Funções Biológicas dos Glicanos

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Capítulo 7
Função Biológica dos Glicanos
Varki A, Gagneux P.
Princípios Gerais
Assim como ocorre com outras macromoléculas, as funções biológicas dos glicanos abrangem diversas funções, desde sutil a crucial para o desenvolvimento, crescimento, manutenção ou sobrevivência do organismo que os sintetiza.
Funções desconhecidas ou diferentes dependendo de qual aglicona ele está ligado. 
Ao longo dos anos, muitas teorias foram avançadas a respeito, e embora haja evidências para apoiar todas aquelas, exceções para cada uma também podem ser encontradas. 
Funções biológicas dos glicanos podem ser divididas em três grandes categorias :
Explicação : abundância e enorme diversidade de glicanos na natureza.
Princípios Gerais
Reconhecimento específico por outras moléculas
2. Mimetismo molecular
3. Propriedades estruturais e modulatórias
Princípios Gerais
Reconhecimento específico por outras moléculas
2. Mimetismo molecular
3. Propriedades estruturais e modulatórias
GBPs
Intrínseco
Medeiam as interações célula-célula 
Reconhecem moléculas extracelulares
Reconhecem outros glicanos na mesma célula.
Compreendem : adesinas, aglutininas ou toxinas microbianas patogênicas
Medeiam relações simbióticas ou defesa do organismo
Extrínsecos
Classificação geral das funções biológicas dos glicanos. Uma classificação simplificada e ampla é apresentada, enfatizando os papéis das proteínas de ligação ao glicano intrínsecas e extrínsecas ao organismo no reconhecimento de glicanos. Há alguma sobreposição entre os grupos (por exemplo, algumas propriedades estruturais envolvem o reconhecimento específico de glicanos). Na parte inferior da figura, o reconhecimento intrínseco é representado pela ligação mostrada à esquerda da célula "self" central e o reconhecimento extrínseco é representado pela ligação mostrada à direita dessa célula. 
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Princípios Gerais
1. Reconhecimento específico por outras moléculas - mais comumente, proteínas de ligação ao glicano 
2. Mimetismo molecular
3. Propriedades estruturais e modulatórias, incluindo armazenamento e sequestro de nutrientes
Patógenos  "mimetismo molecular“  evitar reações imunológicas  decorando-se com glicanos típicos de seus hospedeiros
“Truques de glicano“  modular a imunidade do hospedeiro  aumento da tolerância. 
A maioria dos microorganismos são eles próprios alvos de patógenos (por exemplo, bacteriófagos que invadem bactérias), sendo o reconhecimento de glicano também uma característica comum dessas interações.
Evasão imune
Câncer
Mimetismo Molecular e Proteção Glycan. Proteínas virais extensivamente glicosiladas protegem-se da resposta imune do hospedeiro pela oclusão da superfície proteica imunogênica com um revestimento denso de glicanos derivados do hospedeiro.
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Princípios Gerais
1. Reconhecimento específico por outras moléculas - mais comumente, proteínas de ligação ao glicano 
2. Mimetismo molecular
3. Propriedades estruturais e modulatórias
Funções estruturais e modulatórias dos glicanos 
Diversas funções de proteção, estabilização, organizacionais e de barreira. 
 Manutenção da estrutura, porosidade e integridade do tecido
 Escudo geral; proteção  reconhecimento por proteases, bloqueando a ligação do anticorpo e até mesmo protegendo toda a superfície do tecido da fixação microbiana
Funções estruturais e modulatórias dos glicanos 
Degradação
Conformação da proteína.
Por outro lado, há exemplos de glicoproteínas cuja síntese, dobramento, tráfego, sensibilidade à proteólise ou reconhecimento imunológico parecem não afetados pela alteração de sua glicosilação.
 Além disso, os inibidores ou mutações genéticas que afetam apenas as etapas posteriores do processamento de glicano muitas vezes não interferem nas funções estruturais básicas.
Princípios Gerais
1. Reconhecimento específico por outras moléculas - mais comumente, proteínas de ligação ao glicano 
2. Mimetismo molecular
3. Propriedades estruturais e modulatórias
4. Consequências biológicas da alteração experimental da glicosilação
Consequências biológicas da alteração experimental da glicosilação são variáveis
Funções
 Resultado  variações intra e interespécies na glicosilação sejam relativamente comuns, e pelo menos parte da diversidade de glicanos na natureza pode representar assinaturas de interações patógeno-hospedeiro passadas ou atuais.
 ≠ In vitro x In vivo
Importância dos estudos!
