Monografia (publicação autorizada)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO 
FACULDADE DE FARMÁCIA 
 
 
 
 
MARCELA MELLO AVELLAR 
 
 
 
 
 
ANÁLISE DO ENVOLVIMENTO DO GENE vc0489, MEMBRO PUTATIVO DO 
REGULON PHO, NA SÍNTESE DE LIPÍDIOS CONTENDO ORNITINA 
EM Vibrio cholerae 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RIO DE JANEIRO 
2021 
 
 
MARCELA MELLO AVELLAR 
 
 
 
 
 
ANÁLISE DO ENVOLVIMENTO DO GENE vc0489, MEMBRO PUTATIVO DO 
REGULON PHO, NA SÍNTESE DE LIPÍDIOS CONTENDO ORNITINA 
EM Vibrio cholerae 
 
 
 
 
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à 
Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do 
Rio de Janeiro, como parte dos requisitos 
necessários à obtenção do grau de bacharel em 
Farmácia. 
 
Orientador (a): Wanda Maria Almeida von Krüger 
Coorientador (a): Carolina Lage Goulart 
 
 
 
 
RIO DE JANEIRO 
2021 
 
 
FICHA CATALOGRÁFICA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMENTOS 
A minha família, em especial à minha querida mãe, Luci, sempre disposta a me dar toda 
ajuda possível. Obrigada por ser a melhor mãe que eu poderia ter e se esforçar para que os anos de 
graduação e tudo que eu queria fazer fossem possíveis. Eu te amo! Ao meu padrasto, Geferson, por 
toda preocupação e dedicação, sempre disposto a ajudar e por todas as caronas de volta da 
faculdade, tarde da noite. À minha amada avó, Delma, que sempre se dedicou a amar, cuidar e 
educar seu netos. Te amo! E não poderia deixar de agradecer às minhas tias, Luciana, Lucia e Leila 
(que Deus a tenha em ótimo lugar), por toda a ajuda, carinho e confiança em mim depositadas. 
Família, sem vocês nada seria possível. 
Ao meu namorado, Thiago, pelo companheirismo e momentos felizes. Você é muito 
importante pra mim. Te amo. 
As minhas orientadoras, Dra. Wanda Maria Almeida von Krüger e Dra. Carolina Lage 
Goulart, por todos os ensinamentos passados, toda ajuda durante esses anos, tanto aprendizado, e 
crescimento pessoal e profissional! Wanda esclarecendo minhas dúvidas sempre que necessário e 
Carol sempre ao meu lado na bancada, me orientando e mesmo estando longe por um período, sou 
muito grata por toda dedicação à minha orientação. Obrigada por toda a paciência e compreensão. 
Vocês são, sem dúvidas, meus exemplos profissionais e referência! 
Ao Dr. Paulo Mascarello Bisch, por todo apoio e oportunidade de fazer parte da Física 
Biológica do IBCCF. 
A todos os membros que pertencem ou pertenceram ao Laboratório de Física Biológica: 
Livia, Camacho, Profª Bia, Matheus, Polyana, Lili, Leandro, Cristóvão, e outros queridos por 
compartilhar tantos ensinamentos e momentos de descontração. Em especial à Dra. Livia, sempre 
disposta a complementar minha orientação e aprendizado. 
As grandes amizades que tive a oportunidade de construir na graduação. Obrigada por 
compartilharem comigo alegrias, tristezas, cafés e ônibus lotados. Todos vocês foram 
fundamentais! Inclusive para achar as salas e as saídas do subsolo do CCS. 
 
 
 
 
 
EPÍGRAFE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Não importa o que aconteça, continue a nadar.” 
(Walters, G.; Procurando Nemo, 2003) 
 
 
 
RESUMO 
AVELLAR, Marcela Mello. Análise do envolvimento do gene vc0489, membro putativo do 
regulon Pho, na síntese de lipídios contendo ornitina em Vibrio cholerae. Rio de Janeiro, 2021. 
Trabalho de conclusão de curso (graduação), Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio 
de Janeiro, 2021. 
 
A bactéria Vibrio cholerae, o agente etiológico da cólera, pode ser transmitida ao homem por 
ingestão de água ou alimentos contaminados. Ao colonizar o intestino delgado, ela secreta a toxina 
da cólera levando à perda de eletrólitos para o lúmen intestinal, causando diarreia intensa, vômitos 
e até morte por desidratação profunda. Outros fatores importantes à patogenicidade da bactéria são 
produtos de genes expressos sob limitação de fosfato inorgânico (Pi). O fósforo é essencial para os 
organismos e o Pi é a forma de fósforo solúvel mais utilizada pelas bactérias. Sob limitação de Pi, 
V. cholerae e outras espécies expressam um conjunto de genes (regulon Pho) regulados pelo 
sistema PhoB/PhoR. Trabalhos do nosso grupo mostraram que sob limitação de Pi, os fosfolípidos 
da membrana de V. cholerae são, parcialmente, substituídos por lipídios contendo ornitina (LOs), 
que não possuem Pi. Em algumas bactérias, a síntese de um LO é catalisada pelas aciltranferases 
OlsB e OlsA, que adicionam, respectivamente, a primeira e a segunda cadeias acila à molécula de 
ornitina. Mas em espécies como a Serratia proteamaculans, essa síntese é dependente da 
aciltransferase bifuncional OlsF, que catalisa as duas etapas de acilação da ornitina. Uma busca no 
genoma da cepa El tor N16961 de Vibrio cholerae levou a identificação do gene vc0489 como um 
homólogo de olsF. Como o mecanismo de síntese de LOs em V. cholerae é desconhecido, o 
objetivo foi verificar o envolvimento do gene vc0489 na síntese de LOs, sob limitação de Pi, 
expressando-o em Escherichia coli cepa DH5α que não sintetiza LOs sob nenhuma condição. Para 
isso, um fragmento contendo o gene vc0489 e sua região reguladora foi clonado no plasmídeo 
pGEM-T Easy gerando o plasmídeo recombinante pGEM.vc0489, utilizado para transformar 
células eletrocompetentes de DH5α. As células de DH5α.pGEM.vc0489 foram cultivadas em meio 
definido sob limitação (MGLP) e abundância (MGHP) de Pi. A análise de proteínas celulares e de 
lipídios totais, detectou nas células da DH5α.pGEM.vc0489 cultivadas em MGLP, uma proteína 
identificada por espectrometria de massas como uma “hemolisina” VC0489, da família das 
acetiltransferases de V. cholerae e um novo lipídio contendo ornitina, sugerindo o envolvimento 
da proteína VC0489 na síntese do LO. Alinhamento das sequências de VC0489 de V. cholerae com 
 
 
as de outras enzimas envolvidas na síntese de LOs em bactérias, constatou que VC0489 tem alta 
identidade e similaridade com a OlsF de Serratia proteamaculans, caracterizada como uma 
aciltransferase bifuncional. Além disto, mostrou que ambas apresentam atividades N-
aciltransferase no domínio C-terminal e O-aciltransferase no N-terminal. A correlação entre a 
síntese de LOs e a expressão de vc0489 em V. cholerae, em resposta à privação de Pi e de maneira 
dependente do sistema PhoB/PhoR, foi comprovada em um ensaio de retardo de mobilidade 
eletroforética, indicando regulação direta da expressão do gene pelo sistema PhoB/PhoR de V. 
cholerae. Portanto, os dados deste trabalho indicam que vc0489 codifica uma proteína homóloga a 
OlsF e que deve ser um novo membro do regulon Pho da bactéria. 
 
