra a estreptolisa O
Amostra biológica:
Pus
- Impetigo
- Faringite
- Fascite necrozante
Saliva ou secreção oronasal Faringite
LCR meningite
Sangue Bacteremia
Escarro Pneumonia
Urina Enterococcus.
Streptococcus agalactie
- Microbiota: região anorretal e trato genitourinário;
- Beta-hemolítico;
- Resistente a bacitracina;
- Teste de Camp positivo;
Importância clínica: causa infecções em récem nascidos, como: sepse, meningite, pneumonia, etc.
- Importante relatar quando encontrada isolada em urina de gestante.
Outras espécies de estreptococos e respectivas doenças causadas
- S. pneumoniae: otite média; sinusite; meningite; pneumonia; endocardite e septicemia.
- S. agalactiae: endocardite; pneumonia; infecções em neonatos (meningite; pneumonia; febre puerperal; septicemia).
- Estreptococos do Grupo C (S. equi; S. equisimilis; S. dysgalactiae): endocardite; febre puerperal e infecções de feridas.
- Estreptococos do Grupo D (S. bovis e S. equinus): infecções urinárias; peritonites; endocardites.
- Enterococos (E. faecalis e E. faecium): peritonites; infecções urinárias; infecções de feridas; endocardite.).
ENTEROCOCCUS
- Coco gram positivo, catalase negativa e que agrupam em pequenas ou longas cadeias.
- São gama hemolíticos;
- PYR +
- Bile esculina e MTS positivo;
- Microbiota intestinal;
- Os enterococos podem causar infecções, principalmente, em pacientes internados por longos períodos e sob antibioticoterapia (âmbio hospitalar).
Doenças:
- ITU;
- Infecções de sítios cirúrgicos;
- Endocardite;
- Peritonite;
- Bacteremia/sepse;
- Principais espécies: S.faecalis e S.faecim.
BILE ESCULINA E MTS:
- Com uma alça bacteriológica, coletar colônias do meio de cultura e fazer estrias no tubo com bile esculina e homogeneizar no tubo de MTS.
Resultados: Bile esculina
Positivo: Coloração preta.
Negativo: Coloração marrom.
MTS
Positivo: Amarelado e turvo – Streptococcus sp
Negativo: Roxo e límpido – Streptococcus grupo D (S.bovis); 
PYR:
- Com uma alça azul, umedecer a área com uma gotinha de água;
- Com o auxílio de uma alça bacteriológica, coletar algumas colônias e esfregar na área umedecida e marcar 2 minutos para secar;
- Depois, pingar uma gota da solução reveladora e aguardarum minuto;
PYR +: Vermelho/rosa
PYR -: Amarelo (sem alteração de cor).
CAMP – Test
- Inocular uma estria única de uma amostra de Staphylococcus aureus produtor de beta lisina (ATCC 25923) no centro de uma placa de ágar sangue preparada obrigatoriamente com sangue de carneiro. (Essa linhagem de S. aureus deve ser mantida continuadamente em estoque).
– Inocular as amostras a serem testadas em estrias formando um ângulo reto com a linha de inoculação da amostra teste de estafilococo. As estrias não devem se tocar, ficando a 1 mm de distância, e desse modo várias amostras podem ser testadas em uma mesma placa de ágar sangue. A maneira de inocular é fundamental para a observação do efeito esperado.
– Incubar a placa a 35-37°C durante um período de 18-24 horas.
– A positividade da prova, Streptococcus agalactiae (grupo B), é evidenciada pelo alargamento da zona de lise, que adquire a forma de ponta de flecha característica, na área de intersecção entre as duas estrias.
– Se o teste de CAMP não resultar em uma flecha, mas numa figura semelhante a uma cabeça de fósforo, refazer o teste de catalase e em caso positivo verificar as provas para identificação de Listeria sp.
SUSCETIBILIDADE À BACITRACINA (12 A 17MM)
- É importante notar que as identificações devem ser feitas em ágar sangue sem tensão de CO2 ou os resultados podem ser conflitantes.
