Relatorio_Final_MAC_Vera_Lopes

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UNIVERSIDADE DE LISBOA 
 
FACULDADE DE FÁRMACIA 
 
 
 
 
 
 
RELATORIO DE ESTÁGIO 
 
MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS 
 
 
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 
 
 
LISBOA, 2010 
 
 
 
UNIVERSIDADE DE LISBOA 
FACULDADE DE FÁRMACIA 
 
RELATÓRIO DE ESTÁGIO 
INSTITUTO PORTUGUÊS DE ONCOLOGIA DO PORTO, DR. FRANCISCO 
GENTIL, ENTIDADE PÚBLICA EMPRESARIAL (IPOPFG, E.P.E.) 
Serviço de Hematologia Clínica, 
Serviço de Imunologia, Laboratório de Imunologia Celular 
Serviço de Genética, Laboratório de Genética Molecular e Laboratório de Citogenética 
HOSPITAL CURRY CABRAL 
Serviço de Nefrologia, Laboratório de Imunologia 
LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS DR. MANUEL REYMÃO PINTO, S.A. 
Secção de Bioquímica Clínica 
Secção de Microbiologia 
MATERNIDADE ALFREDO DA COSTA 
Serviço de Procriação Medicamente Assistida 
 
ORIENTAÇÃO: DR. CARLOS MENDES, SERVIÇO HEMATOLOGIA CLÍNICA, IPO PORTO 
 DRª GABRIELA MARTINS, SERVIÇO DE IMUNOLOGIA, IPO PORTO 
 DRª SUSANA BIZARRO, SERVIÇO DE GENÉTICA, IPO PORTO 
 DRª CECÍLIA CORREIA, SERVIÇO DE GENÉTICA, IPO PORTO 
 DRª MARIA DO CÉU SANTOS, SERVIÇO NEFROLOGIA, H. CURRY CABRAL 
 DRª MARGARIDA BAPTISTA, LAC. DR. MANUEL REYMÃO PINTO, S.A. 
 DRª SÓNIA CORREIA, SERVIÇO PMA, MATERNIDADE ALFREDO COSTA 
 
MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS 
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 
 
LISBOA, 2010
 
iii 
 
Resumo 
 
O presente trabalho consiste no relatório de estágio curricular, efectuado como 
parte integrante e conclusivo do Mestrado de Análises Clínicas da Faculdade de 
Farmácia da Universidade de Lisboa. Tem em conta as normas regulamentares do ciclo 
de estudos definidas pelo Decreto-lei nº 74/2006 de 24 de Março. 
O relatório está estruturado em duas partes. A Parte I consiste no registo resumo 
da aprendizagem teórica e prática obtida durante todo o período de estágio nas 
diferentes áreas. A Parte II aborda um tema específico - Metodologias Laboratoriais 
para Diagnóstico e Seguimento Terapêutico em Patologias Auto-Imunes. 
A Parte I é constituída por sete capítulos nos quais se descreve o trabalho 
realizado durante o estágio. O primeiro capítulo refere-se ao estágio realizado em 
Colheitas de Análises Clínicas. O segundo capítulo resume o estágio da valência de 
Hematologia, realizado no Serviço de Hematologia Clínica do IPO Porto, segundo a 
orientação do Dr. Carlos Mendes. O terceiro capítulo resume o estágio da valência de 
Imunologia, realizado no Serviço de Imunologia do IPO Porto, segundo a orientação da 
Drª Gabriela Martins (estágio em Imunologia Celular – Citometria de Fluxo) e no 
Serviço de Nefrologia do Hospital Curry Cabral, segundo a orientação da Drª Maria do 
Céu Santos (estágio em Imunologia Humoral – Auto-Imunidade); a referência ao 
estágio realizado no Serviço de Nefrologia do Hospital Curry Cabral é bastante breve, 
dado ser este o tema desenvolvido na Parte II do relatório de estágio. O quarto capítulo 
resume o estágio da valência de Genética Molecular Humana, realizado no Serviço de 
genética di IPO Porto, Laboratório de Genética Molecular, segundo a orientação da Drª 
Susana Bizarro (estágio em Biologia Molecular) e Laboratório de Citogenética, segundo 
a orientação da Drª Cecília Correia (estágio em Citogenética Clássica e FISH). O quinto 
capítulo resume o estágio das valências de Bioquímica Clínica e Endocrinologia, 
realizados na Secção de Bioquíminca Clínica do Laboratório de Análises Dr. Manuel 
Reymão Pinto, S.A., segundo a orientação da Drª Margarida Baptista. O sexto capítulo 
resume o estágio da valência de Microbilogia, realizado na Secção de Microbiologia do 
Laboratório de Análises Dr. Manuel Reymão Pinto, S.A., segundo a orientação da Drª 
Margarida Baptista (abordagem geral da área de Microbiologia) e no Serviço de 
Procriação Medicamente Assistida da Maternidade Alfredo da Costa, segundo a 
 
iv 
 
orientação da Drª Sónia Correia (realização de espermogramas). Por fim, o sétimo 
capítulo aborda o Controlo de Qualidade Interno e Externo realizado nas diferentes 
áreas de estágio. 
A Parte II deste relatório desenvolve as Metodologias Laboratoriais para 
Diagnóstico e Seguimento Terapêutico nas Doenças Auto-Imunes, focando com maior 
relevo a técnica de Imunofluorescência Indirecta. O trabalho referente a esta segunda 
parte foi desenvolvido em consequência dos conhecimentos apreendidos no estágio de 
Imunologia Humoral realizado no Serviço de Imunologia do Hospital Curry Cabral, 
segundo a orientação e acompanhamento permanente da Drª Maria do Céu Santos. A 
escolha do tema por parte da estagiária deveu-se ao facto dos conhecimentos 
apreendidos terem possibilitado a implementação de uma nova técnica de análise no 
Laboratório de Análises Clínicas Dr. Manuel Reymão Pinto, onde hoje a estagiária 
trabalha – a Imunofluorescência Indirecta. 
 
 
Palavras-Chave: 
 
ANA • Análises Clínicas • Auto-Anticorpos Anti-Citoplasmáticos • Auto-
Anticorpos Anti-Nucleares • Auto-Imunidade • Bioquímica Clínica • Citometria de 
Fluxo • Doenças Auto-Imunes • ELISA • Endocrinologia • Ensaio Imunoenzimático 
• FISH • Genética Molecular • Hematologia • Imunologia • Imunoflourescência 
Indirecta • Microbiologia. 
 
 
 
v 
 
Abstract 
 
The present work represents a curriculum internship report, made conclusive as 
well has an integrant part of Master in Clinical Analysis, School of Pharmacy, 
University of Lisbon (Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade 
de Lisboa), according to decree of law... 
This report is structured in two main parts. The first part (Part I) contains the 
resumed registry of the practical and theoretic learning obtain in different areas of 
study during the occurring internship. The second part (Part II) goes to a specific 
theme of study - Laboratory Methods for Diagnosis and Therapeutic Action in 
Autoimmune Pathology. 
In Part I there are seven different chapters where it is described the work done 
during the internship in seven different areas of scope. Chapter one references the 
work done in Clinical Analysis crops. Chapter two is a résumé of work developed in 
Hematology, work that was performed, according to Dr. Carlos Mendes orientation, 
at the Clinical Service of Hematology IPO OPorto (Serviço de Hematologia Clínica 
do IPO Porto). Chapter three summarizes the work performed in Immunology field, 
with the orientation of Dr. Gabriela Martins (internship in Cellular Immunology – 
Flow Citometry), at the Clinical Service of Immunologyy IPO OPorto (Serviço de 
Hematologia Clínica do IPO Porto) and with the orientation of Dr. Maria do Céu 
Santos (internship in Humoral Immunology – Autoimmunity) at the Nephrology 
Service, Hospital Curry Cabral (Serviço de Nefrologia do Hospital Curry Cabral); as 
a note, in this first part (Part I) of the work, the citation of the developed work in 
Nephrology Service, Hospital Curry Cabral (Serviço de Nefrologia do Hospital 
Curry Cabral ) is very brief, since this is the subject that is vastly reported in Part II. 
Chapter four is dedicated to Human Molecular Genetics, and the internship was 
performed in Genetics Service IPO Oporto (Serviço de genética do IPO Porto) under 
the supervising of Dr. Susana Bizarro (internship in Molecular Biology) and in 
Cytogenetics Laboratory (Laboratório de Citogenética) under guidance of Dr. Cecília 
Correia (internship in Classic Cytogenetics and FISH). This chapter five is dedicated 
to the analysis of Clinical Biochemistry and Endocrinology, performed in Clinical 
 
vi 
 
Biochemistry Department of Laboratory of Clinic Analysis Dr. Manuel Reymão 
Pinto, S.A. (Secção de Bioquíminca Clínica do Laboratório de Análises Dr. Manuel 
Reymão Pinto, S.A) under guidance of Dr. Margarida Baptista. Chapter six is 
accredit to studies in Microbiology, conducted in Microbiology Department of 
Laboratory of Clinic Analysis Dr. Manuel Reymão Pinto, S.A. under guidance of Dr. 
MargaridaBaptista and also in Service of Medical Assisted Procreation of the 
Alfredo da Costa Maternity (Serviço de Procriação Medicamente Assistida da 
Maternidade Alfredo da Costa), which was guided by Dr. Sónia Correia (breading 
spermiograms). Lastly, chapter seven addresses the internal and external quality 
control achieved in different areas of the internship. 
In Part II of this report there’s a development on the laboratory methodologies 
for diagnose and therapeutic follow-up in autoimmune diseases, with bigger strength on 
a specific technique, Indirect Immunofluorescence. The work carried out in this second 
part (Part II) of the report is an accumulation of experience and knowledge gathered in 
the internship of internship in Humoral Immunology – Autoimmunity at the Nephrology 
Service, Hospital Curry Cabral and with the orientation and permanent follow-up by Dr. 
Maria do Céu Santos. This choice fell down to the fact that this learning’s enabled an 
implementation of a new technique at the laboratory workplace of the intern, Laboratory 
of Clinic Analysis Dr. Manuel Reymão Pinto, S.A. - Indirect Immunofluorescence. 
 