Palavras-chave: Vibrio cholerae, regulon Pho, sistema PhoB/PhoR, lipídios de ornitina, fosfato 
inorgânico, proteínas, patogenicidade. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 
 
Amp Ampicilina 
AMP Monofosfato de adenosina 
ATP Trifosfato de adenosina 
BlastP Basic Local Alignment Search Tool Protein 
bp (base pair), Par de base 
CL (Cardiolipin), Cardiolipina 
CT (Cholera toxin), Toxina colérica 
CVEC (Conditionally viable environmental cells), Células ambientais 
 condicionalmente viáveis 
DTT Ditiotreitol 
EDTA Ácido etilenodiamina tetracético 
EMSA (Electrophoretic mobility shift assay), Ensaio de retardo de 
 mobilidade eletroforética 
ESI (Electrospray ionization), Ionização por eletropulverização 
HK (Histidine kinase), Histidina quinase 
HP (High [phosphate]), Alta [fosfato] 
kb quilobase 
kDa quiloDalton 
kV quilovolt 
LB (Lysogeny broth), Meio de cultura nutricionalmente rico 
LO Lipídio contendo ornitina 
LOL Lipídio-l-ornitina 
LP (Low [phosphate]), Baixa [fosfato] 
LPS Lipopolissacarídeo 
MG MOPS glicose, Meio definido 
MGHP (MOPS glucose high [phosphate]), Meio definido MG com alta [fosfato] 
MGLP (MOPS glucose low [phosphate]), Meio definido MG com baixa[fosfato] 
MOPS (3-[N-morpholino] propanesulfonic acid), Ácido 3-[N-morfolino] propano 
 sulfônico 
 
 
MS/MS (Tandem mass spectrometry), Espectrometria de massas em sequência 
MW (Molecular weight), Massa molar 
NCBI National Center for Biotechnology Information 
OCV (Oral cholerae vaccine), Vacina oral contra a cólera 
OD / DO (Optical density), Densidade óptica 
PAGE (Polyacrylamide gel electrophoresis), Eletroforese em gel de poliacrilamida 
PBS (Phosphate-buffered saline), Solução salina tamponada 
PCR (Polymerase chain reaction), Reação em cadeia da polimerase 
PDB Protein Data Bank 
PE (Phosphatidyl ethanol amine), Fosfatidiletanolamina 
PG (Phosphatidyl glycerol), Fosfatidilglicerol 
Pi Fosfato inorgânico 
PykF (Pyruvate kinase F), Piruvato cinase 
Q Quadrupolo 
Rc Domínio receptor 
Rg Domínio regulador 
rpm Rotações por minuto 
RR Proteína reguladora da resposta 
RT-qPCR (Real-time quantitative polymerase chain reaction), PCR quantitativo 
 em tempo real 
SDC Sistema de dois componentes 
SDS (Sodium dodecyl sulfate), Dodecil sulfato de sódio 
SOB (Super optimal broth), Meio de cultura rico 
SR Estreptomicina 
TAE Tris-acetato-EDTA, Tampão de eletroforese 
TCP Pilus co-regulado com a toxina 
TLC (Thin-layer chromatography), Cromatografia em camada fina 
VBNC (Viable but not cultivable), Viável mas não cultivável 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
1 INTRODUÇÃO …………………………………………………………………………….....11 
1.1 A cólera e o Vibrio cholerae ............................................................................................... 11 
1.2 Sistema de dois componentes PhoB/PhoR: resposta aos níveis de fosfato inorgânico (Pi) 
no meio extracelular ...................................................................................................................... 14 
1.3 Lipídio contendo ornitina (LO) ........................................................................................... 17 
2 OBJETIVOS ............................................................................................................................. 20 
2.1 Objetivo geral ..................................................................................................................... 20 
2.2 Objetivos específicos .......................................................................................................... 20 
3 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................................... 21 
3.1 Cepas bacterianas e plasmídeos, meio de cultura, condições de cultivo ............................ 21 
3.2 Métodos genéticos .............................................................................................................. 22 
3.2.1 Preparação de DNA cromossomal e plasmidial e análise por eletroforese ................. 22 
3.2.2 Reações de amplificação por PCR, digestão e ligação de DNA ................................. 23 
3.2.3 Células competentes e transformação ......................................................................... 24 
3.3 Análise e identificação de proteínas ................................................................................... 25 
3.3.1 Extração de proteínas (lisado total) ............................................................................. 25 
3.3.2 Análise eletroforéticas de proteínas (SDS-PAGE) ..................................................... 26 
3.3.3 Identificação de proteínas de interesse por espectrometria de massas ........................ 26 
3.4 Análise e identificação do perfil lipídico ............................................................................ 27 
3.4.1 Extração de lipídios ..................................................................................................... 27 
3.4.2 Análise de lipídios por cromatografia em camada fina (TLC) ................................... 28 
3.5. Análises de similaridade entre proteínas ........................................................................... 28 
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................. 29 
4.1 Construção de um plasmídeo carreando o gene vc0489 e sua região reguladora ............... 29 
 
 
4.2 Perfis proteicos das cepas DH5α e DH5α.pGEM.vc0489 de E. coli cultivadas sob 
limitação e abundância de Pi ......................................................................................................... 32 
4.3 Perfis lipídicos das cepas DH5α e DH5α.pGEM.vc0489 de E. coli cultivadas sob limitação 
e abundância de Pi ......................................................................................................................... 35 
4.4 Caracterização funcional de VC0489 por bioinformática .................................................. 36 
4.5 Cinética de crescimento das cepas DH5α e DH5α.pGEM.vc0489 de E. coli sob limitação e 
abundância de Pi ............................................................................................................................ 41 
4.6 Envolvimento do sistema PhoB/PhoR na expressão de vc0489 e na síntese de LOs em V. 
cholerae ......................................................................................................................................... 42 
5 CONCLUSÕES ......................................................................................................................... 44 
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................... 45 
ANEXO ......................................................................................................................................... 54 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 11 
1 INTRODUÇÃO 
1.1 A cólera e o Vibrio cholerae 
 
A cólera é uma doença infecciosa aguda causada por algumas cepas de Vibrio cholerae que 
colonizam o trato intestinal do hospedeiro após ingestão de água ou alimentos contaminados com 
a bactéria. As manifestações clínicas variam desde infecções assintomáticas até casos graves com 
diarreia profusa e consequente perda de grandes quantidades de água e eletrólitos, o que pode levar 
à acidose, desidratação rápida e colapso circulatório (BARUA, 1992; SACK e cols., 2004). 
Portanto, se não tratados prontamente, os infectados podem ir a óbito em poucas horas após o 
aparecimento dos sintomas. 
A bactéria V. cholerae (Fig. 1) é um bacilo Gram-negativo com flagelo polar único, 
anaeróbio facultativo, que foi primeiramente identificada por Filippo Pacini, em Florença, Itália, 
em 1854, durante uma epidemia de cólera na cidade (HOWARD-JONES, 1984; BENTIVOGLIO 
e PACINI, 1995). 
 