Tecido-específica
Diferentes momentos do desenvolvimento (funções intrínsecas do organismo)
Diferentes contextos ambientais (funções extrínsecas do organismo)
Consequências biológicas da alteração experimental da glicosilação são variáveis
Glicosilação inicial
Alongamento da cadeia do glicano
Processamento do glicano
Desglicosilação enzimática/química de cadeias completas
Modificação genética de locais de glicosilação
Consequências : indetectáveis ​​até a perda completa de funções específicas ou mesmo a perda de todo o glicoconjugado.
Mesmo dentro de uma classe particular de moléculas (por exemplo, receptores de superfície celular), os efeitos da alteração da glicosilação são variáveis ​​e imprevisíveis. Além disso, a mesma alteração de glicosilação pode ter efeitos marcadamente diferentes em diferentes tipos de células ou quando estudada in vivo ou in vitro. O efeito pode depender da estrutura do glicano, do contexto biológico e da função biológica específica. 
Visto isso, é difícil prever as funções que um determinado glicano em um determinado glicoconjugado pode mediar e sua importância relativa para o organismo.
Funções estruturais e modulatórias dos glicanos 
Modular as interações de proteínas umas com as outras. 
Alguns receptores do fator de crescimento adquirem suas habilidades de ligação de uma maneira dependente da glicosilação durante o trânsito pelo aparelho de Golgi. Isso pode limitar as interações precoces indesejadas de um receptor recém-sintetizado com um fator de crescimento que é sintetizado na mesma célula.
Efeito “on/off”: quando o hormônio beta HCG é desglicosilado, ele ainda se liga ao seu receptor com afinidade semelhante, mas não consegue estimular adenilato ciclase.
Na maioria dos casos, os efeitos da glicosilação são incompletos; ou seja, a glicosilação parece estar “ajustando” uma função primária da proteína, em vez de ativá-la ou desativá-la.
Reconhecimento específico por outras moléculas
2. Mimetismo molecular
3. Propriedades estruturais e modulatórias
Glicanos como ligantes específicos para interações celular (reconhecimento intrínseco)
Receptores endocíticos que reconhecem sequências específicas de glicano  funções ainda não foram atribuídas. 
Existem vários casos em que glicanos livres podem ter ações hormonais que induzem respostas de uma maneira altamente específica da estrutura:
Lipócito-oligossacarídeos  simbiontes bacterianos e fúngicos com raízes de plantas 
Propriedades bioativas de fragmentos de ácido hialurônico  induzem respostas biológicas de uma maneira dependente do tamanho e da estrutura . 
Fragmentos de heparan livre ou de dermatan sulfato (glicosaminoglicano) liberados por certos tipos de células podem ter efeitos biológicos em situações como a cicatrização de feridas. 
Glicanos têm muitos papéis biológicos específicos no reconhecimento célula-célula e nas interações célula-matriz.
Glicanos como ligantes específicos para interações celular (reconhecimento intrínseco)
Selectina P reconhece o ligante com alta afinidade apenas no contexto dos 13 aminoácidos de PSGL-1, que incluem os resíduos de tirosina sulfatados necessários.
Glicanos como ligantes específicos para interações celular (reconhecimento intrínseco)
As interações carboidrato-carboidrato também podem ter papéis biológicos específicos nas interações célula-célula. 
Ligação intraespecífica 
Compactação facilitada por uma interação Lewis x – Lewis x. 
Glicanos como ligantesespecíficos para interações célula-microorganismo (reconhecimento extrínseco)
Dada a rápida evolução dos patógenos e a seleção contínua, normalmente há uma excelente especificidade de reconhecimento para a sequência dos glicanos envolvidos.
Hemaglutininas de muitos vírus reconhecem especificamente o tipo de ácido siálico hospedeiro, suas modificações e sua ligação à cadeia de açúcar subjacente. Da mesma forma, várias toxinas se ligam com grande especificidade a certos gangliosídeos, mas não a estruturas relacionadas.
Alguns organismos também desenvolveram a capacidade de mascarar ou modificar glicanos reconhecidos por microrganismos ou toxinas. Enquanto isso, as sequências de glicano em glicoconjugados solúveis, como as mucinas secretadas, agem como iscas para microrganismos e parasitas. 
Assim, um organismo patogênico ou toxina que evolui para se ligar às membranas celulares da mucosa pode primeiro encontrar seu ligante cognato ligado a uma mucina solúvel, que pode então ser lavada, removendo o perigo para as células subjacentes.
1. Reconhecimento específico por outras moléculas
2. Mimetismo molecular
3. Propriedades estruturais e modulatórias, incluindo armazenamento e sequestro de nutrientes
Mimetismo molecular
Proteínas virais extensivamente glicosiladas protegem-se da resposta imune do hospedeiro pela oclusão da superfície protéica imunogênica com um revestimento denso de glicanos derivados do hospedeiro
Consequência apropriação direta ou indireta de glicanos hospedeiros, evolução convergente para vias biossintéticas semelhantes e até mesmo transferência lateral de genes. 