 
Keywords: 
 
ANA • Anti-Citoplasmatic Auto-Antibodys • Anti-Nuclear Auto-Antibodys • 
Autoimmune Diseases • Autoimmunity • Clinical Analysis • Clinical Biochemistry • 
ELISA • Endocrinology • FISH • Flow Citometry • Hematology • 
Immunoenzymatic Essay • Immunology • Indirect Immunofluorescence 
Microbiology • Molecular Genetics. 
 
 
 
vii 
 
Índice de Páginas 
 
Parte I - Apreciação Global dos Estágios Realizados ................................................................... 1 
1. Colheitas ................................................................................................................................ 2 
2. Hematologia .......................................................................................................................... 6 
2.1. Equipamento – Sysmex XE 2100 ................................................................................... 9 
3. Imunologia ........................................................................................................................... 18 
3.1. Imunologia Celular ...................................................................................................... 20 
3.1.1. Princípios da Citometria de Fluxo........................................................................ 20 
3.1.2. Preparação das Amostras .................................................................................... 23 
3.1.3. Marcadores Celulares .......................................................................................... 24 
3.2. Imunologia Humoral .................................................................................................... 26 
4. Genética Molecular Humana .............................................................................................. 29 
4.1. Biologia Molecular....................................................................................................... 30 
4.1.1. PCR ...................................................................................................................... 30 
4.1.1.1. Reacção da Polimerase em Cadeia (PCR – Polymerase Chain Reaction) .... 30 
4.1.1.2. RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) ........................................................... 32 
4.1.1.3. RT-PCR Nested ............................................................................................. 32 
4.1.1.4. PCR Específico de Alelo (ASO-PCR) .............................................................. 33 
4.1.1.5. PCR de Longa Distância (PCR-LD) ................................................................ 33 
4.1.1.6. PCR em Tempo Real (Real Time-PCR) – PCR Quantitativo .......................... 34 
4.1.2. Restrição Enzimática ........................................................................................... 37 
4.1.3. Electroforese ....................................................................................................... 37 
4.1.3.1. Electroforese em Gel de Agarose ................................................................ 37 
4.1.3.2. Electroforese Capilar ................................................................................... 38 
4.2. Citogenética ................................................................................................................ 42 
4.2.1. Citogenética Clássica ........................................................................................... 42 
4.2.2. FISH (Fluorescente in situ Hibridization) ............................................................. 44 
4.2.3. Alterações Citogenéticas Frequentes em Neoplasias ......................................... 50 
5. Bioquímica Clínica e Endocrinologia ................................................................................... 55 
5.1. Equipamentos, Fundamentos e Parâmetros Doseados .............................................. 55 
5.1.1. Modular Hitachi SWA, Roche .............................................................................. 55 
5.1.2. Hydrasys Sebia, Phadia ........................................................................................ 58 
5.1.3. Cobas Integra 400 Plus, Roche ............................................................................ 58 
 
viii 
 
5.1.4. Urisys 2004, Roche .............................................................................................. 59 
5.1.5. Immulite 2000, Amerlab...................................................................................... 59 
5.1.6. Vidas, bioMérieux................................................................................................ 60 
5.1.7. Vidia, bioMérieux ................................................................................................ 61 
5.1.8. Serologia Manual................................................................................................. 62 
5.2. Métodos Analíticos...................................................................................................... 62 
5.2.1. Potenciometria .................................................................................................... 62 
5.2.2. Fotometria ........................................................................................................... 63 
5.2.3. Electroforese ....................................................................................................... 63 
5.2.4. Imunoturbidimetria ............................................................................................. 64 
5.2.5. Aglutinação .......................................................................................................... 64 
5.2.6. Fluorescência Polarizada ..................................................................................... 64 
5.2.7. ELISA (Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay) ............................................... 65 
5.2.7.1. ELISA para a detecção de Ag ....................................................................... 66 
5.2.7.2. ELISA para a detecção de Ac ....................................................................... 66 
6. Microbiologia ...................................................................................................................... 68 
6.1. Meios de Cultura ......................................................................................................... 69 
6.2. Condições de Incubação das Sementeiras .................................................................. 70 
6.3. Equipamentos ............................................................................................................. 70 
6.3.1. Sistema VITEK2 Compact, bioMérieux ................................................................ 70 
6.4. Técnicas utilizadas na identificação de microorganismos ..........................................71 
6.4.1. Galeria API NH do Sistema MiniApi, bioMérieux ................................................ 71 
6.4.2. Coloração de Gram .............................................................................................. 71 
6.4.3. Coloração de “ZIEHL - NEELSEN” (Método de coloração de Kinyoun modif. ou de 
Tan - Thiam - Hok) ............................................................................................................... 71 
6.4.4. Teste da Catalase................................................................................................. 72 
6.4.5. Prova da Coagulase ............................................................................................. 72 
6.4.6. SLIDEX Strepto Plus ............................................................................................. 72 
6.4.7. Teste do Tubo Germinal ...................................................................................... 72 
6.4.8. Técnica de Contraste Negativo com Tinta da China ............................................ 72 
6.5. Microorganismos a Valorizar nos Diferentes Produtos Biológicos: ............................ 72 
6.5.1. Urina Asséptica .................................................................................................... 72 
6.5.2. Exsudado Uretral e Vaginal ................................................................................. 73 
6.5.3. Exsudado Nasofaríngeo ....................................................................................... 73 
 
ix 
 
6.5.4. Expectoração ....................................................................................................... 73 
6.5.5. Fezes .................................................................................................................... 73 
6.5.6. Hemoculturas ...................................................................................................... 73 
6.6. Espermogramas ........................................................................................................... 74 
6.6.1. Avaliação Macroscópica Inicial ............................................................................ 74 
6.6.1.1. Liquefacção e Viscosidade ........................................................................... 74 
6.6.1.2. Aparência..................................................................................................... 75 
6.6.1.3. Volume ........................................................................................................ 75 
6.6.1.4. pH ................................................................................................................ 75 
6.6.2. Avaliação Microscópica Essencial ....................................................................... 75 
6.6.2.1. Estimativa da Concentração Espermática ................................................... 75 
6.6.2.2. Motilidade ................................................................................................... 76 
6.6.2.3. Presença de Elementos Celulares para além dos Espermatozóides ........... 77 
6.6.2.4. Agregação e Aglutinação ............................................................................. 77 
6.6.2.5. Concentração Espermática .......................................................................... 77 
6.6.2.6. Morfologia ................................................................................................... 78 
6.6.3. Avaliação Microscópica Complementar .............................................................. 80 
6.6.3.1. Teste da Vitalidade ...................................................................................... 80 
6.6.3.2. Teste da Presença de Auto-Ac Anti-Espermatozóides ................................ 81 
6.6.3.3. Testes Opcionais – Testes Bioquímicos ....................................................... 81 
6.6.4. Nomenclatura ...................................................................................................... 82 
7. Controlo de Qualidade ........................................................................................................ 84 
7.1. Controlo de Qualidade Interno ................................................................................... 84 
7.2. Avaliação Externa da Qualidade (AEQ) ....................................................................... 85 
 