Figura 1 - Micrografia de Vibrio cholerae. Bactéria em forma de vírgula. 
(http://www.fiocruz.br/ccs/estética/colera.htm) 
 
Grande parte das cepas de V. cholerae não é patogênica ao homem. Entre os mais de 200 
sorogrupos, identificados com base em diferenças na estrutura do antígeno O do lipopolissacarídeo 
(LPS), apenas O1 e O139 são associados a epidemias de cólera (CHATTERJEE e CHAUDHURI, 
2003). As cepas do sorogrupo O1 são classificadas em dois biotipos: clássico e El Tor. Essa 
classificação é baseada em diferenças fenotípicas tais como susceptibilidade a certos bacteriófagos, 
 12 
 
 
sensibilidade à polimixina B, capacidade de aglutinar sangue de galinha e produção de acetoína 
como produto da fermentação de glicerol (teste de Voges–Proskauer) (CHATTERJEE E 
CHAUDHURI, 2003). A cepas do sorogrupo O1, dos biotipos El Tor e clássico, ainda podem ser 
subdivididas em três sorotipos diferentes, denominados Ogawa, Inaba e Hikojima, dependendo de 
pequenas alterações na estrutura do antígeno O do LPS (FINKELSTEIN, 1996). 
Os reservatórios naturais de V. cholerae são ambientes aquáticos, como águas superficiais 
doces ou salobras, na quala bactéria sobrevive livremente, em microcôlonias ou em biofilmes 
associados à zooplânctons e fitoplânctons ou a superfícies abióticas (Fig. 2) (KIRSCHNER e cols., 
2011; ALMAGRO-MORENO e TAYLOR, 2013). O trato intestinal de pacientes de cólera também 
funciona como reservatório de células virulentas de V. cholerae, que são liberadas em 
microcolônias no ambiente através das fezes, facilitando o aparecimento de epidemias (Fig. 2) 
(FARUQUE e cols., 2006; ALMAGRO-MORENO e cols., 2015). A transmissão da bactéria 
ocorre, primariamente, pela ingestão de água contaminada com fezes ou vômitos de pacientes de 
cólera ou pelas fezes de portadores assintomáticos ou ainda pela ingestão de alimentos 
contaminados (Fig. 2) (MINISTÉRIO DA SAÚDE - BRASIL, 2010). 
 
 
 13 
 
 
 
 
Figura 2 - Ciclo de vida e interações do V. cholerae, em que vários estados fisiológicos e interações com 
habitantes naturais de águas salobras ribeirinhas, estuarinas e costeiras podem ser observados. V. cholerae 
pode ser encontrada na água na forma de vida livre cultivável ou em estado VBNC (viável mas não 
cultivável), tal como a CVEC (células ambientais condicionalmente viáveis), em biofilmes em diversas 
superfícies e em microcolônias de células patogênicas liberadas nas fezes de pacientes com cólera. V. 
cholerae é sujeito a vários predadores naturais que desempenham um papel crucial na dinâmica das 
epidemias de cólera, tais como bacteriófagos e protozoários. Além disso, algumas espécies de bactérias têm 
interações antagônicas com V. cholerae, impedindo seu crescimento em superfícies sólidas. Adaptado de 
ALMAGRO-MORENO e TAYLOR, 2013. 
 
Os bacilos de cepas patogênicas de V. cholerae, ingeridos pelo hospedeiro humano que 
conseguem escapar da acidez gástrica – a primeira linha de defesa do hospedeiro contra a bactéria 
– chegam ao intestino delgado. Ali, devem atingir o epitélio intestinal penetrando pela camada 
viscosa de muco que o reveste e, uma vez lá, se ligam ao epitélio através de adesinas específicas, 
se multiplicam e iniciam a produção do “pilus co-regulado com a toxina” (TCP), permitindo a 
formação de microcolônias e produção da toxina colérica (CT) (ALMAGRO-MORENO e cols., 
2015). Essa toxina tipo AB5 se liga à membrana plasmática apical das células do intestino delgado 
 14 
 
a partir de receptores gangliosídicos GM1 pela subunidade B, enquanto a subunidade A é 
conduzida para o interior da célula, levando à ativação de adenilato ciclase, uma enzima localizada 
na membrana baso-lateral de células epiteliais. Essa enzima, quando ativada, eleva os níveis 
celulares de AMP cíclico e a secreção de íons cloreto, causando uma ruptura no equilíbrio 
fisiológico e fazendo com que seja secretada grande quantidade de líquido, resultando em uma 
diarreia aquosa intensa (SACK e cols., 2004). 
Segundo boletim epidemiológico divulgado pela Organização Mundial de Saúde (WORLD 
HEALTH ORGANIZATION, 2019), a cólera é um importante problema de saúde pública, muitas 
vezes negligenciada, sendo endêmica no sul da Ásia e partes da África e América Latina (epidemias 
recentes no Moçambique e Haiti). Estima-se que a cada ano ocorram cerca de 2,86 milhões de 
casos e 95.000 mortes e há uma população em risco de cerca de 1,3 bilhões em 69 países endêmicos 
(ALI e cols., 2015). 
Medidas de prevenção e controle da cólera consistem principalmente em fornecer água 
potável e saneamento adequado às populações, bem como vacinas. Três vacinas orais 
desenvolvidas contra a cólera (OCV) são reconhecidas pela Organização Mundial da Saúde, e vêm 
sendo utilizadas para controlar a doença em países endêmicos, bem como contra surtos e 
emergências (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2019; PEZZOLI e cols, 2020). No entanto, 
as OCVs não são recomendadas para crianças menores de 1-2 anos, gestantes e idosos, e além de 
não protegerem 100% dos vacinados, oferecem proteção por período limitado. Outrossim, a 
educação em saúde e boa higiene alimentar são essenciais. Isso inclui a necessidade de sempre 
lavar as mãos com sabão após a defecação e antes de manusear alimentos ou comer, além de 
preparar e conservar os alimentos com segurança. Sistemas de vigilância e alerta precoce também 
são essenciais para a detecção dos primeiros casos de cólera e para rápida implementação de 
medidas de controle para evitar surtos da doença (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2019). 
1.2 Sistema de dois componentes PhoB/PhoR: resposta aos níveis de fosfato inorgânico (Pi) 
no meio extracelular 
 
