AVALIAÇÃO 1 DA OBTENÇÃO E QUALIDADE DE OÓCITOS POST 2 MORTEM DE LHAMAS (LAMA GLAMA)

Prévia do material em texto

PRIMEIRA AVALIAÇÃO DA OBTENÇÃO E QUALIDADE DE OÓCITOS POST 1 
MORTEM DE LHAMAS (LAMA GLAMA) PELO AZUL CRESIL BRILHANTE 2 
First recovery and quality assessment of post mortem ooocytes from lhamas (lama glama) 3 
by brilliant cresyl blue 4 
 5 
Leda Maria Costa PEREIRA1*, Francisco Douglas Lima ANASTASIO2, Yvyna Byanca 6 
Simões de LIMA2, Germano Gonçalves TEIXEIRA¹; Evelyn de Castro PINHEIRO1; 7 
Dárcio Ítalo Alves TEIXEIRA1, Paulo Ricardo de Oliveira BERSANO2 8 
 9 
1.Laboratório de Diagnóstico por Imagem aplicado à Reprodução, Faculdade de 10 
Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, Av. Dr. Silas Munguba, 1700, Campus do 11 
Itaperi, Fortaleza-Ceará. CEP: 60.740-000. *E-mail: leda.pereira@uece.br 12 
2. Laboratório de Patologia e Medicina Veterinária Legal, Faculdade de Veterinária, 13 
Universidade Estadual do Ceará. 14 
 15 
 16 
 17 
 18 
 19 
 20 
 21 
 22 
 23 
 24 
 25 
 26 
 27 
 28 
 29 
 30 
 31 
 32 
 33 
 34 
about:blank
RESUMO 35 
Este estudo objetivou demonstrar a aplicabilidade da técnica de fatiamento ovariano (slicing) 36 
na recuperação de oócitos post mortem em uma lhama (lama glama) vítima de 37 
broncopneumonia aguda e a eficácia da técnica do azul cresil brilhante (ACB) para 38 
selecionar oócitos de qualidade para um posterior cultivo in vitro. A ovário-salpingo-39 
histerectomia (OSH) foi realizada 12h após a morte do animal. Os ovários foram 40 
transportados refrigerados imediatamente para o laboratório em meio Leibovitz (L-15). Os 41 
oócitos foram identificados, quantificados sob lupa estereomicroscópica e classificados de 42 
acordo com dois métodos: classificação morfológica convencional e ensaio de ACB. Foram 43 
obtidos 26 oócitos classificados pela morfologia convencional em: 10 oócitos grau 1, 12 44 
oócitos grau 2 e 4 oócitos grau 3. A utilização do corante ACB demonstrou que 88% dos 45 
oócitos avaliados mantiveram sua qualidade e eram competentes para conservação do 46 
material genético ou futura aplicação em biotecnologias reprodutivas nesta espécie. Sugere-47 
se novos estudos visando a utilização de oócitos selecionados com ACB para potencializar 48 
o sucesso do cultivo in vitro nesta espécie. 49 
Palavras-chave: camelídeos, oócito, azul cresil brilhante, biotécnicas reprodutivas. 50 
 51 
ABSTRACT 52 
This study aimed to demonstrate the applicability of the ovarian slicing technique in the 53 
recovery of post mortem oocytes in a llama (lama glama) victim of acute bronchopneumonia 54 
and the effectiveness of the brilliant cresyl blue (ACB) technique to select quality oocytes 55 
for a subsequent in vitro culture. The ovary-salpinge-hysterectomy (OSH) was performed 56 
12 hours after the animal's death. The ovaries were transported refrigerated immediately to 57 
the laboratory in Leibovitz medium (L-15). The oocytes were identified, quantified under a 58 
stereomicroscopic and classified according to two methods: conventional morphological 59 
classification and ACB assay. 26 oocytes classified by conventional morphology were 60 
obtained: 10 oocytes grade 1, 12 oocytes grade 2 and 4 oocytes grade 3. The use of the ACB 61 
dye demonstrated that 88% of the evaluated oocytes maintained their quality and were 62 
competent for the conservation of genetic or future material application in reproductive 63 
biotechnologies in this species. Further studies are suggested aiming to use selected oocytes 64 
with ACB to enhance the success of in vitro culture in this species. 65 