Parte II - Auto-Imunidade, Metodologias Laboratoriais para Diagnóstico e Seguimento 
Terapêutico ................................................................................................................................. 87 
1. Sistema Imunológico e Auto-Imunidade ............................................................................. 88 
2. Doenças Auto-Imunes (DAI) ................................................................................................ 94 
2.1. DAI Multi-Sistémicas ................................................................................................... 94 
2.2. DAI Específicas de Orgão ............................................................................................. 99 
3. Metodologias Laboratoriais .............................................................................................. 103 
3.1. Imunofluorescência Indirecta (IFA) ........................................................................... 104 
3.1.1. Fundamento ...................................................................................................... 104 
 
x 
 
3.1.2. Aplicação ........................................................................................................... 106 
3.1.3. Células e Tecidos Utilizados .............................................................................. 107 
3.1.3.1. Células Utilizadas para Ac. Anti-Nucleares (ANA): células HEp-2 .............. 107 
PADRÕES NUCLEARES COM SIGNIFICADO CLÍNICO .................................. 112 
PADRÕES CITOPLASMÁTICOS COM SIGNIFICADO CLÍNICO ..................... 135 
PADRÕES CITOPLASMÁTICOS SEM SIGNIFICADO CLÍNICO ...................... 140 
3.1.3.2. Células Utilizadas para Ac. Anti-DNAds: células Crithidia luciliae ............. 148 
3.1.3.3. Tecidos Utilizados para Ac. Anti-Citoplasmáticos ..................................... 150 
3.1.3.4. Tecidos Utilizados para Auto-Anticorpos Específicos ............................... 162 
3.2. Ensaio Imunoenzimático – ELISA Qualitativo, ensaio em “Sanduíche” .................... 167 
3.2.1. Fundamento ...................................................................................................... 167 
3.2.2. Aplicação ........................................................................................................... 168 
3.2.3. Ensaios Executados ........................................................................................... 169 
3.2.3.1. ANA Screen ................................................................................................ 169 
3.3. Immunoblotting - Imunodot’s ................................................................................... 170 
3.3.1. Fundamento ...................................................................................................... 170 
3.3.2. Aplicação ........................................................................................................... 172 
3.3.3. Perfis Executados .............................................................................................. 173 
3.3.3.1. Perfil ANA (“ANA Profile 3”) ...................................................................... 173 
3.3.3.2. Perfil Hepático “Liver Profile” ................................................................... 174 
3.3.3.3. Perfil Miosites (“Myosite Profile 3”).......................................................... 175 
3.3.3.4. Perfil Gástrico ............................................................................................ 176 
3.4. Ensaio Imunoenzimático– ELISA Quantitativo, ensaio em “Sanduíche” .................. 177 
3.4.1. Fundamento ...................................................................................................... 177 
3.4.2. Aplicação ........................................................................................................... 178 
3.4.2.1. Ac. anti-DNAds .......................................................................................... 178 
3.4.2.2. Ac. anti-Nucleossoma ................................................................................ 178 
3.4.2.3. Ac. anti-cardiolipina e Ac. anti-β2-glicoproteína I IgG e IgM .................... 178 
3.4.2.4. Ac. anti-Proteinase 3, PR3 ou cANCA ........................................................ 178 
3.4.2.5. Ac. anti-Mieloperoxidase, MPO ou pANCA ............................................... 179 
3.4.2.6. Ac. anti-CCP ............................................................................................... 179 
3.4.3. Outros Ensaios Executados ............................................................................... 179 
3.4.3.1. Ac. anti-ICC e anti-C1q ............................................................................... 179 
3.4.3.2. Ac. anti-GBM ............................................................................................. 180 
 
xi 
 
3.4.3.3. Ac. anti-Gliadina AGA e anti-Transglutaminase tTG (IgG e IgA) ................ 180 
3.4.3.4. Ac. anti-Desmogleinas 1, 3 e BP180 .......................................................... 181 
4. O Futuro… .......................................................................................................................... 182 
5. Observações e Sugestões .................................................................................................. 183 
 
Bibliografia ................................................................................................................................ 186 
Agradecimentos ........................................................................................................................ 188 
Anexo 1 ...................................................................................................................................... 189 
Anexo 2 ...................................................................................................................................... 192 
Anexo 3 ...................................................................................................................................... 193 
 
 
 
 
 
 
xii 
 
Índice de Figuras 
 
Parte I - Apreciação Global dos Estágios Realizados ................................................................... 1 
Figura 1 –Câmara DIFF do aparelho Sysmex XE 2100 ................................................................. 11 
Figura 2 - Câmara WBC/BASO do aparelho Sysmex XE 2100 ...................................................... 12 
Figura 3 – Câmara NRBC do aparelho Sysmex XE 2100 .............................................................. 13 
Figura 4 – Histogramas RBC e PLT do aparelho Sysmex XE 2100 ................................................ 14 
Figura 5 – Canal RET do aparelho Sysmex XE 2100. .................................................................... 16 
Figura 6 – Canal IMI do aparelho Sysmex XE 2100 ..................................................................... 17 
Figura 7 –Gráfico com FSC versus SSC nos contadores hematológicos ...................................... 21 
Figura 8 – Imagens obtidas num Citómetro de Fluxo ................................................................. 21 
Figura 9 – Fluorocromos utilizados pelo Serviço de Imunologia do IPO do Porto ...................... 23 
Figura 10 – Diferentes fases de uma reacção de PCR ................................................................. 34 
Figura 11 – Actuação da sonda TaqMan no decurso de uma reacção de PCR/RT-PCR. ............. 35 
Figura 12 – Leitura do produto de PCR na fase exponencial ...................................................... 36 
Figura 13 – Electroforese em gel de agarose .............................................................................. 38 
Figura 14 – Sequenciação Automática ........................................................................................ 40 
Figura 15 – Cariograma normal do sexo masculino (46,XY) ........................................................ 42 
Figura 16 - Cariótipo com anomalia numérica constitucional e anomalia estrutural adquirida. 43 
Figura 17 – Terminologia dos cromossomas e numeração de bandas. ...................................... 43 
Figura 18 – FISH, Sondas de Painting .......................................................................................... 45 
Figura 19 – FISH , Sondas Alfa-Satélite ........................................................................................ 46 
Figura 20 – FISH, Sondas de Sequência Única. ............................................................................ 46 
Figura 21 – FISH, Sondas Dual Color, Sigle Fusion ....................................................................... 47 
Figura 22 – FISH, Sondas Extra Signal .......................................................................................... 48 
Figura 23 – FISH, Sondas Dual Color, Dual Fusion ....................................................................... 49 
Figura 24 – FISH, Sondas Dual Color, Break Apart ...................................................................... 49 
 
Parte II - Auto-Imunidade, Metodologias Laboratoriais para Diagnóstico e Seguimento 
Terapêutico ................................................................................................................................. 87 
Figura 25 – Estrutura dos Anticorpos .......................................................................................... 89 
Figura 26 – “Buttelfly rash”, LES, DAI Multi-Sistémica ................................................................ 94 
Figura 27 – Sinovite das mãos, AR, DAI Multi-Sistémica ............................................................ 95 
Figura 28 – Aumento das parótidas, SS, DAI Multi-Sistémica ..................................................... 95 
 
xiii 
 
Figura 29 – Depósito de cálcio nas mãos, Esclerodermia, DAI Multi-Sistémica ......................... 96 
Figura 30 – Necrose do dedo, F. de Raynaud, DAI Multi-Sistémica ............................................ 96 
Figura 31 – Músculo Estriado destruído, Miosite, DAI Multi-Sistémica ...................................... 97 
Figura 32 – Glossite, Anemia Perniciosa, DAI Específica de Orgão ........................................... 101 
Figura 33 – Intestino sem vilosidades, Doença Celíaca, DAI Específica de Orgão .................... 101 
Figura 34 – Separação da epiderme, Pênfigo, DAI Específica de Orgão ................................... 102 
Figura 35 – Pênfigo foliáceo, vulgaris e bulhoso. ...................................................................... 102 
Figura 36 – Reacção de imunofluorescência indirecta em lâmina. ........................................... 105 
Figura 37 – Diferentes fases do ciclo celular ............................................................................. 110 
Figura 38 – A célula durante a Interfase ................................................................................... 110 
Figura 39 – Estrutura do envelope nuclear. .............................................................................. 111 
Figura 40 – Padrão homogéneo em células HEp-2 ................................................................... 112 
Figura 41 – Padrão homogéneo em células HEp-2. Cromossomas positivos em profase, 
metafase, anafase e telofase .................................................................................................... 113 
Figura 42 – Padrão homogéneoem tecido hepático de macaco. ............................................. 113 
Figura 43 – DNA, Histonas e Nucleossoma ............................................................................... 114 
Figura 44 – Padrão de Scl-70 em células HEp-2 ........................................................................ 115 
Figura 45 – Padrão fino granular em células HEp-2 .................................................................. 116 
Figura 46 – Diagrama do complexo SS-A/SS-B .......................................................................... 117 
Figura 47 – Padrão granular em células HEp-2. ........................................................................ 118 
Figura 48 – Complexo Sm-U1-snRNP ........................................................................................ 118 
Figura 49 – Padrão Sm e/ou U1-snRNP em células HEp-2 ........................................................ 119 
Figura 50 – Padrão PCNA em células HEp-2. ............................................................................. 120 
Figura 51 – Padrão matriz nuclear em células HEp-2 ................................................................ 121 
Figura 52 – Padrão Membrana Nuclear em células HEp-2. ...................................................... 122 
Figura 53 – Padrão membranar nuclear em tecido hepático de macaco. ................................ 123 
Figura 54 – Padrão Poros da Membrana Nuclear em células HEp-2. ....................................... 124 
Figura 55 – Diagrama da membrana nuclear e do complexo que constitui o poro nuclear. .... 124 
Figura 56 – Padrão Homogéneo Nucleolar em células HEp-2. ................................................. 125 
Figura 57 – Padrão Clumpy Nucleolar nas células HEp-2.. ........................................................ 127 
Figura 58 – Padrão Nucleolar Granular em células HEp-2. ....................................................... 127 
Figura 59 – Padrão Nucleolar Granular com Dots Mitóticos em células HEp-2. ....................... 128 
Figura 60 – Padrão nucleolar granular em células HEp-2. ........................................................ 129 
Figura 61 – Padrão poucos dots nucleares em células HEp-2. .................................................. 130 
 