A regulação diferencial da expressão gênica permite adaptação e sobrevivência das espécies 
bacterianas em diversos ambientes. Durante o seu ciclo de vida, V. cholerae passa por ambientes 
 15 
 
distintos onde interage com habitantes naturais diversos (Fig. 2) e, para sobreviver, ela tem que se 
adaptar às condições do meio. 
Ambientes aquáticos e terrestres são geralmente deficientes em fósforo, um componente da 
nutrição bacteriana que faz parte da estrutura de macromoléculas importantes à vida, tais como 
ácidos nucléicos, fosfolipídeos e lipopolissacarídeos (NELSON e cols., 2008). A assimilação de 
componentes fosforilados do meio garante o suprimento do fósforo necessário ao metabolismo 
bacteriano e se dá em duas etapas: o transporte desses componentes para dentro da célula e a 
incorporação do fósforo na molécula de ATP (WANNER, 1993). A fonte de fósforo solúvel mais 
utilizada por bactérias é o fosfato inorgânico (Pi) ou ânion ortofosfato (PO4³
-) (WANNER, 1993) 
e a sobrevivência das espécies bacterianas, incluindo V. cholerae, está diretamente relacionada a 
maneira como a bactéria responde à disponibilidade desse ânion (MONDS e cols., 2001). 
Geralmente é através de sistemas de transdução de sinal de dois componentes (SDC) que 
as bactérias respondem às alterações ambientais (Fig. 3). O primeiro componente de um SDC 
característico é uma proteína sensora (S) transmembranar, sendo seu domínio extracitoplasmático 
sensor (S) do estímulo externo, e o domínio citoplasmático, transmissor (T), com atividade 
histidina quinase (HK). O outro componente é uma proteína citoplasmática reguladora da resposta 
(RR), com domínio amino-terminal receptor (Rc) e o domínio carboxi-terminal, regulador (Rg), 
que, em geral, se liga ao DNA para regular a expressão de certos genes (GROSS e cols., 1989). 
Após sentir um estímulo, a atividade histidina quinase de S catalisa a autofosforilação em um 
resíduo de histidina conservado (H) no domínio T citoplasmático. Esse grupo fosforila é 
transferido, em seguida, para um resíduo de aspartato (D) conservado, no domínio Rc da proteína 
RR cognata. A fosforilação de RR, causa alteração conformacional da proteína, que se torna ativa 
e através do seu domínio Rg interage com sequências específicas a montante de certos genes, em 
geral, ativando sua transcrição (GAO e STOCK, 2009). 
Em resposta a baixos níveis de Pi no ambiente, V. cholerae e outras espécies bacterianas 
expressam um conjunto de genes (regulon Pho), de forma dependente do SDC formado por PhoB 
(S) e PhoR (RR), cujos produtos estão envolvidos na captação e metabolismo de compostos 
fosforilados, e em vários outros processos, incluindo virulência (WANNER, 1993; 
VANBOGELEN e cols., 1996; WANNER, 1996; VON KRÜGER e cols., 1999; PRÁGAI e cols., 
2004; VON KRÜGER e cols., 2006). Nesta condição (< 4µM no caso de Escherichia coli), PhoR 
é fosforilada promovendo a fosforilação de PhoB, que funciona como um regulador transcricional 
 16 
 
(Fig. 3) (LAMARCHE e cols., 2008). PhoB fosforilada (PhoB~P) forma um dímero que se liga a 
regiões específicas do genoma, denominadas caixas Pho, localizadas na região reguladora dos 
genes que compõem o regulon Pho (WANNER, 1993; MAKINO e cols., 1996; DINIZ e cols., 
2011). Em V. cholerae, e bactérias de outras espécies, PhoB também regula a expressão de genes 
que desempenham papéis importantes em processos tais como patogenicidade, formaçãode 
biofilme, motilidade e resistência a estresses diversos (SUZIEDEKIENE e cols., 1999; VON 
KRÜGER e cols., 1999; OSORIO e cols., 2004; YUAN e cols., 2005; VON KRÜGER e cols., 
2006; LAMARCHE e cols., 2008; PRATT e cols., 2009; SULTAN e cols., 2009; GOULART e 
cols., 2010; PRATT e cols., 2010; CREPIN e cols., 2011; LERY e cols., 2013; CHEKALAB e 
cols., 2014). 
 
Figura 3 - Regulação da resposta à limitação de Pi em E. coli. Quando há excesso de Pi (> 4µM) ocorre a 
saturação do sistema de transporte de fosfato Pst e a consequente inibição de PhoR por PhoU. Já sob 
limitação de Pi (< 4µM), PhoR é ativada por auto fosforilação no resíduo de histidina (H) e transfere o grupo 
fosforila para o resíduo do ácido aspártico (D) de PhoB. PhoB~P, forma um dímero (PhoB~P)2, e se liga a 
montante dos genes do regulon Pho, nas caixas Pho (sequências bem conservadas de 18 nucleotídeos), em 
geral para ativar a transcrição. Adaptado de LAMARCHE e cols., 2008. 
 17 
 
Entre os genes do regulon Pho de V. cholerae: estão phoB e phoR, que codificam as 
proteínas do SDC PhoB/PhoR, e outros tais como, o gene vca0033, para uma fosfatase alcalina 
(PhoA), o gene vca1008, que codifica uma porina (proteína da membrana externa), importante 
para a colonização intestinal de modelos animais, e vca0906, que codifica uma proteína 
quimiotáxica, e que é expresso in vivo durante infecção em modelos animais e voluntários (VON 
KRÜGER e cols., 1999; OSORIO e cols., 2004; OSORIO e cols., 2005; VON KRÜGER e cols., 
2006; LOMBARDO e cols., 2007; GOULART e cols., 2010). Estes resultados indicam que o 
sistema PhoB/PhoR é importante para a sobrevivência de V. cholerae em ambientes aquáticos que, 
em geral, são deficientes em Pi (NELSON e cols., 2008), e no trato intestinal do hospedeiro 
colonizado pela bactéria (VON KRÜGER e cols., 2006; LOMBARDO e cols., 2007; GOULART 
e cols., 2010). 
1.3 Lipídio contendo ornitina (LO) 
 