- Semear meia placa de ágar sangue com o estreptococo a ser identificado, como para um antibiograma.
- Colocar o disco de bacitracina 0,004 UI como indicado.
- Incubar por uma noite a 35oC sem CO2
- Observar qualquer zona de inibição como resultado de sensibilidade. O Streptococcus pyogenes (grupo A) é assim rapidamente identificado.
SUSCETIBILIDADE À OPTOQUINA (> 14MM)
- Semear um quarto de uma placa de ágar sangue com a cepa alfa hemolítica a ser testada.
- Aplicar um disco de optoquina.
- Incubar a 35oC em tensão aumentada de CO2 – método da vela.
- Uma zona de inibição de 14 mm ou mais à volta de um disco de 6 mm significa sensibilidade e identifica o Streptococcus pneumoniae.
TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS – TSA
- Tem como finalidade auxiliar no tratamento de um determinado quadro infeccioso, bem como para evidenciar alguns mecanismos de resistência.
Métodos:
- Micro ou macrodiluição;
- Automação;
- Teste epsilométrico;
- Método de Kirby-Bauer.
Fatores determinantes para realização do TSA:
- Material clínico – cuidado no isolamento de microbiota normal de determinado sítio anatômico, pois não é indicada a realização do TSA neste tipo de amostra;
- Realização da técnica – verificar se todos os passos estão sendo seguidos rigorosamente conforme prescrito;
- Escolha dos antimicrobianos – a escolha dos antimicrobianos deve ser adequado a realidade da instituição ou hospital;
- Resistência intrínseca – cuidado ao reportar resultados errôneos;
- Pesquisa e confirmação de mecanismos de resistência.
- Atualização das recomendações dos grupos de antimicrobianos para cada grupo de micro-organismo e de seus halos de interpretação conforme indicado nas atualizações anuais das organizações internacionais (CLSI ou EUCAST). No Brasil a ANVISA padroniza a utilização do CLSI para os laboratórios.
Método Kirby-Bauer
- Trata-se de um método qualitativo;
- Meio de cultura utilizado: ágar Muller Hinton ou ágar MH sangue;
- Os discos contêm uma concentração padronizada de um dado antibiótico;
- Classifica os microrganismos como:
Sensível (S) – quando a concentração utilizada do antibiótico é capaz de inibir o crescimento do microrganismo in vitro;
Intermediário (I) – CLSI/sensível com exposição aumentada (EUCAST/BrCast);
Resistente ® - não inibe a bactéria.
Técnica:
Preparar o inóculo:
- Primeiramente ajustar um tubo de salina estéril com a escala 0,5 de MacFarland (1,5x108UFC).
- Com um swab, mergulhar dentro do tubo ajustado, e fazer estrias em 3 direções na placa com ágar MH;
- Aguardar secar de 5 a 15 minutos;
- Aplicar os discos;
- Incubar aprox. 24h a 36°C;
- Leitura e interpretação (CLSI/BrCast).
IDENTIFICAÇÃO DE BACILOS GRAM NEGATIVOS
Bactérias Fermentadoras: Enterobactérias, vibrios, Aeromonas.
Bactérias não fermentadoras: Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., Moraxella spp, etc.
FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE
Características:
- Talvez a mais importante família bacteriana.
- Pertence a esta a bactéria mais conhecida:
Escherichia coli
- Possui membros que são a principal causa de infecções intestinais em muitos países.
- Os organismos desta família são bastonetes Gram-negativos.
- São bactérias ubiquitárias.
- Fazem parte da microbiota intestinal do ser humano.
- Possui membros patogênicos estritos e patogênicos oportunistas.
- Bastonetes Gram-negativos de tamanho moderado (0,3 a 1 x 1 a 6μm).
- Seres móveis (flagelos) e imóveis.
- Bactérias não esporuladas e anaeróbias facultativas.
- Algumas bactérias fermentam lactose enquanto outras não o fazem ou fazem lentamente (diferencial).
Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter e Serratia spp
⇩
- fermentam lactose -
Proteus, Salmonella, Shigella e Yersinia spp
⇩
- Não fermentam lactose ou fermentam lentamente –
Fatores de Virulência:
- Lipopolissacarídeo (LPS): Principal antígeno da membrana externa.
