MÉTODOS ALTERNATIVOS NA ENUMERAÇÃO DE MICRORGANISMOS

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Avaliação Contínua Sobre Métodos Alternativos | Hilthon Alves Ramos 
 
 
AVALIAÇÃO CONTÍNUA SOBRE MÉTODOS ALTERNATIVOS | 
DISCIPLINA: CONTROLE BIOLÓGICO DA QUALIDADE DE MEDICAMENTOS 
PROFESSORA: NATHÁLIA CARTAXO 
ALUNO(A): HILTHON ALVES RAMOS 
 
 
AVALIAÇÃO CONTÍNUA SOBRE MÉTODOS ALTERNATIVOS 
 
1) O que são métodos alternativos para enumeração de microrganismos? 
 
Eles são métodos microbiológicos usados para detectar a presença de 
microrganismos em amostras, tais como: esterilidade e falta de microrganismos 
específicos; usados para listar microrganismos em amostras de teste; crescimento 
baseado em UFC; e caracterização microbiana e coloração com base na 
morfologia e identificação de coloração. 
 
2) Qual é a importância de validar métodos alternativos? Cite os parâmetros 
que devem ser aplicados, baseado no PDA e resolução 899. 
 
A validação é muito importante, pois a variabilidade associada aos resultados 
é grande, por se tratarem de testes microbiológicos, nos quais é possível avaliar os 
tipos de microrganismos, distribuição das amostras, morfologia celular microbiana, 
metabolismo e todos os demais aspectos. Isso pode interferir nos resultados. Esses 
parâmetros são exatidão, precisão, especificidade, limite de quantificação, limite de 
detecção, linearidade, faixa, robustez e equivalência. 
 
3) Quais as desvantagens dos métodos clássicos? 
 
A desvantagem clássica é a perda de tempo e a eficiência do processo de fabricação, 
incubar por alguns dias causará perda e contaminação do produto. Eles podem não ser capazes 
de recuperar todos os microorganismos e podem liberar produtos contaminados. 
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4) Quais são as principais tecnologias aplicáveis para a enumeração de 
microrganismos como métodos alternativos? 
 
As tecnologias aplicáveis para a enumeração de métodos alternativos são: 
eletroquímicos, bioluminescência, epifluorescência, citometria. 
 
5) Explique o princípio da técnica de citometria, fluxo e fase sólida. 
 
O citômetro de fluxo mede as propriedades de dispersão da luz pelas células 
e emissão de luz de anticorpos monoclonais que estão associados a fluorocromos 
ligados à superfície da célula. Permite diferenciar os microrganismos viáveis de 
partículas não viáveis. É menos sensível que a citometria de fase sólida, mas a 
citometria de fluxo permite a análise de materiais filtráveis e não filtráveis, podendo 
durar até 90 minutos de análise. A sensibilidade pode ser melhorada ao se adicionar 
uma etapa de incubação em meio de cultura, para que assim consiga visualizar 
melhor os resultados ao adicionar a amostra a um citômetro de fluxo. 
Já o citômetro de fase sólida é uma associação baseada em princípios da 
epifluorescência junto a citometria de fluxo, onde será o método mais sensível, sendo 
capaz de detectar apenas uma célula por filtro, baseando-se em 4 etapas: Irá utilizar 
uma membrana filtrante para reter os microrganismos contaminantes. Identificação 
que será feita com um fluoróforo. Antes ou após a filtração. Inicialmente, é um 
substrato conjugado não fluorogênico - requer atividade para exercer fluorescência. 
Excitação que é realizada por laser e varredura automatizada. Permitindo a 
detecção de microrganismos viáveis e por fim Software que irá identificar a 
diferenciação de microrganismos viáveis e partículas auto fluorescentes. 
 
6) Por que os laboratórios/indústria gostam de utilizar o MALDI-TOF? 
 
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O MALDI-TOF é uma técnica de espectrometria de massas, onde irá identificar 
transferência de culturas bacterianas aos poços da placa do instrumento, a análise 
completa da célula bacteriana, fornecendo um único espectro de massa intrínseco 
ao microrganismo a partir de macromoléculas. A característica de não necessitar a 
preparação da amostra, análise rápida e alto comprometimento tecnológico torna 
este um método que chama atenção para a identificação rápida, podendo ser 
aplicável a bactérias e fungos. 
 
7) Quais as tecnologias aplicadas para verificar o crescimento, a viabilidade, 
componentes celulares e ácidos nucléicos (explique do jeito que está na 
conclusão dos slides). 
 
A tecnologia aplicada para verificar o crescimento é a bioluminescência do 
A TP que irá avaliar os parâmetros bioquímicos ou fisiológicos que irão refletir no 
crescimento dos microrganismos. A tecnologias baseadas em viabilidade são: 
citometria de fluxo por coloração vital ou fluorescência, microscopia direta de filtro 
epifluorescente. Com isso irá verificar a viabilidade das células através da coloração 
vital de componentes bioquímicos das células microbianas, como também a 
fluorescência da clivagem enzimática de substratos fluorogênicos das paredes 
celulares. 
Nas tecnologias de componentes celulares ou artefatos, mede-se os 
componentes celulares, classificando como uma boa tecnologia aplicada para isso 
o MALDI-TOF , aglutinação de látex e coloração de gram. Por fim, nas tecnologias 
aplicadas para os ácidos nucléicos, o padrão será o PCR para identificar as espécies 
microbianas. 
 
8) Escolha uma tecnologia e explique sobre a mesma, com exceção da 
citometria. 
 
A tecnologia aplicável para enumeração, através de método alternativo 
bioluminescência é um processo que consiste em extrair A TP e adicionar o reagente 
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luciferina ou luciferase e medir a luz gerada por um luminômetro. O equipamento 
que faz a quantificação é o MicroStar . Quando o luminômetro entra em contato 
com a amostra, haverá uma reação que emitirá luz relativa, gerando uma reação 
química/enzimática, então essa luz relativa será diretamente proporcional a 
quantidade de A TP presente na amostra. O A TP é um marcador para viabilidade 
celular , havendo alguns fatores que irão limitar , impedindo a sensibilidade do 
método como por exemplo: reagentes utilizados e a quantidade de microrganismos 
presentes, principalmente quando a amostra estiver muito contaminada. Essa 
técnica é um método rápido e alternativo, pelo fato de que irá reduzir o tempo da 
análise, relacionando ao método clássico. As limitações encontradas neste método 
de bioluminescência são: a velocidade da reação, o volume da amostra, a 
concentração de reagentes, a turbidez e cor da amostra e também o controle da 
temperatura.