Keywords: camelids, oocyte, brilliant cresyl blue, reproductive biotechniques. 66 
 67 
 68 
INTRODUÇÃO 69 
Camelídeos sul-americanos como a lhama (lama gama) e alpaca (lama paco) vêm 70 
sendo criados em cativeiro e utilizados para exposição em zoológicos e parques, para 71 
reprodução e comercialização de animais, além da produção de lã e transporte de cargas, 72 
características estas ainda pouco exploradas no país. As biotécnicas de reprodução assistida 73 
tais como a inseminação artificial (IA), a maturação in vitro de gametas (MIV), a fecundação 74 
in vitro (FIV), têm como objetivo a maximização do desempenho reprodutivo das espécies 75 
animais. Em lhamas, devido ao longo período de gestação (335-360 dias) com apenas um 76 
nascimento por ano, torna-se de suma importância o desenvolvimento de técnicas 77 
reprodutivas visando otimizar a reprodução de fêmeas geneticamente superiores para 78 
intensificar o progresso genético nesta espécie. Entretanto, a tecnologia de transferência de 79 
embriões e os protocolos de superestimulação têm sido aplicados em camelídeos com 80 
sucesso limitado. Dentre os entraves identificados, pode-se citar os problemas relacionados 81 
à estimulação ovariana, a qualidade dos oócitos obtidos e as condições de cultivo (CORREA 82 
et al., 1997). Além disso, o número de oócitos obtidos por meio da aspiração folicular nestes 83 
animais é relativamente baixo. Estudo realizado por Ratto et al. (2005), utilizando protocolo 84 
de superovulação, obteve apenas 11 oócitos com a utilização desta técnica. Complexos 85 
cumulus-oócitos (CCOs) aspirados de folículos de 1-12mm de lhamas não estimuladas 86 
proporcionaram uma média de 6 oócitos/animal com 62% atingindo o estágio de metáfase 87 
II após 36h de cultivo in vitro (DEL CAMPO et al., 1994). 88 
Devido à baixa obtenção quantitativa e qualitativa de oócitos, o corante Azul Cresil 89 
Brilhante (ACB) pode ser empregado como ferramenta para a seleção de oócitos 90 
competentes que serão utilizados na maturação in vitro (MIV). O corante ACB possibilita a 91 
identificação da fase de desenvolvimento oocitário, por meio da metabolização dessa 92 
substância pela enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH). Conforme a competência 93 
oocitária vai progredindo, ocorrem alterações metabólicas na atividade de determinadas 94 
enzimas, como a G6PDH. Os oócitos provenientes de folículos no final do desenvolvimento 95 
apresentam menor atividade da enzima G6PDH quando comparados aos gametas femininos 96 
no início de seu desenvolvimento, sendo possível identificar a fase em que o oócito se 97 
encontra, uma vez que o corante ACB é metabolizado e reduzido a um composto de 98 
coloração menos intensa pela enzima G6PDH (MANGIA e EPSTEIN, 1975). Devido à sua 99 
importância e o escasso conhecimento sobre a biologia reprodutiva e o sucesso limitado na 100 
aplicação de biotécnicas reprodutivas em lhamas, este trabalho teve o objetivo de avaliar a 101 
técnica de fatiamento ovarino (slicing) para a obtenção de oócitos e avaliar a competência 102 
dos mesmos por meio do azul cresil brilhante visando o uso futuro no cultivo in vitro e o 103 
incremento das taxas de metáfase nesta espécie. 104 
 105 
MATERIAL E MÉTODOS 106 
Origem do material em estudo e processamento dos ovários 107 
Utilizou-se uma fêmea de Lhama (lama glama), a qual foi encaminhada da Fazenda 108 
de Experimentação Agropecuária Dr. Esaú Accioly Vasconcelos, Guaiúba, Ceará, para a 109 
sala de Necropsia do Hospital Veterinário Prof. Sylvio Barbosa Cardoso (UECE), vítima de 110 
broncopneumonia aguda. A necropsia foi realizada cerca em média 12h após a sua morte. 111 