Uma das estratégias que as bactérias usam para se adaptar rapidamente e sobreviver às 
condições ambientais desafiadoras é a alteração da composição lipídica das membranas, 
componentes-chave do envoltório celular. Os lipídios como fosfatidilglicerol (PG), 
fosfatidiletanolamina (PE) e a cardiolipina (CL) são os mais importantes constituintes das 
membranas bacterianas. Porém, já foram descritos outros tipos de lipídios, como os hopanoides, os 
sulfolipídios e lipídios contendo ornitina (LOs), que podem ser produzidos por algumas espécies 
de bactérias ou sob condições específicas (VENCES-GUZMÁN e cols., 2015). 
Os LOs parecem ser relativamente comuns em eubactérias, sendo sintetizados 
constitutivamente em algumas espécies. Em outras, no entanto, a síntese ocorre em resposta à 
limitação de Pi, de forma dependente do SDC PhoB/PhoR (GEIGER e cols., 1999; VENCES-
GUZMÁN e cols., 2015), fazendo com que parte dos fosfolipídios das membranas, sejam 
substituidos por LOs para otimizar o uso de Pi pelas bactérias (WEISSENMAYER e cols., 2002; 
ZAVALETA-PASTOR e cols., 2010; LEWENZA e cols., 2011; DIERCKS e cols., 2015). 
Os LOs contêm dois grupos acila derivados de ácidos graxos ligados a ornitina, um 
diretamente ao grupo α-amino e o outro na posição 3-hidroxi do primeiro grupo acila (Fig. 4). Em 
alguns casos, essa estrutura básica de LOs pode ser modificada por hidroxilação em diferentes 
posições e por N-metilação. A presença de LOs e/ou dos LOs modificados nas membranas 
 18 
 
bacterianas, normalmente, é parte das respostas aos estresses provocados por alterações das 
condições ambientais (SOHLENKAMP, 2019). 
A síntese de um LO pode ocorrer por duas vias: (i) catalisada pelas aciltranferases OlsB e 
OlsA, que adicionam, respectivamente, a primeira e a segunda cadeias acila à molécula de ornitina; 
(ii) catalisada pela OlsF, uma aciltranferase bifuncional responsável pelas duas etapas de acilação 
da ornitina. 
A proteína OlsA pertence ao grupo das O–aciltransferases, enquanto a OlsB pertence à 
superfamília das acil-CoA N-aciltransferases. OlsB catalisa a primeira etapa da síntese de um LO, 
na qual ornitina é N-acilada com um resíduo 3-hidroxi-acil-AcpP (acyl carrier protein), gerando o 
lipídio-l-ornitina (LOL). Na segunda etapa da síntese, o LOL é convertido em LO pela ação da 
OlsA, que requer um acil-AcpP como doador do segundo grupo acila (WEISSENMAYER e cols., 
2002; GAO e cols., 2004; VENCES-GUZMÁN e cols., 2015) (Fig. 4A). A maioria das espécies 
bacterianas que sintetizam LOs contêm genes olsA e olsB, para as aciltransferases OlsA e OlsB 
(VENCES-GUZMÁN e cols., 2015). 
Em outras espécies, como a Serratia proteamaculans, a síntese de LOs é dependente de 
OlsF, uma aciltransferase bifuncional que catalisa as duas etapas da síntese (Fig. 4B) (VENCES-
GUZMÁN e cols., 2015). 
 
 
Figura 4 – Biossíntese de lipídios contendo ornitina (LOs) em bactérias. Em (A) as enzimas OlsB e OlsA. 
As enzimas OlsB e OlsA catalisam a adição de duas caudas de grupos acila à molécula de ornitina, sendo a 
primeira cauda adicionada por OlsB e a segunda por OlsA. Em (B) a aciltransferase bifuncional, OlsF 
catalisa a adição das duas caudas de grupos acila à molécula de ornitina. Acp: acyl-carrier-protein. 
Adaptado de GAO e cols., 2004. 
 
 19 
 
Estima-se que cerca de 50% das espécies bacterianas sequenciadas sejam capazes de formar 
LOs, pelo menos sob certas condições de crescimento, via OlsAB ou OlsF. Há evidências de que 
a produção de LOs é importante para adaptação e sobrevivência de bactérias em ambientes 
deficientes em fósforo. 
Em trabalho recente, (KIM e cols., 2018) foi demonstrado que a limitação de Pi causa 
aumento no nível de LOs nas membranas das células de Pseudomonas aeruginosa, alterando a 
carga de superfície e a hidrofobicidade, induzindo formação de biofilmes e tornando a bactéria 
mais resistente a agentes antimicrobianos. Os autores mostraram também que LOs reduzem a 
virulência da bactéria, interferem com a ligação de macrófagos às células bacterianas, aumentando 
assim a persistência da bactéria no hospedeiro e o desenvolvimento de infecções crônicas. 
V. cholerae não possui os genes olsB e olsA, porém um gene homólogo de olsF, o vc0489, 
foi encontrado no genoma da cepa El Tor, sorogrupo O1, N16961 (VENCES-GUZMÁN e cols., 
2015). Considerando a importância dos LOs para adaptação e sobrevivência de bactérias à 
ambientes diversos e que muito pouco se sabe sobre sua síntese e funções em V. cholerae, neste 
trabalho testamos o efeito de privação de Pi na composição lipídica da bactéria e o possível 
envolvimento do produto de vc0489 na síntese de LO, nessa condição. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 20 
 
2 OBJETIVOS 
2.1 Objetivo geral 
Analisar o envolvimento do gene vc0489 da cepa N16961 de V. cholerae na síntese de 
lipídios contendo ornitina (LOs), sob limitação de fosfato inorgânico. 
 
2.2 Objetivos específicos 
2.2.1 Analisar a expressão do gene vc0489 de V. cholerae na cepa DH5α de E. coli sob abundância 
e limitação de fosfato e verificar sua dependência dos níveis de Pi extracelular. 
 
2.2.2 Analisar o envolvimento de VC0489 na síntese de lipídios de ornitina (LOs) e sua 
dependência das concentrações extracelulares de Pi. 
 
2.2.3 Analisar a similaridade de sequências entre a VC0489 de V. cholerae e outras enzimas 
envolvidas na síntese de LOs em bactérias. 
 
2.2.4 Verificar se os LOs nas membranas da cepa DH5α de E. coli influenciam o crescimento sob 
abundância ou limitação de PI. 
 
2.2.5 Verificar se a expressão de vc0489 de V. cholerae depende diretamente do sistema 
PhoB/PhoR da bactéria. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 21 
 
3 MATERIAL E MÉTODOS 
3.1 Cepas bacterianas e plasmídeos, meio de cultura, condições de cultivo 
A cepas de V. cholerae e E. coli e os plasmídeos usados neste trabalho estão descritos na 
Tabela 1. 
Os meios de cultura utilizados para cultivo das células foram LB (Lysogeny broth; bacto-
triptona 1%; extratode levedura 0,5%; NaCl 1%) (SAMBROOK e cols., 1989) e LB-ágar 1,5%. O 
meio de cultura SOB (bacto-triptona 2%, extrato de levedura 0,5%, NaCl 0,05%, MgCl2 10 mM, 
pH 7,0) foi utilizado na recuperação de células após transformação por eletroporação. 
Para o cultivo em concentrações conhecidas de fosfato inorgânico (Pi) foi utilizado o meio 
definido MG (MOPS-glicose, uma mistura de sais tamponada com MOPS 165 mM pH 7,4, 
suplementada com glicose 0,04% e tiamina 0,01 M) complementado com KH2PO4 6,5 mM ou 65 
µM para crescimento em alta (MGHP) ou baixa (MGLP) concentração de Pi, respectivamente 
(VON KRÜGER e cols., 1999). Para cultivo nesses meios, as bactérias foram pré-cultivadas em 
LB e quando as células chegaram à fase exponencial, um volume da cultura foi centrifugado e o 
sobrenadante descartado. O sedimento celular foi lavado com meio MG uma vez e então 
ressuspendido em MG. A suspensão foi usada para inocular os meios MGHP e MGLP. Aos meios, 
quando necessário, foram adicionados antibióticos nas seguintes concentrações finais: ampicilina 
(Amp) 100 µg/mL e estreptomicina (SR) 50 µg/mL. As condições de cultivo em meio líquido 
foram: 37° C com agitação constante de 200 rpm. O crescimento bacteriano foi acompanhado 
através de medidas da DO600nm no espectrofotômetro Ultrospec 3000 (Pharmacia Biotech). 
Para a construção da curva de crescimento bacteriano em MGHP e MGLP, as células foram 
cultivadas em 20 mL de cada meio com antibióticos adequados, sob agitação a 37º C. O 
crescimento foi acompanhado por leituras da DO600nm de cada cultura de 1 em 1 hora durante 8 
horas. 
 