- Antígeno K ( cápsula bacteriana). Impedem a fagocitose.
- Lipídio A e peptideoglicano: estimulam a produção de citocinas induzindo a febre.
- Flagelos (Motilidade).
- Fímbria comum (aderência a receptores específicos).
- Pili sexuais: transferência genética.
- Endotoxinas.
Endotoxinas: Toxinas produzidas por todas as espécies da família Enterobacteriacea;
Cápsula: Protege a bactéria da fagocitose.
Variação da Fase Antigênica: Antígenos K capsulares e H flagelares. Protege as bactérias da morte celular mediada por anticorpos.
Captação dos Fatores de Crescimento: Necessitam captar fatores de crescimento disponíveis no local da infecção.
Resistência a Destruição Sérica: microrganismos capazes de produzirinfecções sistêmicas.
Resistência Antimicrobiana: Rápida capacidade de desenvolver resistência por codificação em plasmídio.
ESCHERICHIA COLI
- Espécie de enterobactérias clinicamente mais importante.
- Responsável por várias doenças como: sepse, ITUs, meningite e gastroenterite.
- Possui muitos fatores de virulência (adesinas e exotoxinas).
- Compõe a microbiota intestinal (trato gastrointestinal).
- Bastonete Gram-negativo mais isolado em pacientes com sepse.
- Responsável por mais de 80% das ITUs.
- Importante causa de gastroenterite em países em desenvolvimento.
- A maioria das infecções por este microrganismo é endógena.
Cepas de E. coli causadoras de gastroenterite
Dividem-se em 5 tipos principais:
· E. Coli Enteropatogênica (EPEC)
· E. Coli Enterotoxigênica (ETEC)
· E. Coli Êntero-Hemorrágica (EHEC)
· E. Coli Enteroinvasiva (EIEC)
· E. Coli Enteroagregativa (EAEC)
Principais características das Enterobactérias
- Oxidase negativa;
- Crescem em ágar MacConkey;
- Reduzem nitrato a nitrito;
- Fermentam glicose.
*A exceção é para Piesiomonas shigelloides (oxidase positiva) *.
TESTE DE OXIDASE
- Escopo: observar se a bactéria testada possui a enzima citocromo oxidase.
Bactérias oxidase-positivas:
· Pseudomonas aeruginosa
· Moraxella catharralis
· Burkholderia cepacia
· Neisseria spp.
IDENTIFICAÇÃO PRESUNTIVA:
Meio de Rugai
- Permite realizar a leitura de 9 provas bioquímicas diferentes, a saber:
· L-TD (L-Triptofano Desaminase)
· Fermentação da sacarose
· Fermentação da glicose
· Gás de glicose
· Urease
· H2S (ácido sulfídrico)
· Descarboxilação da lisina
· Motilidade
· Indol
Kit para identificação de Enterobactérias:
BACILOS GRAM NEGATIVOS NÃO FERMENTADORES
Características Gerais:
- Microrganismos aeróbios.
- Não esporulados.
- Não utilizam carboidratos por via fermentativa como fonte de energia.
- Obtêm energia através da via oxidativa.
- São MOs ubiquitários (água, solo, peixes, leite, desinfetantes etc.
- No âmbito hospitalar, geralmente contaminam: água de torneira, respiradores, cateteres, atissépticos, soros etc.
- A maioria é móvel (flagelos polares).
- Geralmentepossuem baixa atividade metabólica (o que torna difícil a identificação).
- Podem ser oxidase-positivos ou negativos e crescer ou não em ágar MacConkey.
Membros clinicamente mais importantes:
- Pseudomonas aeruginosa.
- Complexo Burkholderia cepacia.
- Acinitobacter baumannii.
- Stenotrophomonas maltophilia
Outros:
- Moraxella spp.
- Shewanella spp.
- Chryseobacteriem spp.
- Achromobacter spp.
- Bordetella spp.
Importância clínica:
Âmbito hospitalar
- Unidades de terapia intensiva.