Em alguns casos, o impacto do patógeno é agravado por reações autoimunes, resultantes de reações do hospedeiro a esses antígenos semelhantes. 
Evasão Imune por Mimetismo Molecular e Proteção Glycan. Proteínas virais extensivamente glicosiladas protegem-se da resposta imune do hospedeiro pela oclusão da superfície proteica imunogênica com um revestimento denso de glicanos derivados do hospedeiro
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Glycan Mimicry in Vaccine Design
“Escudo de Glicanos”
Mimetismo de epítopos de glicano: abordagens biológicas
Uma falha potencial  embora os glicanos do tipo oligomanose do HIV-1 não sejam tipicamente observados em glicoproteínas de mamíferos, eles ainda são fundamentalmente estruturas "próprias". 
Desafio para o desenvolvimento de bnAbs direcionados a glicano  as células B de reatividade cruzada provavelmente serão consideradas autorreativas  seleção negativa.
O fato de que os bnAbs geralmente não surgem até depois de vários anos de infecção pode apoiar a noção de que eles estão operando no limite da tolerância imunológica ou pode simplesmente refletir o longo processo de maturação. 
No entanto, a tolerância às estruturas próprias pode ser quebrada.
bnABS: Anticorpos amplamente neutralizantes do HIV-1
Evasão Imune por Mimetismo Molecular e Proteção Glycan. Proteínas virais extensivamente glicosiladas protegem-se da resposta imune do hospedeiro pela oclusão da superfície proteica imunogênica com um revestimento denso de glicanos derivados do hospedeiro
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Glycan Mimicry in Vaccine Design
 Por exemplo, em alguns casos, infecção por C. jejuni inicia uma resposta de anticorpos contra seus lipooligossacarídeos bacterianos que são capazes de se ligar a estruturas quase idênticas nos gangliosídeos do sistema nervoso periférico 
A doença autoimune , a síndrome de Guillain-Barré, fornece uma prova de conceito de que a tolerância imunológica aos "próprios" glicanos pode ser quebrada pela exposição a micro-organismos com estruturas semelhantes.
Evasão Imune por Mimetismo Molecular e Proteção Glycan. Proteínas virais extensivamente glicosiladas protegem-se da resposta imune do hospedeiro pela oclusão da superfície proteica imunogênica com um revestimento denso de glicanos derivados do hospedeiro
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Importância potencial de sequências terminais, modificações e estruturas incomuns
Desafio: prever quais estruturas de glicano são susceptíveis de mediar os papéis biológicos mais específicos ou cruciais dentro de um organismo. 
Sequências de açúcar terminais, estruturas incomuns ou modificações de glicanos são mais prováveis ​​de estarem envolvidas em tais funções específicas. 
Empecilho tais estruturas também são mais propensas a se envolver em interações com microrganismos e outros agentes potencialmente nocivos. 
Outra complexidade surge da "microheterogeneidade" na estrutura de glicano 
O desafio, então, é prever e classificar quais funções distintas podem ser atribuídas a uma determinada estrutura de glicano em um determinado tipo de célula e organismo. 
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Importância potencial de sequências terminais, modificações e estruturas incomuns
“Corrida armamentista coevolutiva”
Patógenos tendem a explorar glicanos que são difíceis para o hospedeiro mudar (aqueles com função intrínseca do hospedeiro), e porque os hospedeiros são incapazes de alterar seus glicanos facilmente devido às suas taxas evolutivas mais lentas. 
Por outro lado, hospedeiros tendem a desenvolver glicanos que são difíceis para os microorganismos mimetizarem, como o ácido siálico específico para vertebrados Neu5Gc e GAGs sulfatados, que procariotos parecem ter reinventado.
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Abordagens para elucidar funções biológicas específicas de glicanos
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Localização/interferência com glicanos específicos usando sondas de reconhecimento de glicano (GRPs)
Muitas abordagens atuais para compreender a diversidade de glicanos envolvem a extração e identificação de todo o complemento de glicanos encontrados em um determinado órgão ou tecido, sem levar em conta o fato de que tipos de células individuais e até mesmo área basal x apical da mesma célula pode ter padrões de expressão de glicano amplamente variáveis. 
No entanto, a localização específica do tipo de célula de glicanos pode ser explorada usando GRPs altamente específicos 
Alguns GRPs (por exemplo, anticorpos) tendem a ter afinidade fraca e mostrar reatividade cruzada. 
 Embora algumas lectinas de plantas pareçam muito específicas para glicanos, elas se originam de organismos que normalmente não contêm o mesmo ligante. Assim, sua especificidade aparente pode não ser tão confiável ao introduzi-los em sistemas biológicos complexos, onde eles podem se ligar e gerar reação cruzada desconhecidas.