xiv 
 
Figura 62 – Padrão múltiplos dots nucleares em células HEp-2 ............................................... 131 
Figura 63 – Padrão centrómeros em células HEp-2 .................................................................. 132 
Figura 64 – Localização das proteínas centroméricas. .............................................................. 133 
Figura 65 – Padrão centríolos em células HEp-2. ...................................................................... 134 
Figura 66 – Padrão citoplasmático mitocondrial em células HEp-2. ......................................... 135 
Figura 67 – Padrão Actina em células HEp-2 ............................................................................. 136 
Figura 68 – Padrão Jo-1 em células HEp-2 ................................................................................ 137 
Figura 69 – Padrão SRP em células HEp-2. ................................................................................ 138 
Figura 70 – Padrão ribossomal em células HEp-2. .................................................................... 139 
Figura 71 – Padrão Complexo de Golgi em células HEp-2. ....................................................... 140 
Figura 72 – Padrão tropomiosina em células HEp-2. ................................................................ 141 
Figura 73 – Padrão vimentina em células HEp-2.. ..................................................................... 142 
Figura 74 – Padrão Vimentina em células HEp-2. ..................................................................... 142 
Figura 75 – Padrão Citoqueratina em células HEp-2. ................................................................ 143 
Figura 76 – Padrão Desmina em células HEp-2. ........................................................................ 144 
Figura 77 – Padrão Proteínas de Ancoragem do Citosqueleto em células HEp-2. .................... 144 
Figura 78 – Padrão Lisossomal em células HEp-2. .................................................................... 145 
Figura 79 – Padrão Peroxissomas em células HEp-2. ................................................................ 146 
Figura 80 – Protozoário Crithidia luciliae. ................................................................................. 149 
Figura 81 – Fluorescência em células de Crithidia luciliae ........................................................ 150 
Figura 82 – Tecidos utilizados para pesquisa de auto-anticorpos citoplasmáticos .................. 152 
Figura 83 – Padrões de fluorescência característicos para auto-anticorpos anti-mitocôndriais 
(AMA) ........................................................................................................................................ 155 
Figura 84 – Padrões de fluorescência característicos para auto-anticorpos anti-actina (ASMA)
 ................................................................................................................................................... 152 
Figura 85 – Padrões de fluorescência característicos para auto-anticorpos anti-LKM1 ........... 152 
Figura 86 – Padrões de fluorescência característicos para auto-anticorpos anti-células parietais 
(APCA) ....................................................................................................................................... 152 
Figura 87 – Padrão de fluorescência característico para auto-anticorpos anti-ductos salivares
 ................................................................................................................................................... 162 
Figura 88 – Padrão de fluorescência característico dos Auto-Anticorpos Anti-ilhéus de 
Langerhans em pâncreas de macaco. ....................................................................................... 163 
Figura 89 – Padrão de fluorescência característico dos auto-anticorpos anti-supra-renais em 
córtex adrenal de macaco. ........................................................................................................ 164 
Figura 90 – Padrão de fluorescência característico dos auto-anticorpos anti-endomísio (EMA) 
em esófago de macaco.............................................................................................................. 165 
 
xv 
 
Figura 91 – Padrão de fluorescência característico dos auto-anticorpos anti-músculo estriado 
em músculo esquelético de macaco. ........................................................................................ 166 
Figura 92 – Reacção de ELISA. ................................................................................................... 167 
Figura 93 – Immunoblotting ...................................................................................................... 172 
Figura 94 – ELISA Quantitativa, Curva de calibração absorvância vs concentração. ................ 177 
Figura 95 – ANCAs. .................................................................................................................... 184 
 
Todas as figuras da Parte II têm como fonte os pontos 3 e 4 da Bibliografia: 
3. Bradwell A. R., Hughes R. G., Atlas of HEp-2 Patterns, third edition, The Binding Site, 2007 
4. Bradwell A. R., Stokes R. P., Johnson G. D., Atlas of Autoantibody Patterns on Tissues, second 
edition, The Binding Site, 2004 
 
 
 
 
 
 
 
 
xvi 
 
Índice de Tabelas 
 
Tabela 1 – Parâmetros e Métodos Analíticos Modular Hitachi SWA, Roche .............................. 58 
Tabela 2 – Parâmetros e Métodos Analíticos Cobas Integra 400 Plus, Roche ............................ 58 
Tabela 3 - Parâmetros e Métodos Analíticos Hydrasys Sebia, Phadia ........................................59 
Tabela 4 - Parâmetros e Métodos Analíticos Urisys 2004, Roche ............................................... 59 
Tabela 5 - Parâmetros e Métodos Analíticos Immulite 2000, Amerlab ...................................... 60 
Tabela 6 - Parâmetros e Métodos Analíticos Vidas, bioMérieux ................................................ 61 
Tabela 7 - Parâmetros e Métodos Analíticos Vidia, bioMérieux ................................................. 61 
Tabela 8 – Parâmetros Analíticos de Serologia Manual .............................................................. 62 
Tabela 9 – Diluições utilizadas para determinação da concentração espermática. ................... 76 
Tabela 10 – Doenças Auto-Imunes Multi-Sistémicas. ................................................................. 98 
Tabela 11 – Doenças Auto-Imunes Específicas de Orgão. ........................................................ 102 
Tabela 12– Resumo dos ANAs clinicamente significativos.. ..................................................... 147 
Tabela 13– – Resumo dos auto-anticorpos anti-citoplasmáticos clinicamente significativos. . 148 
Tabela 14 – Associação Clínica e prevalência dos diferentes auto-anticorpos anti-mitocondriais 
(AMAs). .............................................................................................................................. 154 
Tabela 15 - Antigénios contidos na placa de ELISA do ANA Screen e antigénios contidos na tira 
do ANA Profile 3. ............................................................................................................... 173 
Tabela 16– Antigénios contidos no “Liver Profile” e patologias a eles relacionadas................ 175 
Tabela 17 – Antigénios contidos no perfil miosites e suas patologias associadas .................... 176 
Tabela 18 – Alterações genéticas associadas a processos neoplásicos pesquisadas no 
Laboratório de Genética Molecular do IPO Porto. ............................................................ 191 
Tabela 19 – Estudos moleculares, Laboratório de Genética Molecular do IPO Porto. ............. 192 
Tabela 20 – Selecção de agentes anti-microbianos para Enterobacteriaceae. ......................... 193 
Tabela 21 – Selecção de agentes anti-microbianos para Pseudomonas spp e Acinetobacter spp.
 ........................................................................................................................................... 194 
Tabela 22 – Selecção de agentes anti-microbianos para Haemophilus spp. ............................ 194 
Tabela 23 – Selecção de agentes anti-microbianos para Neisseriaceae. .................................. 194 
Tabela 24 – Selecção de agentes anti-microbianos para Staphylococcus spp. ......................... 195 
Tabela 25 – Selecção de agentes anti-microbianos para Listeria Monocitogenes. .................. 195 
Tabela 26 – Selecção de agentes anti-microbianos para Streptococcus spp. ........................... 196 
Tabela 27 – Selecção de agentes anti-microbianos para Corynebacterium spp. ...................... 196 
Tabela 28 – Selecção de agentes anti-microbianos para exsudados oculares. ........................ 197 
 
1 
 
 
 
 
 
 
ParteI 
 
Apreciação Global dos Estágios 
Realizados 
 
 
 
 
 
 
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 2 | 
 
1. Colheitas 
 
 
O estágio decorreu no Posto de Colheitas Eça de Queiroz do Laboratório 
Lababa, integrado no grupo ReymãoLabs, durante o mês de Janeiro de 2009, sob a 
orientação da técnica Manuela.O estágio perfez um total de 80 horas. 
 
Para a colheita de sangue periférico total, deverão encher-se os tubos 
necessários às análises requeridas pela seguinte ordem: 
1. Tubo de citrato; 
2. Tubo de EDTA; 
3. Tubo seco. 
Regra geral, o tubo de citrato utiliza-se para provas de coagulação, o tubo de 
EDTA para hemograma e VS e o tubo seco para a maioria das análises bioquímicas. O 
tubo de citrato e de EDTA exigem agitação suave após o seu enchimento, a fim de que o 
sangue se misture com o anticoagulante. 
 
No que respeita as provas de tolerância aos hidratos de carbono: 
- Pós-Prandial (PP): tirar sangue em jejum, dar 50g de glucose oral ao utente e 
voltar a tirar sangue ao fim de 60 minutos; caso o clínico der indicações específicas, 
seguir à risca as mesmas; 
- Prova de Tolerância Oral à Glucose (PTOG): fazer a colheita de sangue em 
jejum ao utente e executar o teste rápido da glicémia em equipamento próprio. Caso o 
resultado obtido seja inferior a 150 mg/dL, dar 75g de glucose oral e tirar sangue aos 
30, 60, 90 e 120 minutos; se o utente for uma mulher grávida, dar 100g de glucose oral 
e tirar sangue aos 60, 120 e 180 minutos. Caso o resultado obtido esteja entre 150 e 200 
mg/dL, o utente prossegue a prova com 50g de glucose oral. Caso o resultado obtido 
seja superior a 200 mg/dL, o utente prossegue a prova com o pequeno-almoço. Colher 
sempre sangue e urina em paralelo. 
 