Após a OSH, o útero e os ovários foram mensurados (Fig. 01 e Fig. 02). Os ovários 112 
foram isolados assepticamente, lavados em meio MEM/HEPES, colocados em tubo Falcon 113 
contendo meio Leibovitz (L-15) e transportados imediatamente para o laboratório. Feito isto, 114 
foram transferidos para placa de Petri contendo PBS (Fig. 03). Os ovários foram seccionados 115 
em fatias finas com lâminas de bisturi ao longo do seu comprimento e largura (slicing), para 116 
a liberação dos complexos cumulus–oócito (COCs)(Fig.04). Os oócitos foram identificados, 117 
quantificados sob lupa estereomicroscópica (Leica ® MZ 12,5) e classificados de acordo 118 
com dois métodos: classificação morfológica convencional e ensaio de ACB (Fig 04 e Fig 119 
05). Na classificação morfológica convencional,os oócitos foram avaliados conforme a 120 
homogeneidade, coloração do citoplasma e número de camadas das células do cumulus 121 
segundo os critérios morfológicos adotados por De Loose et al. (1989) e divididos em três 122 
graus: grau 1 (G1): COCs com cinco camadas de células do cumulus e citoplasma 123 
homogêneo; grau 2 (G2): COCs com duas a quatro camadas de células do cumulus e 124 
citoplasma homogêneo; grau 3 (G3): COCs com uma camada de células do cumulus ou 125 
parcialmente desnudo e citoplasma vacuolizado e grau 4 (G4) oócitos desnudos e com 126 
citoplasma granular. 127 
 128 
Ensaio com azul cresil brilhante para seleção dos oócitos competentes 129 
O ensaio do ACB foi baseado no protocolo adotado por El Shourbagy et al., (2006). 130 
Imediatamente, após a seleção morfológica dos oócitos, os COCs foram incubados em gotas 131 
de 200 µl de ACB diluído em PBS (26µM; B-5388; Sigma, St Louis, MO, USA) por um 132 
período de 60 minutos. Decorrido esse tempo, os COCs foram lavados em três gotas de 200 133 
µl de PBS e os oócitos foram classificados de acordo com a coloração, como ACB (+) 134 
(citoplasma azulado, sendo considerados competentes) e os oócitos e ACB (–) (citoplasma 135 
incolor, considerado menos competentes). A classificação dos oócitos foi realizada sob 136 
estereomicroscópio com magnitude de 50x. 137 
 138 
 Fig 01. Mensuração do útero Fig 02. Mensuração do ovário Fig. 03. Ovário em meio PBS 139 
 140 
Fig 04. Slicing dos ovários Fig. 05. Avaliação morfológica Fig.06. Avaliação por ACB 141 
 142 
RESULTADOS E DISCUSSÃO 143 
O útero e os ovários foram avaliados na busca de alterações patológicas e 144 
mensurados. As seguintes dimensões foram observadas: corno uterino com 7cm x 2cm; 145 
cérvix com 6cm x 4cm e os ovários com 1cm x 1,5 cm. Foram obtidos 26 oócitos por meio 146 
da técnica do slicing classificados morfologicamente em: 10 oócitos grau 1, 12 oócitos grau 147 
2 e 4 oócitos grau 3. Do total de oócitos avaliados, uma proporção de 88% oócitos (n=23) 148 
foram identificados como ACB positivos. Dois métodos de obtenção de oócitos são 149 
utilizados nos camelídeos sul-americanos: o slicing ou fatiamento ovarino e a aspiração de 150 
folículos utilizando uma agulha acoplada a uma seringa (CORREA et al., 1997; RATTO et 151 
al., 2005). A técnica do slicing tem possibilitado a taxa mais alta de oócitos recuperados (27 152 
por fêmea) entretanto tem-se observado uma população heterogênea de oócitos que 153 
contribuem para baixas taxas de maturação in vitro (DEL CAMPO et al., 1994). Aspiração 154 
de folículos de 1 a 12mm resultaram numa média de 7 oócitos por fêmea e 2 a 3 oócitos após 155 
a aspiração de folículos de 3 a 6mm (RATTO et al., 2005). Esse estudo foi eficaz na 156 
recuperação de oócitos post mortem do animal já que a quantidade obtida foi praticamente 157 