 
 
 22 
 
 
Tabela 1 - Cepas e plasmídeos utilizados no presente trabalho 
Cepas / Plasmídeos Descrição Referência 
V. cholerae 
N16961SR 
Mutante resistente à estreptomicina (SRr) 
da cepa pandêmica N16961 
HEIDELBERG e cols., 
2000; Estoque do 
laboratório 
Escherichia coli 
DH5α 
F– φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) 
U169 recA1 endA1 hsdR17(rK
–, 
mK
+) phoA supE44 λ– thi-1 gyrA96 relA1 
RALEIGH e cols., 
1988; Estoque do 
laboratório 
pGEM-T Easy 
Vetor plasmidial de clonagem de alto 
número de cópias, carreando o gene de 
resistência a ampicilina (Ampr) 
Promega 
pGEM.vc0489 
pGEM-T Easy carreando o gene vc0489 
com sua região reguladora (2061 bp) 
Este trabalho 
Amp – ampicilina; SR – estreptomicina 
3.2 Métodos genéticos 
3.2.1 Preparação de DNA cromossomal e plasmidial e análise por eletroforese 
 
Para a extração de DNA cromossomal, as células foram cultivadas a 37° C durante a noite 
em 3 mL de LB com antibiótico(s) e coletadas por centrifugação 12.000 x g por 5 minutos em 
temperatura ambiente. O DNA bacteriano foi purificado com o Wizard Genomic DNA Purification 
Kit (Promega), de acordo com as instruções do fabricante. Para as mini-preparações plasmidiais 
foram usados o PlasmidPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare Life Sciences) ou lise alcalina adaptada, 
como descrito em seguida (SAMBROOK e cols., 1989). As bactérias foram cultivadas em 3 mL 
de LB com antibiótico(s) a 37° C durante a noite, coletadas por centrifugação 12.000 x g por 5 
minutos em temperatura ambiente e o sedimento celular foi ressuspendido em 200 µL de solução 
1 (EDTA 10 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0). Após a adição de 400 µL de solução 2 (NaOH 200 
mM, SDS 1%), a suspensão foi homogeneizada por inversão do tubo (4-6 vezes) e incubada por 5 
minutos à temperatura ambiente. Em seguida, foram adicionados 300 µL de solução 3 (acetato de 
potássio 3 M, pH 5,5), seguido de homogeneização por inversão (4-6 vezes) e incubação em gelo 
por 5 minutos. Após centrifugação a 14.000 x g por 10 minutos a 4° C, o sobrenadante foi coletado 
e o DNA foi precipitado pela adição de 0,7 volumes (630 µL) de isopropanol. Após 10 minutos de
 23 
 
incubação à temperatura ambiente, a amostra foi centrifugada a 25.000 x g por 30 minutos a 4° C. 
O sedimento foi ressuspendido em 50 µL de RNase 0,1 mg/mL e incubado por 15 minutos a 37° 
C. Foram então adicionados 450 µL de água e 500 µL de fenol:clorofórmio equilibrado em Tris-
HCl 50 mM, pH 8,0, para extração de RNA e das proteínas ainda presentes na amostra. Após 
centrifugação a 16.000 x g por 10 minutos a 4° C, a fase aquosa superior contendo o DNA 
plasmidial foi coletada e o material precipitado pela adição de 2 volumes de etanol 100% gelado e 
incubação no mínimo 30 minutos a –20° C. A amostra foi centrifugada a 25.000 x g por 30 minutos 
a 4° C, o sobrenadante foi desprezado e o sedimento lavado com 500 µL de etanol 70% gelado. 
Após nova centrifugação a 25.000 x g por 15 minutos a 4° C, o sobrenadante foi descartado e o 
sedimento, após seco a 37º C por 10 minutos, foi ressuspendido em 20 µL de água estéril. A análise 
dos DNAs cromossomais e plasmidiais foi feita por eletroforese em gel de agarose 0,8-1,0% em 
TAE 1X (Tris-base 40 mM, ácido acético 40 mM, EDTA 1 mM) (SAMBROOK e cols., 1989). 
3.2.2 Reações de amplificação por PCR, digestão e ligação de DNA 
 
As reações de amplificação de fragmentos de DNA através da reação em cadeia da 
polimerase (PCR) foram realizadas com a enzima GoTaq DNA Polimerase (Promega), de acordo 
com as instruções do fabricante. Foram utilizados o DNA cromossomal da cepa de V. cholerae 
N16961SR ou plasmídeos recombinantes contendo fragmentos de DNA, como DNA molde. Os 
oligonucleotídeos iniciadores utilizados neste trabalho (descritos em i, ii e iii) foram desenhados 
com base na sequência dos segmentos de interesse no genoma de V. cholerae N16961SR. 
(i) Para amplificar o fragmento de 2061 bp contendo o gene vc0489 (1761 bp) mais 
sua região reguladora (300 bp) foi utilizado o par de oligonucleotídeos: 
● 489proFw (5´ACCCGGGCCGTCTATTCCAGATCAGC 3´) e 
● 489expRv (5´ACCCGGGTTAGATATCGCTGAAATATTGG 3`), 
Ambos contêm à 5´ o sítio da enzima de restrição Sma I ( 5´CCCGGG 3´). O programa 
utilizado foi: 1x (94º C, 3 minutos); 34x (94ºC, 1 minuto; 55º C, 30 segundos; 72º C, 2 minutos e 
30 segundos), 1x (72º C, 5 minutos). 
(ii) Para amplificar por PCR a sequência da região reguladora do gene vc0489 (300 bp) 
foi utilizado o par de oligonucleotídeos, também contendo sítios de Sma I à 5´: 
● 489proFw (5´ACCCGGGCCGTCTATTCCAGATCAGC 3´) e
 24 
 