A optimização das condições de colheita de produtos para exame 
microbiológico visa manter a viabilidade dos microrganismos mais sensíveis e a não 
 Colheitas 
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 3 | 
 
contaminação da amostra a estudar com anti-sépticos, com flora saprófita do doente ou 
com microrganismos do meio ambiente. Assim, exigem-se algumas regras para a sua 
colheita: 
- Colheita feita em rigorosas condições de assepsia e antes de se iniciar 
terapêutica anti-microbiana e sob rigorosas condições de assepsia; 
- Enviar rapidamente ao Laboratório, os produtos para exame Microbiológico; o 
intervalo de tempo entre a colheita e a sementeira não deve ultrapassar duas horas; 
- Urina Asséptica: amostras da 1ª urina da manhã ou, se não for possível, de 
urina que tenha estado pelo menos durante 3 horas na bexiga; obtenção do jacto médio, 
mantendo o prepúcio retraído ou os pequenos lábios da vagina afastados; para pesquisa 
de BK fazer 3 colheitas de toda a urina da manhã. Conservar no frio; 
- Exsudados Uretrais e Vaginais: não efectuar a higiene íntima de manhã; para 
o exsudado uretral introduzir uma zaragatoa fina até 2 a 4 cm no interior da uretra, 
rodando-a lentamente; para o exsudado vaginal utilizar espéculo ao nível do fundo da 
vagina, do colo e do endocolo uterino. Colher com duas zaragatoas, uma colocada em 
meio de transporte de carvão previamente aquecido a 37ºC e outra que se utiliza para 
efectuar o esfregaço em lâmina. As colheitas para pesquisa de Chlamydia trachomatis 
devem ser feitas por raspagem vigorosa; 
- Quando para o mesmo utente for pedido urina asséptica e exsudado 
uretral/vaginal, estes últimos devem ser colhidos em primeiro lugar; 
- Exsudados Nasofaríngeos: Evitar tocarem com a zaragatoa do exsudado 
faríngeo nos lábios, na língua ou na úvula, pressionando a língua para baixo, com uma 
espátula; efectuar a colheita ao nível das amígdalas e em zonas que se encontrem 
inflamadas. Inserir uma zaragatoa nas fossas nasais até encontrar resistência e rodá-la. 
Colocar as zaragatoas de imediato num meio de transporte. Conservar à temperatura 
ambiente; 
- Exsudados Purulentos (Feridas, Auriculares e Oculares): os produtos de 
feridas abertas são colhidos com zaragatoas e os das colecções purulentas fechadas e/ou 
para pesquisa de microrganismos anaeróbios, com seringa. As zaragatoas devem ser 
mergulhadas no meio de transporte adequado, previamente aquecido a 37C; 
- Derrames das Serosas (Líquido Ascítico, Pleural, Pericárdico e Sinovial): 
enviar um volume mínimo de 10 mL e de 50-100 mL se se suspeitar de um derrame de 
etiologia tuberculosa; 
 Colheitas 
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 4 | 
 
- Expectoração: em jejum, depois de o utente fazer a sua higiene oral e se 
assoar; não cuspir; para a pesquisa de BK 3 a 5 amostras em dias sucessivos. Conservar 
à temperatura ambiente; 
- Fezes: para pesquisa de ovos, quistos e parasitas as amostras devem ser 
colhidas de 2 em 2 ou de 3 em 3 dias, até um total de3, abrangendo um período de 
tempo no mínimo de 8 dias. Fazer o teste da Fita Adesiva para pesquisa de Enterobius 
vermicularis ou de Taenia sp., sem que o utente faça previamente a sua higiene matinal. 
Conservar no frio, excepto para pesquisa de Entamoeba histolytica; 
- Hemoculturas: colher no início da subida da temperatura; efectuar 3 colheitas 
com intervalo de duas horas. Desinfectar a região a puncionar com éter, betadine e 
etanol a 70%¸“injectar” o sangue no frasco do meio de cultura com uma seringa 
diferente da utilizada para a punção. Conservar a 37ºC. 
 
Segue-se a descrição para as condições de colheita de espermogramas: 
 
1. Avaliação inicial: 
 Mínimo duas amostras, com intervalo entre 1 a 3 semanas; 
 Se a motilidade da primeira avaliação for baixa (< 25% com motilidade 
progressiva) a segunda avaliação deverá ser feita o quanto antes, dado que a 
motilidade diminui com o tempo; 
 Se os resultados entre a primeira e a segunda avaliação forem muito 
diferentes, deve fazer-se uma terceira avaliação; 
 Os dias de abstinência para as várias avaliações deverão ser os mesmos. 
 
2. Condições de Colheita: 
 Abstinência sexual mínima de 2 dias e máxima de 7 dias; menos de 2 dias de 
abstinência poderá resultar em diminuição da concentração; mais de 7 dias 
de abstinência poderá resultar em diminuição da motilidade e vitalidade; 
 Ausência de medicação e febre; febre pode causar alterações espermáticas 
observáveis 10 a 12 semanas depois. 
 
3. Colheita: 
 Feita por masturbação para um recipiente estéril; 
 Colheitas 
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 5 | 
 
 A colheita de esperma tem que ser completa; a perda da primeira fracção 
resultará na diminuição da concentração, visto ser nesta fracção que se 
encontram a maioria dos espermatozóides; 
 O recipiente de colheita deverá ser identificado com o nome/nº do utente, 
data e hora da colheita; 
 Feita preferencialmente no laboratório; quando feita no domicílio terá que 
ser entregue ao laboratório num período máximo de 1 hora e deverá ser 
transportada à temperatura do corpo (no bolso); 
 Se for necessária uma análise microbiológica, o utente deverá urinar antes e 
depois desinfectar-se; só em seguida será feita a colheita de esperma; a 
abstinência sexual deverá ser de 5 a 7 dias; 
 Em caso de ejaculação retrógrada, o utente deverá ingerir bicarbonatos de 
véspera, para neutralizar a urina; na colheita deverá urinar antes e depois 
masturbar-se; só depois deverá urinar para o recipiente de colheita; 
 Se for necessário o uso de preservativo, este deverá ser livre de 
espermicidas; os preservativos de látex diminuem a viabilidade dos 
espermatozóides; 
 Coitus interruptus não é aceitável para colheita: a primeira porção de 
esperma (a mais rica em espermatozóides) pode perder-se; o pH ácido 
vaginal diminui a motilidade, as formas normais e a concentração dos 
espermatozóides; poderá haver contaminação celular e bacteriológica do 
esperma com as secreções vaginais. 
 
 
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 6 | 
 
2. Hematologia 
 
O estágio decorreu no Instituto Português de Oncologia do Porto Francisco 
Gentil, Entidade Pública Empresarial (IPOPFG, E.P.E.), no Serviço de Hematologia 
Clínica, durante os meses de Fevereiro e Abril de 2009 do IPO Porto, sob a orientação 
do Dr. Carlos Mendes. O estágio perfez um total de 294 horas. 
 
Trata-se de uma Entidade Pública Empresarial, de prestação de serviços de 
saúde no domínio da oncologia, bem como a investigação, o ensino e o rastreio 
oncológico. Pelo prestígio conquistado adquiriu hoje dimensão europeia e internacional, 
sendo membro activo da European Organization of Research and Treatment of Cancer 
(EORTC). 
 
No Serviço de Hematologia Clínica procede-se à elaboração e interpretação de 
hemogramas, mielogramas e outras técnicas manuais inseridas no contexto da área 
(colorações citoquímicas várias), bem como à contagem de células sanguíneas em 
citoesfregaços de LCR e outros líquidos biológicos. O laboratório divide-se em três 
principais áreas distintas: uma área onde se efectuam as punções digitais para 
monitorização do estado geral de crianças em ambulatório com patologias oncológicas 
diagnosticadas, uma área onde se encontram os diferentes aparelhos e uma terceira área 
destinada à validação dos resultados. O serviço recebe, em média, 400 hemogramas 
diariamente. 
 
Para o estágio realizado foi de extrema utilidade para a estagiária os 
conhecimentos teóricos apreendidos na cadeira de Hematologia II do Mestrado em 
Análises Clínicas. O défice de aulas práticas da referida cadeira justificou a escolha do 
Instituto para a realização do estágio. 
 
Assim, o estágio decorreu maioritariamente na área destinada à validação dos 
resultados, onde o tempo foi sobretudo empregue na visualização de lâminas de sangue 
periférico e medula óssea e realização da respectiva fórmula leucocitária para as 
diferentes patologias oncológicas. Visualizaram-se lâminas que apareceram durante a 
http://www.eortc.be/
 Hematologia 
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 7 | 
 
rotina laboratorial diária e também lâminas de arquivo do Instituto. Visualizaram-se 
lâminas das seguintes patologias oncológicas: 
 
Neoplasias Mieloproliferativas: 
 Leucemia Mielóide Crónica (LMC), BCR-ABL1 positiva; 
 Leucemia Neutrofílica Crónica; 
 Policitémia vera; 
 Mielofibrose Primária; 
 Trombocitémia Essencial; 
 Leucemia Eosinofílica Crónica. 
 
Neoplasias Mielodisplásicas/Mieloproliferativas: 
 Leucemia Mielóide Crónica atípica, BCR-ABL1 negativa. 
 