- Pacientes queimados.
- Sob terapia intensiva.
- Infecção do T.R. (pacientes com Fibrose Cística – FC).
TRIAGEM INICIAL P/ ID
Meio TSI/IAL
- Tiras de oxidase.
Caldo TSB (motilidade em lâmina).
- Ágar MacConkey
- Coloração de Gram.
TESTES ADICIONAIS:
MINI KIT PARA NÃO-FERMENTADORES
Provas:
- OF Glicose
- OF Maltose
- OF Xilose
- OF Lactose
- Motilidade
- Ágar Cetrimide
- Nitrito
- Gelatinase
- Crescimento em BHI (42°C).
Pseudomonas aeruginosa
- Bacilos Gram-negativos pequenos.
- Aeróbio obrigatório.
- Oxidase-positivo.
- Possui cápsula mucoide de polissacarídeo.
- Produz pigmento esverdeado (piocianina).
- Presente em: flores, pias, banheiros, equipamentos respiratórios etc.
- Pode colonizar os T.R. e G.I. de pacientes hospitalizados.
- Doenças: infecções pulmonares, infecções de pele (em queimados, p. ex.), I.T.U., otite externa, infecções oculares etc.
Acinetobacter baumannii
- São bactérias gram-negativas aeróbias e imóveis.
- Distribuição ampla no solo e na água; em certas ocasiões, na pele, mucosa e secreções.
- Em geral, apresentam-se na forma de cocobacilos ou cocos (semelhante a Neisseria) e bastonetes.
- São oxidase-negativo.
- São frequentemente comensais, porém podem provocar infecção hospitalar.
- Infecção associada a dispositivos (cateteres intravenosos, tubo orotraqueal...).
PESQUISA DE B.A.A.R
- Exame que auxilia no diagnóstico e no controle do tratamento de tuberculose e hanseníase.
- Álcool-Ácido Resistência: propriedade que algumas bactérias possuem (ex.: Mycobacterium spp., Nocardia spp., Rhodcoccus spp.).
- Espécies clinicamente mais importantes: M. tuberculosis (bacilo de Koch-BK) e M. leprae.
- A coloração utilizada na pesquisa de B.A.A.R. é a de Ziehl-Neelsen.
- Coloração a quente e a frio (método de Kynioun).
COLETA DE ESCARRO
COLETA DE LINFA E RASPADO INTRADÉRMICO
- Obter isquemia com o auxílio de uma pinça Kelly.
- Incisão com lâmina de bisturi.
- Realizar antissepsia com álcool a 70%.
- Com o lado não cortante da lâmina, obter o raspado das bordas e do fundo da lesão.
- Distribuir o material na lâmina de forma circular.
- Fixar o esfregaço e corar.
CULTURA
- Ágar Löwenstein-Jensen e Middlebrook.
- Diagnóstico definitivo.
Outros exames:
- Radiografia do tórax
- Teste da tuberculina (Reação de Mantoux).
COPROCULTURA
Cultura de fezes, que pode ser solicitada quando há suspeita de gastrenterite de origem bacteriana.
Dentre os principais enteropatógenos, destacam-se:
· Salmonella spp.,
· Shigella spp.,
· Sorotipos de Escherichia coli (EPEC, EIEC, EAEC, ETEC e EHEC),
· Yersinia spp.,
· Campylobacter spp e
· Vibrio spp.
Sintomas relacionados a patogenicidade:
Espécime clínico:
- Geralmente são necessários aproximadamente 2g de fezes para a cultura.
- A coleta deverá ser feita no início dos episódios diarreicos e antes da antibioticoterapia.
- A amostra pode ser coletada em frasco de boca larga não necessariamente estéril.
- Se a amostra for in natura, é necessário processa-la em até 1 hora após a coleta. Caso contrário poderão ser utilizados alguns conservantes (p. ex.: glicerina tamponada ou meio Cary-Blair).
- Fezes sem conservantes poderão ser mantidas refrigeradas (2 a 8°C) por 24 a 48 horas.
