Ana Paula Russo - Atividade Biologia Molecular Aplicada à Biotecnologia (1)

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Curso 825 - Pós Graduação em Biotecnologia
Turma: 2020J
Aluna: Ana Paula dos Santos Arrabal Russo
Matrícula: RA862971
Disciplina: Biologia Molecular Aplicada à Biotecnologia
A tecnologia do DNA Recombinante é um conjunto de técnicas utilizadas para a identificação, isolamento e multiplicação de sequências de DNA. Estas técnicas proporcionaram a manipulação de moléculas DNA, consequentemente a clonagem de gene e expressão em grande escala de substâncias úteis (hormônios, vacinas, enzimas entre outros produtos) e a produção de organismos geneticamente modificados. Com base no material didático da disciplina, responda:
1. Para obter pequenas regiões do DNA a serem inseridas em vetores, é necessária a técnica de Digestão Enzimática, capaz de realizar a fragmentação de uma molécula de DNA em tamanhos compatíveis e com extremidades conhecidas. A técnica é a partir do uso de endonucleases que reconhecem e atuam sobre sequências específicas de DNA, realizando a destruição de uma ligação fosfodiéster entre dois nucleotídeos. Observe a preparação da digestão do DNA (sequência da fita senso abaixo) com a enzima de restrição EcoRI, indique as posições que ocorreram as clivagens e quantos fragmentos são gerados. Lembre-se de pesquisar a sequência que a enzima EcoRI corta.
5’CCACACACACCACACCCACACACCACACCCACACTTTTCACATCTACCTCTACTCTGGAATTCCTGTCACTCCTTACCCGGCTTTCTGACCGAAATTAAAAAAAAAAAAATGAAAATGACCCTGTTCTTTAGCCCTACAACACTTCTACATAGGAATTCCCCTAAATAGCCCTAAATAGCCCTCATGTACGTCTCCTCCAAGCCCTGTTGTCTCTTACCCGGATGTTCAACCAAAAGCTACTTTACTTTATTTTATGTTTACTTTTTATAGGTTGTCTTTTTATCCTACTCTTTCCCACTTGTCTC3’
2. Para realizar a ligação (união) de uma molécula de DNA a outra, na técnica DNA recombinante, é necessário reestabelecer as ligações entre moléculas de DNA. Explique como isto pode ser feito.
1. Considerando que a clivagem pela enzima EcoRI ocorre na sequência GAATTC[footnoteRef:0], encontramos 3 fragmentos na sequência citada, no caso de receber a ação da enzima especificada. [0: "Enzimas de restrição e DNA ligase (artigo) | Khan Academy." https://pt.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning-tutorial/a/restriction-enzymes-dna-ligase. Acessado em 17 fev.. 2021.] 
· 5’CCACACACACCACACCCACACACCACACCCACACTTTTCACATCTACCTCTACTCTGG 
· AATTCCTGTCACTCCTTACCCGGCTTTCTGACCGAAATTAAAAAAAAAAAAATGAAAATGACCCTGTTCTTTAGCCCTACAACACTTCTACATAGG 
· AATTCCCCTAAATAGCCCTAAATAGCCCTCATGTACGTCTCCTCCAAGCCCTGTTGTCTCTTACCCGGATGTTCAACCAAAAGCTACTTTACTTTATTTTATGTTTACTTTTTATAGGTTGTCTTTTTATCCTACTCTTTCCCACTTGTCTC3’
2. Como a mesma enzima de restrição reconhece a mesma sequência para clivagem, as partes fragmentadas se reconhecem. Assim, ao se juntar um fragmento de uma fita com um fragmento de outra fita clivada pela mesma enzima, esses fragmentos tendem a se encontrarem e se unirem. Se essa união for selada por uma DNA Ligase, esses fragmentos tornam-se unidos para sempre.
A DNA ligase precisa de um grupo OH livre na extremidade 3’ de uma das cadeias e um grupo fosfato livre na extremidade 5’ da outra cadeia.[footnoteRef:1] [1: "TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE." https://cursosextensao.usp.br/pluginfile.php/46750/mod_resource/content/1/Apostila%20DNA%20Recombinante.pdf. Acessado em 17 fev.. 2021.] 
Referências:
Enzimas de restrição e DNA ligase (artigo) | Khan Academy. Disponível em: <https://pt.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning-tutorial/a/restriction-enzymes-dna-ligase>. Acesso em: 17 fev. 2021.
Cursos de Extensão da USP. Disponível em: <https://cursosextensao.usp.br/pluginfile.php/46750/mod_resource/content/1/Apostila%20DNA%20Recombinante.pdf>.
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