Síndromes Mielodisplásicos vários (subclassificação é impossível pelo sangue 
periférico) 
 
Leucemias Mieloblásticas Agudas (LMA): 
 LMA com t(8;21)(q22;q22), ETO-AML1; 
 LMA com inv(16)(p13.1q22), CBFB-MYH11; 
 Leucemia Aguda Promielocítica com t(15;17)(q22;q12), PML-RARA; 
 LMA com t(9;11)(p22;q23), AF9-MLL; 
 LMA (megacarioblástica) com t(1;22)(p13;q13); RBM15-MKL1; 
 LMA Com Diferenciação Mínima; 
 LMA Sem Maturação; 
 LMA Com Maturação; 
 Leucemia Mielomonocítica Aguda; 
 Leucemia Monocítica e Monoblástica Aguda; 
 Leucemia Eritróide Aguda; 
 Leucemia Megacarioblástica Aguda; 
 
Leucemias Bifenotípicas 
 
 Hematologia 
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 8 | 
 
Neoplasias de Precursores Linfóides: 
 Leucemia Linfoblástica Aguda B com t(9;22)(q34;q11.2), BCR-ABL1; 
 Leucemia Linfoblástica Aguda B com t(4;11)(q21;q23), AF4-MLL; 
 Leucemia Linfoblástica Aguda B com t(12;21)(p13;q22), TEL-AML1; 
 Leucemia Linfoblástica Aguda B com t(1;19)(q23;p13.3), E2A-PBX1; 
 Leucemia Linfoblástica Aguda T; 
 
Neoplasias de Células B Maturas: 
 Leucemia Linfocítica Crónica (LLC); 
 Leucemia Prolinfocítica B; 
 Linfoma Esplénico da Zona Marginal; 
 Leucemia a Hairy-Cell (tricoleucemia); 
 Mieloma Múltiplo; 
 Linfoma da Zona Marginal; 
 Linfoma Folicular; 
 Linfoma do Manto; 
 Linfoma Difuso de Grandes Células B; 
 Linfoma de Burkitt. 
 
Neoplasias de Células T e NK Maturas: 
 Leucemia Prolinfocítica T; 
 Leucemia Linfocítica T a Grandes Células Granulares; 
 Desordem Linfoproliferativa Crónica a Células NK; 
 Síndrome de Sézary; 
 Linfoma Anaplásico. 
 
Houve também oportunidade para realizar colorações citoquímicas (Fosfatase 
Alcalina dos Leucócitos, Mieloperoxidase, Naftol-Cloroacetato Esterase, α-Naftil-
Acetato Esterase, Ácido Periódico de Schiff e Coloração de Perl’s). 
 
Durante o estágio, a estagiária reorganizou ainda os dossies de arquivo do 
Instituto segundo a classificação da OMS 2008 (visto estarem até à data organizados 
pela classificação FAB), adicionou novas lâminas ao arquivo e fotografou todas as 
 Hematologia 
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 9 | 
 
lâminas relevantes, a fim de criar um arquivo de imagens com patologias diagnosticadas 
no próprio Instituto. Por outro lado, houve ainda a possibilidade da estagiária criar asua 
própria laminoteca com as lâminas de interesse que foram surgindo no dia-a-dia. 
 
Pela experiência adquirida durante o estágio, os parâmetros definidos para 
visualização de lâminas de sangue periférico no laboratório onde a estagiária trabalha 
foram afinados. Por outro lado, o laboratório alterou o seu equipamento de Hematologia 
para o existente no IPO Porto – Sysmex XE 2100. 
 
2.1. Equipamento – Sysmex XE 2100 
 
Utiliza os seguintes métodos para determinação dos vários parâmetros: 
 
1. Citometria de fluxo: 
 
Todas as células da amostra passam individualmente entre dois pólos, criando 
assim um fluxo laminar. À medida que passam individualmente neste fluxo, faz-se 
incidir sobre cada célula três tipos de radiação diferentes: 
- FSC, Forward Scattered Light: radiação que incide de frente na célula, sendo 
difundida através da célula; avalia o tamanho celular; 
- SSC, Side Scattered Light: radiação que incide lateralmente na célula, sendo 
dispersa; avalia a complexidade/granularidade celular; 
- SFI, Side Fluorescent Light: radiação que incide lateralmente na célula; indica 
a actividade fluorescente celular, relacionada com a quantidade de DNA e RNA que a 
célula contém; faz com que as histonas directamente ligadas ao material genético 
fluoresçam. 
Através da informação obtida (tamanho celular, complexidade celular e 
conteúdo em material genético), o aparelho faz a contagem total e diferencial dos 
leucócitos, conta os eritrócitos imaturos (NRBC), os reticulócitos e as plaquetas 
imatura. 
 
 
 
 Hematologia 
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 10 | 
 
 
2. Método de Capacitância Eléctrica / Medição de Resistência Eléctrica (fluxo 
DC): 
 
As células da amostra são colocadas individualmente num espaço entre dois 
eléctrodos com cargas opostas. A presença de uma célula irá alterar a resistência 
eléctrica; a alteração da resistência eléctrica gerada pela presença de uma célula entre os 
dois eléctrodos é medida, sendo esta proporcional ao volume celular. 
 
3. Método Colorimétrico: 
 
A formação de um composto corado é medida em solução por determinação 
fotométrica da sua absorvância, sendo comparada com a absorvância da mesma solução 
sem o composto corado. 
 
4. Método de Impedância Eléctrica (método RF-DC): 
 
A amostra de sangue (mau condutor de corrente eléctrica) é diluída numa 
solução electrolítica e é exposta a uma corrente eléctrica entre dois eléctrodos. A 
presença de uma célula sanguínea entre os dois eléctrodos vai aumentar a resistência na 
corrente eléctrica (DC), gerando uma alteração no potencial entre os eléctrodos e, 
consequentemente, gerando um impulso eléctrico; a intensidade do impulso gerado é 
proporcional ao tamanho celular. Por outro lado, a densidade relativa das células 
(estrutura molecular interna) poderá determinar-se por radiofrequência (RF). Este 
processo melhora a precisão e reprodutibilidade das contagens de células sanguíneas em 
relação ao método de capacitância eléctrica. 
 
A análise dos diferentes parâmetros é feita em 7 câmaras de detecção distintas: 
 
1. Câmara DIFF: 
 
Utiliza a técnica de citometria de fluxo. 
Nesta câmara é feita a contagem diferencial das diferentes populações de 
leucócitos, excepto dos basófilos. 
 Hematologia 
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 11 | 
 
Para isso inicialmente são lisados os eritrócitos. Aos leucócitos são apontados 
raios laser no bloco óptico de detecção; a luz difundida e dispersa são medidas, o que 
permite tirar conclusões sobre o tamanho e complexidade celular, respectivamente. 
Assim, o aparelho consegue distinguir as diferentes populações de leucócitos, 
apresentando os resultados sobre a forma de um gráfico com o tamanho celular (FSC) 
em ordenadas e a complexidade celular (SSC) em abcissas. 
 
 
 
Figura 1 – Localização das diferentes populações leucocitárias na câmara DIFF do aparelho 
Sysmex XE 2100 (imagem cedida pela Roche). 
 
As células imaturas presentes na amostra também podem ser observadas neste 
gráfico, uma vez que apresentam um tamanho muito superior à das células maturas. 
Assim, irão aparecer no gráfico para cima, tipo foguetes, como prolongamentos das 
respectivas células maturas. Sempre que estejam presentes estes foguetes justifica-se, 
portanto, a visualização da lâmina de sangue periférico; estes poderão corresponder a 
uma infecção bacteriana ou viral (mononucleose infecciosa) ou a um processo 
neoplásico. 
Esta tecnologia apresenta, no entanto, dois possíveis problemas. O primeiro 
reside no facto de, por vezes, existirem eritrócitos resistentes à lise celular. Estes 
eritrócitos são geralmente mais imaturos na sua diferenciação e aparecem muitas vezes 
em amostras de sangue periférico de recém-nascidos ou em certas neoplasias 
(Mielofibrose Primária, alguns SMD, LMA Eritróide). Irão aparecer no canto esquerdo 
inferior do gráfico. Por outro lado, se a amostra contiver linfócitos fragilizados, como 
acontece em certas patologias oncológicas linfóides, estes poderão não resistir ao 
processo de lise destinado aos eritrócitos, sendo assim quantificados por defeito. Os 
 Hematologia 
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 12 | 
 
seus restos celulares irão aparecer na mesma zona do gráfico que os eritrócitos 
resistentes à lise. 
Através desta distribuição não é possível, no entanto, visualizar os basófilos, 
uma vez que eles se localizam na mesma zona de distribuição que os linfócitos e, sendo 
geralmente poucos, são encobertos pela população linfocitária. Assim, a contagem de 
basófilos é feita numa câmara diferente. 
 
2. Câmara WBC/BASO: 
 
Utiliza a técnica de citometria de fluxo. 
Nesta câmara é feita a contagem de basófilos, bem como a contagem total de 
leucócitos. 
Para isso, lisam-se inicialmente os eritrócitos maturos para que a contagem total 
de leucócitos possa ser feita no bloco óptico de detecção. No caso da amostra conter 
eritrócitos nucleados, estes irão resistir à lise celular e ser quantificados como 
leucócitos. Esta correcção é feita por recurso a outra câmara do aparelho. 
Seguidamente, todos os leucócitos excepto os basófilos são lisados, o que 
permite a quantificação destes últimos no bloco óptico de detecção. 
Assim, sempre que a mancha correspondente aos basófilos neste gráfico estiver 
aumentada, justifica-se a visualização da lâmina de sangue periférico, pois pode estar-se 
na presença de uma LMC. 
 