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Inibição metabólica / alteração da glicosilação
Muitos agentes farmacológicos podem inibir ou alterar metabolicamente a glicosilação em células e animais.
Embora tais agentes sejam ferramentas para elucidar as vias biossintéticas, eles podem produzir resultados confusos em diversos sistemas. 
Uma preocupação é que um inibidor pode ter efeitos em outras vias não relacionadas. 
Tunicamicina  bloqueia a N-glicosilação mas também pode causar estresse no ER e inibir a absorção de UDP-Gal para o Golgi. 
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Como os "domínios de reconhecimento de carboidratos" específicos podem ser identificados em uma sequência de aminoácidos primária, é possível prever se uma proteína recém-clonada pode se ligar ou não a um tipo de glicano. 
Se um GBP potencial pode ser produzido em quantidades suficientes, técnicas como hemaglutinação, citometria de fluxo, ressonância plasmônica de superfície e cromatografia de afinidade, podem ser usadas para pesquisar ligantes específicos.
 Além disso, como muitas estruturas de glicanos podem ser expressas em diferentes tecidos, em diferentes momentos do desenvolvimento e do crescimento, um GBP recombinante pode detectar uma estrutura cognata em um local e em um momento em que não é de grande relevância biológica. 
A consideração cuidadosa da ocorrência natural e do perfil de expressão dos GBPs deve levar a uma decisão racional sobre onde procurar seus ligantes de glicano biologicamente relevantes.
GBPs
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A situação inversa surge quando um glicano incomum é encontrado para ser expresso em um contexto interessante e é hipotetizado ser um ligante para um receptor específico.
 É possível pesquisar esse receptor por técnicas semelhantes às anteriores, como hemaglutinação, citometria de fluxo e cromatografia de afinidade. Para facilitar a pesquisa, é necessário ter quantidades razoáveis ​​do glicano puro definido em questão, bem como uma variedade de estruturas intimamente relacionadas como controles negativos. 
 Pode não ser óbvio onde buscar a proteína de ligação ao glicano. Por exemplo, o receptor que reconhece os N-glicanos sulfatados dos hormônios glicoproteicos da hipófise foi eventualmente encontrado não na hipófise nem em qualquer um dos tecidos-alvo para esses hormônios, mas nas células endoteliais do fígado, onde regula a meia-vida circulante de os hormônios 
 Na verdade, o receptor mais biologicamente relevante para um glicano específico pode até ser encontrado em outro organismo (um patógeno, um simbionte...).
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Interferência de glicanos solúveis
A adição de glicanos solúveis em um sistema pode bloquear a interação entre uma GBP endógena e um glicano específico. 
Se uma concentração suficiente do inibidor específico puder ser alcançada, as alterações fenotípicas resultantes podem ser instrutivas. 
Ao estudar sistemas in vitro, até mesmo monossacarídeos podem ser usados em tais experimentos, como exemplificado pela via do receptor Man-6-P . 
No entanto, muitas vezes é necessário usar glicanos em altas concentrações para bloquear as interações de local de afinidade relativamente baixa entre um GBP e seu ligante.
 Problema  especialmente ao estudar sistemas multicelulares complexos, glicanos introduzidos podem ser cruzados por outras proteínas de ligação conhecidas ou desconhecidas, dando uma leitura fenotípica confusa.
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Eliminando Estruturas de Glicano Específicas por Glicosidases
Vantagem  eliminando certas estruturas seletivamente após a síntese normal ter sido concluída, em vez de interferir com a maquinaria biossintética celular.
Em todos esses estudos, a pureza da enzima usada é crítica e controles apropriados são necessários.
Se a enzima for de origem bacteriana, vestígios de contaminantes como a endotoxina também são motivo de preocupação. 
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A eliminação de um receptor de glicano específico pode produzir um fenótipo que pode ser muito instrutivo no que diz respeito às funções do glicano. 
Tal como acontece com a modificação genética, os resultados são mais prováveis de serem úteis se estudados no organismo como um todo. 
No entanto, a proteína receptora pode ter outras funções não relacionadas ao reconhecimento de glicano. 
Glicano em questão pode ter outras funções não mediadas pelo receptor. Por exemplo, o nocaute do receptor CD22 / Siglec-2 e da enzima ST6Gal-I que gera seu ligante, ocasionou fenótipos complementares, mas não idênticos.
 No entanto, cruzar as duas mutações no mesmo camundongo indicou que havia de fato interações epistáticas. Resultados semelhantes foram obtidos por meio do acasalamento de camundongos deficientes na produção de ácido polissiálico e na síntese da proteína transportadora de ácidos polissiálicos, NCAM
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