Identificação Molecular de Microrganismos - Resumo Microbiologia

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Identificação Molecular
de Microrganismos
Como identi�camos um organismo:
. Quando identificamos a espécie do organismo,
consequentemente também dizemos as demais
informações dele
→ exemplo de uma identificação de organismo a
nível de espécie:
. Para identificar um organismo são utilizadas
várias informações, que serão utilizadas como
pistas
→ essas informações podem ser morfológicas,
metabólicas e genéticas
. A identificação de organismos através de
informações irá conseguir distinguir apenas
microrganismos bem conhecidos, sendo então um
método de identificação limitada
. Esse método de identificação também limita os
níveis taxonômicos, sendo eles pouco informativos
Material Genético:
. É rico em informações, sendo capaz de identificar
um organismo através de suas informações
. A maior parte do método de identificação por
material genético utiliza o DNA
. O DNA é como um código de barras, sendo
representado por um código de sequenciamento de
ACGT
DNA: possui dupla fita
- é composto por 4 bases
→ citosina, guanina, adenina e timina 
. sabendo o que se tem em uma fita nós saberemos
o que irá ter na our fita
→ se tiver timina em uma fita, na outra fita irá ter
adenina, por exemplo
Genoma: todo conteúdo de informações de um
organismo
Ribossomo: lê o RNA através da tabela de códons e
produzir as proteínas necessárias para aquele
organismo
- todos os organismos funcionam na base dos
ribossomos
- o DNA possui uma parte que codifica os
ribossomos
L.U.C.A (last universal common ancestor):
. Todos os organismos tiveram um mesmo
ancestral, ele é chamado de L.U.C.A
. Esse ancestral é a informação em comum dentre
todos os organismos, e ele é utilizado para fazer a
identificação e a diferenciação dos organismos
através de métodos genéticos
. Como todos os organismos possuem ribossomos,
e o DNA possui uma parte que codifica esses
ribossomos, a sequência que é estudada como
L.U.C.A é a parte de RNA, sendo a pequena
subunidade do ribossomo
→ é uma subunidade menor, porém, é a parte que
mais concentra informações
DNA como Código de Barras:
. É feita o cadastramento das sequências de
organismos já conhecidos, todas esses
sequenciamentos são introduzidos em um banco
de dados
. Esse banco de dados irá transformar a sequência
em ID de barcode (códigos de identificação)
→ DNA Barcodes
. Quando tivermos contato com um organismo
desconhecido, devemos fazer o sequenciamento
dele e comparar essa sequência com as demais
sequências já introduzidas no banco de dados
. A comparação vai ocorrendo até que se ache um
organismo quase que igual, similar
Uso de DNA Barcodes na Prática:
1º passo: cultivar as células do organismo que irão
ser identificadas
2º passo: matar as células (lysi), para que o DNA
seja extravasado
→ junto com o DNA, também irá extravasar
algumas proteínas, gorduras e carboidratos (tudo o
que tiver dentro das células irão extravasar)
3º passo: remoção de todo conteúdo extravasado
que não seja o DNA
4º passo: apenas o DNA irá permanecer no meio de
cultivo
5º passo: é feita uma lavagem, para que o DNA
fique o mais limpo possível
6º passo: remoção da maior quantidade possível de
líquido do meio de cultivo, para que fique uma
maior quantidade de DNA no meio
→ concentração do DNA
Como é Obtida somente a Sequência Alvo:
. A sequência alvo é o DNA barcode
. Para obter esse barcode é utilizado a reação em
cadeia da polimerase (PCR)
. Esse método consiste em selecionar uma
sequência alvo e fazer várias cópias dela
Primers: iniciadores
- eles se encaixam no DNA e dizem para o DNA
polimerase onde que ela irá se replicar
- são respectivos ao barcode a ser empregado
→ quando eu escolho o primer eu já estou
escolhendo qual será a minha sequência alvo (o
meu barcode)
DNA Polimerase: faz a replicação
Nucleotídeos: matéria prima do DNA
Cofatores: substâncias adicionais que a enzima
necessita para realização do processo
. Todas as substâncias presentes na PCR (DNA,
primers, DNA polimerase, nucleotídeos e cofatores)
serão adicionados em um tubo de amostras e esse
tubo será colocado em um Termociclador
Termociclador:máquina que faz o aumento e a
diminuição da temperatura das amostras
- com o aumento da temperatura as �tas de DNA irão
se abrir (desnaturar e desanelar)
- os primers irão se grudar na sequência de interesse
- o DNA polimerase irá começar a replicar aquela
região selecionada pelos primers
- o termociclador baixa a temperatura, para que a
replicação seja concluída
- após a primeira replicação, novamente ocorre o
aumento da temperatura
- as �tas de DNA irão se desenrolar e os primers irão
se ligar nas sequências alvo, a DNA irá, novamente,
replicar a região sinalizada
- o termociclador irá repetir esse processo mais
vezes, até chegar na 4ª sequência, essa sequência e
a sequência alvo (barcode)
Qual o melhor Barcode para a Identi�cação:
. Dependerá do microrganismo
→ algumas regiões serão capazes de identificar
melhor alguns organismos, outras nem tanto
. Antes de escolher o barcode, temos que já ter em
mente uma ideia de qual microrganismos estamos,
possivelmente, lidando
. O rRNA Gene, presente nas subunidades dos
ribossomos, é a melhor sequência para ser
utilizada como barcode
Sequenciamento do tipo Sanger:
. Similar ao PCR
. Inicia com o DNA amplificado (16s)
. Da mesma forma que no PCR, o processo de
replicação será repetido até a obtenção da 4ª
sequência
. Todas as substâncias presentes na PCR (DNA,
primers, DNA polimerase, nucleotídeos e cofatores)
serão adicionados em tubos de amostras, serão 4
tubos
→ esses tubos serão marcados como sendo um
tubo da timina, um da adenina, um da guanina e
um da citosina
→ em cada um desses tubos será colocado um
Dideoxynucleotídeo (ddNTP)
ddNTP: não é um nucleotídeo normal, ele possue
em sua estrutura o H, ao invés do OH
- assim, sempre que a DNA polimerase se deparar
com o ddNTP com uma base de timina, por
exemplo (e se o tubo for de timina), ela irá parar,
não conseguindo mais avançar
- com a interrupção do avanço da DNA polimerase,
ela não irá conseguir adicionar novas bases, sejam
elas quais forem
- os ddNTP possuem uma cauda que interage com
a luz, isso permite uma identificação de base
através de luzes lasers
. Após todo esse procedimento, o processo de PCR
irá se iniciar
→ exemplo de sequenciamento, baseado no tubo
de citosina:
. Após o sequenciamento pronto, os tubos serão
escorridos em um gel em colunas diferente, cada
coluna com o seu respectivo conteúdo sendo
espalhados conforme o seu tamanho (do maior
para o menor)
. O resultado é lido de baixo para cima das colunas,
do mais leve (menor) para o mais pesado (maior)
. Para a obtenção do resultado das colunas, uma
luz laser é passada em cada banda (sequência
replicada), cada banda irá fornecer uma luz
diferente, essa luz se baseia na base da banda
. Essa leitura por lasers irá gerar um gráfico de
Eletroferograma
→ picos luminosos de determinadas bases
. Esse gráfico é disponibilizado em arquivo, cuja o
conteúdo é em códigos genéticos (ACGT)
. Esse arquivo deve ser inserido no banco de
dados, assim será feita a identificação do
organismo
Bancos de Dados:
. GenBank
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/