 
Figura 2 - Localização das diferentes populações leucocitárias na câmara WBC/BASO do 
aparelho Sysmex XE 2100 (imagem cedida pela Roche). 
 
 
 Hematologia 
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 13 | 
 
3. Câmara NRBC: 
 
Utiliza a técnica de citometria de fluxo. 
Nesta câmara quantificam-se os eritrócitos imaturos nucleados (NRBC), a fim de 
que não seja necessário fazer a correcção do número total de leucócitos por contagem 
manual dos NRBCs em amostras de sangue periférico onde precursores eritróides estão 
presentes. 
Para isso lisam-se as membranas dos eritrócitos maturos, ficando intactos 
NRBCs e os leucócitos. Seguidamente tinge-se o material genético (mais precisamente 
as histonas) dos NRBCs e dos leucócitos, de forma a que este material genético 
fluoresça quando a SFI incidir sobre ele. Uma vez que os leucócitos apresentam mais 
histonas do que os NRBCs e visto que o tamanho de leucócitos e NRBCs é claramente 
distinto, é possível quantificá-los separadamente. A sua distribuição faz-se num gráfico 
com tamanho em abcissas e nível de fluorescência emitida em ordenadas. 
Sempre que este canal indicar a presença de NRBCs, caso não se trate de um 
recém-nascido, a lâmina de sangue periférico deverá ser visualizada, pois é possível que 
se esteja na presença de uma anemia regenerativa mas também de um processo 
neoplásico (Policitémia vera, Mielofibrose Primária, SMD com displasia da série 
eritróide ou LMA Eritróide). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3 – À esquerda,imagem correspondente à visualização de um sangue periférico sem 
NRBCs na câmara NRBC do aparelho Sysmex XE 2100; à direita, imagem correspondente à visualização 
de um sangue periférico com NRBCs na câmara NRBC do aparelho Sysmex XE 2100 (imagens cedidas 
pela Roche). 
 
 Hematologia 
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4. Canal RBC: 
 
Utiliza a técnica de capacitância eléctrica / medição de resistência eléctrica 
(fluxo DC). 
Nesta câmara quantificam-se os eritrócitos (RBC) e as plaquetas (PLT). 
Discriminadores automáticos separam as duas populações celulares. 
Sempre que os valores obtidos para os eritrócitos ou plaquetas forem muito 
baixos justifica-se a visualização da lâmina de sangue periférico, pois muitos processos 
neoplásicos conduzem a uma baixa destas duas séries por invasão da medula óssea por 
precursores leucocitários. 
 
 
 
Figura 4 – À esquerda, histograma RBC do aparelho Sysmex XE 2100; à direita, histograma 
PLT do aparelho Sysmex XE 2100 (imagens cedidas pela Roche). 
 
5. Canal de fluxo: 
 
Utiliza o método colorimétrico. 
Neste canal quantifica-se a hemoglobina (Hb) da amostra. 
Para tal, a amostra é diluída numa solução electrolítica que conduz a corrente 
eléctrica, ocorrendo assim a lise dos eritrócitos e a consequente libertação da 
hemoglobina (Hb). Segue-se a conversão da Hb em cianometahemoglobina (SLS-Hb), 
um composto corado cuja absorvância a 540 nm é medida fotometricamente. A 
absorvância da SLS-Hb é comparada com a absorvância da solução electrolítica sem 
amostra diluída. 
 
A partir dos parâmetros determinados no canal RBC e canal de fluxo, os índices 
eritrocitários podem ser calculados pelo aparelho. 
 
 Hematologia 
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6. Canal RET: 
 
Utiliza a técnica de citometria de fluxo. 
Nesta câmara quantificam-se os reticulócitos e as plaquetas muito imaturas 
(PLT-fl). 
Para isso tinge-se o material genético (mais precisamente as histonas) de todas 
as células presentes na amostra: leucócitos, NRBCs, reticulócitos e plaquetas muito 
imaturas. As plaquetas maturas não apresentam núcleo e, portanto, não têm material 
genético que possa ser corado; só as muito imaturas apresentam vestígios de material 
genético. 
Como a intensidade de fluorescência dos leucócitos e dos NRBCs é muito 
elevada em relação à dos reticulócitos e das plaquetas imaturas, estas populações 
conseguem facilmente distinguir-se das populações que se desejam avaliar nesta câmara 
e o cut-off no gráfico é feito de forma a que leucócitos e NRBCs nem sequer sejam 
visualizados. 
À medida que maturam, os reticulócitos vão perdendo material genético e, 
assim, intensidade de fluorescência. Como tal, num diagrama em que se avalia o 
tamanho celular em abcissas e o grau de fluorescência emitida em ordenadas, é possível 
distinguir as diferentes populações de reticulócitos, desde os mais imaturos (HFR - high 
fluorescence ratio), passando pelos de maturidade intermédia (MFR – middle 
fluorescence ratio), até aos reticulócitos mais maturos (LFR – low fluorescence ratio), 
acabando nos eritrócitos maturos (RBC-o) já sem fluorescência emitida. 
Adicionalmente, a fracção da população muito precoce de reticulócitos (IRF, 
reticulócitos imaturos) é analisada. 
As plaquetas imaturas (PLT-fl), que ainda emitem fluorescência, são muito mais 
pequenas que os reticulócitos e, para além disso, emitem menos fluorescência que estes 
últimos, podendo assim distinguir-se no gráfico. Estas plaquetas imaturas não são 
quantificadas no canal que mede usualmente as plaquetas (canal RBC). Assim, se as 
plaquetas forem quantificadas no canal RET, o seu valor será ligeiramente superior 
dado a suplementar quantificação das plaquetas imaturas. Esta quantificação é muito 
importante sobretudo para doentes que apresentam níveis baixos de plaquetas, exibindo 
um valor próximo do cut-off entre o fazer ou não uma transfusão, receber ou não o seu 
tratamento de quimioterapia. Assim, no IPO sempre que um doente apresenta um valor 
de plaquetas ligeiramente inferior a 20x10^9/L (nível de cut-off importante para muitas 
 Hematologia 
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 16 | 
 
decisões terapêuticas, quase que como os 150x10^9/L do limiar inferior que geralmente 
se admite fora de um instituto de oncologia), este parâmetro é quantificado no canal 
RET, podendo, assim, evitar-se transfusões em certos casos ou permitir-se a 
quimioterapia noutros. 
 
 
Figura 5 – Localização das diferentes fracções de reticulócitos imaturos e de plaquetas 
fluorescentes no canal RET do aparelho Sysmex XE 2100 (imagens cedidas pela Roche). 
 
7. Canal IMI: 
 
Utiliza a método de impedância eléctrica (método RF-DC). 
Neste canal quantificam-se as células imaturas: as stem cell (HPC – Human 
Progenitor Cells) e os granulócitos imaturos (IG – Immature Granulocytes). 
O reagente utilizado afecta os constituintes lipídicos das membranas celulares. 
Assim, eritrócitos e leucócitos maturos são lisados. Os leucócitos imaturos permanecem 
intactos, dado o seu menor conteúdo em lípidos a nível das membranas celulares. 
Assim, em amostras de sangue normais (isto é, sem precursores), nenhumas células 
aparecem no gráfico correspondente ao canal IMI visto que todas as células são lisadas. 
Este gráfico comporta em ordenadas o sinal RF (corresponde à estrutura molecular 
interna das células) e em abcissas o sinal DC (correspondendo ao volume celular). Em 
amostras de sangue de pacientes sujeitos a quimioterapia, a visualização dos HPC 
permitirá concluir que o doente está a arrancar; o parâmetro IG permitirá detectar 
precocemente uma possível infecção. 
Assim, sempre que o gráfico correspondente ao canal IMI indicar a presença de 
células precursoras a lâmina de sangue periférico deverá ser visualizada. 
 Hematologia 
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 17 | 
 
Por outro lado, este canal também dá uma ideia da existência de agregados 
plaquetários (PLT Clumps), que no caso de existirem aparecerão como prolongamentos 
das plaquetas isoladas. Poderá, nesse caso, ponderar-se uma pseudo-trombocitopénia, 
devendo visualizar-se a lâmina a fim de a confirmar. Para a objectiva de 100x, a 
observação de 5 plaquetas por campo corresponde sensivelmente a uma contagem de 
100x10^9/L plaquetas. 
 
 
 
Figura 6 – Canal IMI do aparelho Sysmex XE 2100; imagem de um sangue periférico sem 
percursores mielóides nem agregados plaquetários (imagem cedidas pela Roche). 
 
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 18 | 
 
3. Imunologia 
 
O estágio decorreu: 
- No Instituto Português de Oncologia do Porto Francisco Gentil, Entidade 
Pública Empresarial (IPOPFG, E.P.E.), Serviço de Imunologia, Laboratório de 
Imunologia Celular, durante o mês de Março de 2009, sob a orientação da Drª Gabriela 
Martins (Imunologia Celular). O estágio perfez um total de 154 horas. 
- No Hospital Curry Cabral, Serviço de Nefrologia, Laboratório de Imunologia, 
entre 7 de Setembro e 16 de Outubro, sob a orientação da Drª Maria do Céu Santos 
(Imunologia Humoral). O estágio perfez um total de 150 horas. 
 