MEIOS CONSERVANTES E DE TRANSPORTE MAIS COMUNS
Glicerina tamponada:
- Recomendada para Salmonella spp. e Shigella spp.
Cary-Blair:
- Meio de transporte mais utilizado para maioria dos enteropatógenos.
PRINCIPAIS MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS:
- Na rotina da coprocultura poderão ser utilizados diversos meios (seletivos, diferenciais, cromogênicos e caldos de enriquecimento.
Principais ágares:
· MacConkey
· Eosina Azul de Metileno-BEM
· Salmonella-Shigella-SS
· Hektoen-Enteric-HE
· Xilose Lactose desoxicolato-XLD
CALDOS DE ENRIQUECIMENTO
- São utilizados para inibir o crescimento da microbiota intestinal habitual e favorecer o desenvolvimento de enteropatógenos.
- Normalmente são utilizados no processamento inicial como pré-enriquecimento da amostra.
Mais comuns:
· Caldo GN: melhor meio de enriquecimento para o isolamento de Salmonella spp. e Shigella spp.
· Selenito: Salmonella spp.e Shigella spp.
· Tetrationato: recomendado para Salmonella spp.
Salmonela em água SS
Ágar Hektoen-Enteric
Campylobacter jejuni
Vibrio cholerae
CULTURA DE SECREÇÕES
- Várias amostras podem ser processadas microrganismo setor de Microbiologia com o objetivo de se isolar um agente patogênico.
- Existe um grupo de amostras chamado genericamente de “secreções”, as quais podem ser obtidas de diferentes sítios anatômicos.
- Geralmente essas amostras possuem aspecto purulentos e podem ser coletadas com swab estéril.
Orofaríngea:
· Streptococcus pyogenes (amigdalite/faringite)
· Haemophilus influenzae (amigdalite/faringite)
· Corynebacterium diphtheriae (difteria)
Uretral:
· Neisseria gonorrhoeae (gonorreia)
· Mycoplasma sp. Ureaplasma sp. (uretrite não-gonocócica)
Otológica:
· Streptococcus pneumoniae (otite média)
· Pseudomonas aeruginosa (otite externa)
SECREÇÕES MAIS COMUMENTE PROCESSADAS
- Ocular (conjuntival):
· Staphylococcus aureus; (conjuntivite; hordéolo)
· Haemophilus influenzae (conjuntivite)
- Coleta da amostra: swab estéril.
- Meios de transporte (meio de Stuart/Amies): conservam a amostra viável em temp. ambiente.
- Coloração de Gram - observação de elementos como: células epiteliais, leucócitos, bactérias e leveduras. O resultado pode ser expresso por cruzes (+ a ++++).
COLETA DA SECREÇÃO OROFARÍNGEA:
- Coletar da área hiperemiada adjacente aos pontos purulentos, sem deixar o swab tocar língua, dentes e parede bucal.
SECREÇÃO VAGINAL:
- Além da observação através do Gram de bactérias, leveduars e leucócitos, deve-se atentar para a presença de clue cells, as quais são células do epitélio vaginal revestidas por bactérias, principalmente Gardnerella vaginalis, um cocobacilo Gram-lábil.
- Estas estão presente no quadro de vaginose bacteriana, cujos sintomas são: leucorreia com odor fétido e coceira.
- Esta condição pode ser desencadeada por: estresse, desequilíbrio hormonal, uso de antibióticos, aumento do pH vaginal (> 4,5), diminuição da população de bacilos de Döderlein etc.
MEIOS DE CULTURA:
- Ágar Sangue: meio de cultura rico que permite o crescimento de bactérias Gram + e Gram – e a leitura da hemólise (α, β e γ).
- Ágar MacConkey: seletivo para Gram-negativos. Leitura da fermentação da lactose.
- Ágar Chocolate: possibilita o desenvolvimento de microrganismos mais exigentes como algumas espécies de Neisseria e Haemophilus, por exemplo.
- Ágar Thayer-Martin: seletivo para Neisseria gonorrhoreae. Contém uma mistura de antibióticos que inibem o cresecimento de outros microrganismos.