 
● 489proRv (5´ ACCCGGGAGCAACCTCTTATGTGATGG 3`). 
O programa do PCR foi: 1x (94º C, 3 minutos); 34x (94 ºC, 1 minuto; 55º C, 30 segundos; 
72 ºC, 30 segundos), 1x (72º C, 5 minutos). 
(iii) Para amplificar a sequência da região reguladora do gene vc0489 marcado com 
biotina (300 bp) foi utilizado o par de oligonucleotídeos: 
● 489proBiot (5´ Biotin-ACCCGGGCCGTCTATTCCAGATCAGC 3´) e 
● 489proRv (5´ ACCCGGGAGCAACCTCTTATGTGATGG 3`), 
O programa do PCR foi: 1x (94º C, 3 minutos); 34x (94º C, 1 minuto; 55º C, 30 segundos; 
72º C, 30 segundos), 1x (72º C, 5 minutos). 
Os fragmentos gerados por PCR foram analisados em gel de agarose 1% em TAE (1x) (item 
3.2.1) e purificados (GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit; GE Healthcared Life Sciences) 
antes de serem utilizados. 
As reações de digestão de DNA com enzimas de restrição foram realizadas de acordo com 
as instruções dos fabricantes. Para as reações de ligação entre fragmentos de DNA e plasmídeos 
linearizados foi utilizada a enzima T4 DNA ligase (Promega), em um volume total de 10 µL, de 
acordo com as instruções do fabricante. 
3.2.3 Células competentes e transformação 
 
O preparo de células competentes obedeceu a um protocolo clássico, na câmara de fluxo 
laminar com todos os reagentes gelados, incluindo a cultura bacteriana, e na ausência de fogo. A 
cepa DH5α de E. coli utilizada nesta etapa foi cultivada durante a noite, a 37º C em 3 mL de LB. 
Posteriormente, 500 µL de cultura foram transferidos para 50 mL de meio LB e incubados a 37º C 
até atingir a fase logarítimica, numa DO600nm entre 0,5 e 0,7. Em seguida, a cultura foi coletada por 
centrifugação 5.000 x g por 10 minutos a 4º C. O sobrenadante foi descartado e o sedimento celular 
foiressuspendido e lavado em água estéril e gelada, sendo coletado em seguida por centrifugação 
5.000 x g por 10 minutos a 4º C. A lavagem com água foi repetida e após nova centrifugação 5.000 
x g por 10 minutos a 4º C, o sedimento celular obtido foi ressuspendido em 300 µL de glicerol 10% 
estéril. A suspensão de células competentes era usada imediatamente (60 µL/transformação) e/ou 
armazenada em nitrogênio líquido. 
 25 
 
 
Para remover sais da mistura de ligação entre DNAs (T4 DNA ligase, no item 3.2.2) foi 
realizada uma mini-diálise. Para isso, ao final da reação de ligação entre um plasmídeo linearizado 
e um fragmento de DNA, 5 µL de água estéril foram adicionados a mistura que era colocado sobre 
um filtro de éster de celulose de 0,025 µm (Millipore) estéril, posicionado sobre a superfície de 
água destilada estéril em uma placa de Petri também estéril. Após 20 minutos, o volume da ligação 
era coletado e metade (cerca de 5 µL) foi usada para a transformação de 60 µL de célula 
competente. 
Para transformação, as células competentes mais a mistura da reação de ligação foram 
submetidas à eletroporação (Bio-Rad Gene Pulser; cubeta Gene Pulser™/E. coli eletrodo 0.2 cm) 
utilizando os seguintes parâmetros: capacitância 25 µFD, resistência 1000 Ω e voltagem 1,5 kV. À 
suspensão, após eletroporação, foi adicionado 1 mL de meio SOB ou meio LB, seguido de 
incubação a 37º C por 1 hora. As células foram coletadas por centrifugação 12.000 x g por 4 
minutos à temperatura ambiente, suspensas em 100 µL de LB e plaqueadas em meio LB-ágar 1,5%, 
contendo os antibióticos necessários. As placas foram incubadas a 37° C, para isolamento dos 
clones bacterianos contendo os plasmídeos recombinantes. 
3.3 Análise e identificação de proteínas 
3.3.1 Extração de proteínas (lisado total) 
 
Após cultivadas em MGHP e MGLP com antibióticos adequados, sob agitação a 37º C, por 
5 horas (item 3.1), um volume de células de cada cultura, correspondente a DO600nm de 0,5, foi 
coletado por centrifugação a 16.000 x g por 4 minutos e o sedimento foi ressuspenso em 20 µL de 
PBS (NaCl 140 mM; KCl 2,7 mM; Na2HPO4 8 mM; KH2PO4 1,5 mM, pH 7,4) e 20 µL de tampão 
de amostra 2X (Tris–HCl 0,1 M pH 6,8, glicerol 20%, SDS 4%, azul de bromofenol 0,2%, DTT 
122 mM) (SAMBROOK e cols., 1989). As amostras foram incubadas a 100° C por 5 minutos e em 
seguida centrifugadas a 16.000 x g por 10 minutos. Os sobrenadantes foram usados na análise das 
proteínas totais das células e/ou estocados em congelador (- 20º C) para análises futuras.
 26 
 
3.3.2 Análise eletroforéticas de proteínas (SDS-PAGE) 
 
As amostras proteicas (7 µL de cada), preparadas como descrito acima (item 3.3.1), foram 
analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida (9 x 5,5 cm) 12,5% com SDS (separação: 
Acrilamida Bis 1,6 %, Tris-HCl pH 8,8 1,5 M, água, SDS 10%, PSA 10%, TEMED; stacking: 
Acrilamida Bis 5%, Tris-HCl pH 6,8 1,5 M, água, SDS 10%, PSA 10%, TEMED) em tampão Tris–
glicina/SDS (glicina 38 mM; Tris base 5 mM; SDS 0,1%) a 100 V (LAEMMLI, 1970). Após a 
eletroforese, as proteínas no gel foram coradas com azul Coomassie G-250 coloidal (NEUHOFF e 
cols., 1988). Para isso, o gel foi incubado em solução de fixação (etanol 30% e ácido fosfórico 2%) 
por no mínimo 1 hora, com agitação, a temperatura ambiente. A solução foi descartada e o gel foi 
lavado rapidamente com solução de ácido fosfórico 2%. Em seguida, o gel foi tratado com a 
solução corante (etanol 18%, sulfato de amônio 15%, ácido fosfórico 2% e azul de Coomassie G-
250 0,02%), por 72 horas, sob agitação, à temperatura ambiente, com movimentos suaves. 
3.3.3 Identificação de proteínas de interesse por espectrometria de massas 
 