similar a mais alta já registrada. De forma similar, neste estudo uma população heterogênea 158 
de oócitos também foi observada. 159 
Esse estudo representou a primeira avaliação utilizando o ACB para avaliar a 160 
qualidade de oócitos de lhama post mortem e foi obtida ótima taxa de sucesso. Estudos tem 161 
demonstrado que oócitos ACB+ apresentam maior diâmetro; maior volume; maior número 162 
de cópias de DNAmt (DNA mitocondrial) que por sua vez, está associada com a competência 163 
oocitária, capacidade de fertilização e desenvolvimento embrionário; e maiores taxas de 164 
maturação nuclear in vitro quando comparado aos oócitos ACB- (ALM et al., 2005). O 165 
presente estudo estudo além de proporcionar boa recuperação oocitária também demonstrou 166 
taxa eficaz de 88% de oócitos ACB+ mesmo a recuperação ocorrendo após 12h da morte do 167 
animal, demonstrando que o material genético de animais sejam estes domésticos, silvestres 168 
ou ameaçados de extinção podem ser conservados e aproveitados para biotecnologias 169 
reprodutivas. Apesar do relativo sucesso em técnicas como superestimulação ovariana e 170 
transferência de embriões, técnicas como a inseminação artificial e fertilização in vitro ainda 171 
apresentam grandes entraves para seu desenvolvimento, devido às peculiaridades 172 
reprodutivas dessa espécie, como a ovulação induzida com meia-vida curta do corpo lúteo, 173 
o reconhecimento materno da gestação curto, gestação só estabelecida no corno uterino 174 
esquerdo e machos com baixa concentração espermática. Assim, a possibilidade de 175 
selecionar oócitos de melhor competência para o desenvolvimento de biotécnicas favorece 176 
o progresso genético de espécies de alto valor zootécnico tornando possível a 177 
comercialização futura. 178 
CONCLUSÃO 179 
A lhama possui particularidades reprodutivas únicas que são responsáveis pelo 180 
sucesso limitado das técnicas reprodutivas. Dessa forma, a seleção de oócitos competentes 181 
anteriormente ao cultivo in vitro pode potencializar as taxas de M-II nesta espécie superando 182 
as limitações observadas na aplicação das biotécnicas reprodutivas nesta espécie. 183 
 184 
REFERÊNCIAS 185 
CORREA, J.E.; RATTO, M.H.; GATICA, R. Superovulation in llamas (Lama glama) with 186 
pFSH and equine Chorionic Gonadotrophin used individually or in combination. Animal 187 
Reproduction Science, v.46, p.289–96, 1997. 188 
DE LOOSE F.; VAN VLIET, P.; VAN MAURIK, P.; KRUIP, T.A.M. Morphology of 189 
immature oocytes. Gamete Research, v.24, p.197–204, 1989. 190 
DEL CAMPO, C.H.; DONOSO, M.X.; BERLAND, M. MAPLETOFT, R.J. In vitro 191 
fertilization and development of lhama (lama glama) oocytes using epidjdymal spermatozoa 192 
and oviductal cell. Theriogenology, v. 41, p. 1219-1229, 1994. 193 
EL SHOURBAGY, S.H.; SPIKINGS, E.C.; FREITAS, M.; ST JOHN, J.C. Mitochondria 194 
directly influence fertilization outcome in pig. Reproduction, v.131, p. 233–45, 2006. 195 
LEON, J.B.; SMITH, B.B.; TIMM, K.I.; LECREN, G., 1990. Endocrine changes during 196 
pregnancy, parturition and the early post-partum period in the llama (Lama glama). Journal 197 
of Reproduction and Fertility, v.88, p.503–511, 1990. 198 
MANGIA, F.; EPSTEIN, C.J. Biochemical studies of growing mouse oocytes: Preparation 199 
of oocytes and analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase and lactate dehydrogenase 200 
activities. Developmental Biology, v.45, p.211-220, 1975. 201 
RATTOA, M.; BERLANDB, M.; HUANCAC, W.; SINGHA, J.; ADAMSA, G.P. In vitro 202 
and in vivo maturation of llama oocytes. Theriogenology, v.63, p. 2445-2457, 2005. 203