Antes da realização do estágio, a estagiária tinha pouco conhecimento teórico da 
área, adquirido na valência de Hematologia II e Imunologia do Mestrado de Análises 
Clínicas. Os estágios, contudo, permitiram o adquirir de conhecimentos teóricos mais 
sólidos e a sua aplicação prática. 
 
Os conhecimentos apreendidos e praticados no estágio de Imunologia Humoral 
permitirão a implementação da Técnica de Imunofluorescência Indirecta no Laboratório 
onde a estagiária trabalha. 
 
O serviço de Imunologia do IPO Porto recebe, em média, cinco amostras 
diariamente. 
Durante a primeira semana de estágio, a estagiária teve a oportunidade de 
aprender a preparar as amostras que foram surgindo na rotina diária; durante a segunda 
semana adquiriu amostras nos dois Citómetros de Fluxo do serviço; a terceira equarta 
semanas de estágio foram dedicadas à análise de resultados no programa Infinicyt. 
Durante o estágio, a estagiária teve ainda oportunidade de frequentar um curso 
nocturno de Iniciação à Citometria de Fluxo leccionado pela Enzifarma. 
 
O Laboratório de Imunologia do Hospital Curry Cabral executa semanalmente, 
em média, 80 amostras para pesquisa de ANAs por Imunofluorescência Indirecta, 30 
amostras para pesquisa de Auto-Anticorpos Anti-DNAds, 20 amostras para pesquisa 
 Imunologia Celular 
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 19 | 
 
geral de Auto-Anticorpos Anti-Citoplasmáticos e 30 amostras para pesquisa de ANAs 
específicos por Dot’s. 
Durante o estágio, a estagiara teve oportunidade de executar lâminas 
manualmente e automaticamente para as diferentes técnicas de Imunofluorescência 
Indirecta e visualizá-las. Teve ainda oportunidade de executar automaticamente testes 
de ELISA, verificar o funcionamento do aparelho de ELISA e executar Dot’s para as 
diferentes técnicas disponíveis no hospital. 
 
 
 Imunologia Celular 
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 20 | 
 
3.1. Imunologia Celular 
 
3.1.1. Princípios da Citometria de Fluxo 
 
A Citometria de Fluxo exibe a capacidade de medir propriedades (parâmetros 
celulares) de partículas em suspensão, uma a uma. 
Quando uma amostra em solução é injectada num Citómetro de Fluxo, as 
partículas em suspensão são aleatoriamente distribuídas no espaço tridimensional. 
Assim, é necessário que as partículas da amostra sejam alinhadas, de forma a que o 
sistema de detecção do Citómetro de Fluxo as consiga avaliar individualmente. Este 
processo é conseguido pelo sistema de fluidos do aparelho, que consiste num canal 
central apertado através do qual a amostra é injectada com uma determinada velocidade 
de fluxo. Sob condições optimizadas, obtém-se um fluxo laminar, sendo cada partícula 
analisada individualmente. 
Após focagem hidrodinâmica, cada partícula é atravessada por um feixe de luz 
(laser). Estando cada partícula ligada a um fluorocromo, após a absorção de energia do 
feixe de luz incidente, a emissão de fluorescência pelo fluorocromo fornecerá 
informação acerca das propriedades da partícula a que está ligado. A radiação emitida 
na direcção do feixe de luz incidente é captada por uma lente conhecida por “Forward 
Scatter Channel” (FSC); fornece informação acerca do tamanho da partícula e 
distingue partículas inteiras (células vivas, maiores) de partículas alteradas (restos 
celulares, menores). A radiação emitida aproximadamente a 90 graus do feixe de luz 
incidente é captada por uma lente conhecida por “Side Scatter Channel” (SSC); fornece 
informação acerca da complexidade (conteúdo em granulação) da partícula. As duas 
informações em simultâneo permitem distinguir vários tipos de células numa amostra 
heterogénea. 
 Imunologia Celular 
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 21 | 
 
 
 
Figura 7 – Imagem obtida nos contadores hematológicos. Gráfico com FSC (tamanho celular) no 
eixo dos y, versus SSC (granularidade) no eixo dos x. Só estes dois parâmetros permitem distinguir a 
população normal de linfócitos, monócitos, neutrófilos, eosinófilos e restos celulares (ghost). Os poucos 
basófilos são encobertos pela vasta população de linfócitos normais (imagem cedida pela Enzifarma). 
 
 
 
Figura 8 – Imagens obtidos num Citómetro de Fluxo. Na imagem à esquerda, gráfico com SSC 
(granularidade) no eixo dos y e FSC (tamanho) no eixo dos x; é possível distinguir linfócitos (vermelho), 
monócitos (azul escuro), neutrófilos (verde), eosinófilos (roxo) e restos celulares (laranja); os monócitos 
(azul claro) misturam-se com os linfócitos. Na imagem à direita, gráfico com CD45 (marcador 
leucocitário) no eixo dos y e SSC (granularidade) no eixo dos x; é possível isolar a população 
monocitóide da linfóide (imagem cedida pela Enzifarma). 
 
A medição da fluorescência emitida a diferentes comprimentos de onda, 
seleccionados com recurso a diferentes filtros, fornece informação quantitativa e 
qualitativa acerca dos fluorocromos ligados tanto à superfície das partículas (receptores 
celulares) como ao seu interior (moléculas intracelulares, como DNA e citocinas). 
 Imunologia Celular 
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 22 | 
 
Quando a luz emitida atinge um fotodetector gera-se uma pequena corrente 
eléctrica, cuja voltagem é proporcional ao número de fotões recebidos pelo detector. 
Esta voltagem é convertida em sinal digital e, seguidamente, expressa graficamente. 
Nem todos os fluorocromos podem ser utilizados em Citometria de Fluxo. É 
necessário que a diferença entre a Energia de Absorção e a Energia de Emissão do 
fluorocromo seja suficientemente elevada para que apresentem diferentes cores no 
espectro de luz visível. Por exemplo, o fluorocromo FITC (“Fluorecein Isothiocyanate”) 
absorve luz entre os 400-550 nm (luz azul) e emite o seu máximo de radiação a 525 nm 
(luz verde). 
Como escolher o melhor laser e o melhor filtro para cada fluorocromo? O pico 
de absorção para o FITC ocorre para 490 nm. Assim, o laser escolhido para a sua 
excitação deve excitar próximo deste valor (escolhe-se o laser Azul de Argon, que 
excita a 488 nm), pois quanto mais o fluorocromo se excitar, maior intensidade de 
fluorescência irá emitir. Por outro lado, embora emita o seu máximo de radiação a 525 
nm (luz verde), o FITC emite radiação num espectro mais alargado que vai de 475 a 700 
nm (abrange a zona do azul-verde-amarelo-laranja). Consoante o filtro escolhido, assim 
a zona do espectro onde irá emitir radiação, assim a cor que evidenciará. O filtro 
escolhido deverá seleccionar o máximo de radiação emitida para o fluorocromo, para 
que este apresente a maior intensidade possível. Para o FITC deve escolher-se um filtro 
que seleccione a radiação emitida a 525 nm (luz verde); daí dizer-se que o FITC é um 
fluorocromo verde. 
Utilizando-se vários fluorocromos é possível analisar vários parâmetros 
celulares ao mesmo tempo numa determinada amostra. Assim, é possível que, por 
exemplo, o fluorocromo FITC se ligue a todos os CD45 (marcador leucocitário) da 
superfície celular, enquanto que o fluorocromo PerCP se liga a todos os CD19 
(marcador de linfócitos B). Conjugando vários fluorocromos é possível obter-se 
informação acerca de múltiplas propriedades celulares numa só análise. 
 
 Imunologia Celular 
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 23 | 
 
 
Figura 9 – Fluorocromos utilizados pelo Serviço de Imunologia do IPO do Porto nos dois 
citómetros existentes no serviço (imagem cedida pelo Serviço de Imunologia do IPO, Porto). 
 
Uma consideração a ter em conta quando se utilizam múltiplos fluorocromos é a 
possível sobreposição espectral. Isto é, há possibilidade do espectro de emissão de dois 
(ou mais) fluorocromos coincidir, tornando a medição da fluorecência do fluorocromo 
que de facto emitiu a radiação difícil. Esta interferência é evitável porque actualmente o 
próprio Citómetro faz automaticamente a chamada compensação de fluorescência; isto 
é, selecciona diferentes comprimentos de onda para a leitura da emissão de radiação 
para fluorocromos cujo espectro de emissão seja em parte sobreponível. 
 
3.1.2. Preparação das Amostras 
 
Utilizam-se amostras de sangue periférico total, aspirado medular, biopsia 
aspirativa de gânglios, fragmentos de biopsia excisionais de gânglios, lavado bronco-
alveolar, líquido cefalo-raquidiano e líquido ascítico. O EDTA é o anticoagulante de 
eleição. 
As amostras deverão ser analisadas pouco tempo após a colheita, para que se 
evite a morte celular. 
A amostra deverá apresentar uma densidade celular que ronde os 10^6 
células/mL para evitar entupir o Citómetro. Assim, a densidade celular da amostra é 
medida previamente, sendo a amostra diluída numa solução isotónica. 
À amostra adicionam-se os anticorpos-monoclonais (marcados com 
fluorocromos) cuja presença se pretende analisar.