A banda contendo a proteína de interesse foi removida do gel de poliacrilamida (item 3.3.2) 
com auxílio de uma lâmina, fragmentada e transferida para um microtubo de 1,5 mL, previamente 
lavado 2 vezes com metanol e água destilada. Os fragmentos foram lavados com 1 mL de 
acetonitrila 50% em NH4HCO3 25 mM pH 8,0 e tratados com solução de ditiotreitol (DTT) 10 mM 
em NH4HCO3 25 mM, por 1 hora a 56° C e, então, com iodoacetamida 55 mM em NH4HCO3 25 
mM por 45 minutos, a temperatura ambiente, no escuro. Após lavados novamente com 1 mL de 
acetonitrila 50% em NH4HCO3 25 mM pH 8,0, os fragmentos foram transferidos para um tubo 
contendo 25 µL de acetonitrila 100%, que foi submetido a vácuo (Speed-Vac) por 20 minutos. Para 
digestão proteica, os fragmentos secos foram incubados com 25 µL de tripsina (Porcine Tripsin, 
Promega) em 10 mg/mL em NH4HCO3 25 mM, pH 8,0, a 37º C, durante a noite. Os peptídeos 
trípticos foram extraídos por duas incubações sucessivas com 50 µL de solução contendo 
acetonitrila 50% e ácido trifluoracético 5%, por 30 minutos, a temperatura ambiente, com agitação. 
A mistura resultante da extração foi transferida para um tubo limpo e o volume foi reduzido em 
 27 
 
concentrador a vácuo (Speed-Vac), por alguns minutos, até aproximadamente 5 µL 
(SHEVCHENKO e cols., 1996). 
Os fragmentos proteicos foram então purificados em coluna de C18, composta de um 
volume pequeno de resina (Empore™, 3 M) compactada na extremidade estreita de uma ponteira 
de 10 µL com o auxílio de um arame de espessura fina. A coluna foi equilibrada com 20 µL de 
ácido trifluoroacético 0,1%. Em um tubo eppendorf, a amostra (5 µL) foi misturada a 1 µL de ácido 
fórmico e aplicada na ponteira sobre a resina. Posteriormente, a coluna de C18 foi lavada com 20 
µL de ácido trifluoroacético 0,1% e a amostra foi eluída da resina em 20 µL de acetonitrila 50% 
para novo tubo lavado, previamente em metanol e água destilada. O produto foi seco a vácuo 
(Speed-Vac) e estocado a -20° C. 
Os peptídeos foram analisados por espectrometria de massas no aparelho ESI-Q-Tof Micro 
(Waters Corporation, USA) acoplado a NanoUPLC (Nano Ultra Performance Liquid 
Chromatography-nano ACQUITY Waters). A identificação das proteínas na amostra foi realizada 
com o programa Mascot. (http://www.matrixscience.com), utilizando os dados de MS/MS para 
realizar a busca contra o banco de dados NCBI limitado a bactérias. 
3.4 Análise e identificação do perfil lipídico 
3.4.1 Extração de lipídios 
 
Para o preparo das amostras lipídicas, as células foram cultivadas em 10 mL de MGHP e 
MGLP com antibióticos adequados, sob agitação a 37º C, por 5 horas (item 3.1). As células foram 
coletadas por centrifugação 12.000 x g por 10 minutos à temperatura ambiente e cada sedimento 
celular foi suspendido em 300 µL de PBS. 
A extração de lipídios foi realizada em tubos de vidro previamente lavados com metanol e 
clorofórmio, seguindo o método de Bligh e Dyer (1959). Utilizando microseringa (Hamilton), aos 
300 µL da suspensão celular foram adicionados 750 µL de metanol e 375 µL de clorofórmio. Em 
seguida, as misturas foram homogeneizadas vigorosamente em agitador do tipo Vortex (2 x 30 
segundos) e a cada uma foram adicionados 25,2 µL de solução de ácido clorídrico 6 M e 375 µL 
de clorofórmio. Posteriormente, as amostras foram novamente homogeneizadas (2 x 30 segundos) 
e a cada uma foram adicionados 375 µL de água estéril. Foram realizadas 3 extrações de fase 
 28 
 
orgânica a partir de mesma fase aquosa. Após homogeneização (2 x 30 segundos) e centrifugação 
a 5.000 x g por 10 minutos a 10º C, entre cada extração, a fase orgânica de cada preparação foi 
coletada para um novo frasco de vidro. A fase orgânica das 3 extrações de cada amostra foi reunida 
no mesmo frasco, seca sob fluxo de nitrogênio e armazenada a -20º C. 
3.4.2 Análise de lipídios por cromatografia em camada fina (TLC) 
 
Para realizar a TLC (Thin-layer chromatography), as amostras secas foram ressuspendidas 
em cerca de 100 µL de clorofórmio e uma alíquota de 20 µL de cada preparação foi aplicada 
cuidadosamente em uma cromatofolha de sílica gel/alumínio (sílica gel 60, Merck). 
Posteriormente, a placa foi inserida em uma cuba de cromatografiaTLC, com um papel de filtro 
ocupando as paredes internas, e contendo a mistura de solventes constituída de 65 mL de 
clorofórmio, 25 mL de metanol e 4 mL de água. Após tempo necessário para que o solvente 
chegasse a alguns milímetros da extremidade superior da placa, essa foi retirada da cuba e seca 
completamente. Em seguida, a placa seca foi pulverizada com solução de ninidrina (1 mg/mL-1 
ninidrina em butanol saturado com água) e submetida a aquecimento em chapa aquecedora para 
visualização dos lipídios. As manchas lipídicas evidentes na placa foram marcadas a lápis para 
posterior identificação do perfil lipídico (FUCHS e cols., 2011). 
3.5. Análises de similaridade entre proteínas 
 
A sequência de aminoácidos de cada proteína em estudo foi obtida em banco de dados 
(Protein Data bank - PDB) e o programa BlastP (www.ncbi.nlm.nih.gov) foi usado para analisar 
similaridade de sequências entre as proteínas de interesse e calcular a significância estatística das 
correspondências. O BlastP também foi usado para inferir relações funcionais entre sequências. 
 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
 29 
 
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 
4.1 Construção de um plasmídeo carreando o gene vc0489 e sua região reguladora 
 
Para avaliar o envolvimento do produto do gene vc0489 na síntese de LOs em V. cholerae, 
um fragmento do DNA cromossomal da cepa N16961, contendo o gene e uma sequência de sua 
região reguladora, foi clonado no vetor pGEM-T Easy (item 3.2.1 e 3.2.2). 
 O fragmento de 2061 bp, contendo o gene vc0489 (1761 bp) e sua região reguladora (300 
bp) foi amplificado por PCR, usando o DNA cromossomal da cepa de V. cholerae N16961 como 
molde (item 3.2.2), e seu tamanho e integridade foram confirmados por eletroforese em gel de 
agarose 1% em TAE 1 x (Fig. 5). 
 
Figura 5 - Análise eletroforética do DNA cromossomal da cepa de V. cholerae N16961 e do fragmento de 
DNA contendo o gene vc0489 e região reguladora (2061 kb), gerado por PCR, utilizando o DNA 
cromossomal como molde e os oligonucleotídeos 489proFw e 489expRv (itens 3.2.1 e 3.2.2). Padrão de 
peso molecular 1kb DNA Ladder (Promega); gel de agarose 1% em TAE 1X. 
 
Após removido do gel e purificado (item 3.2.2), o fragmento de DNA contendo o gene 
vc0489 e região reguladora (2061 bp) foi ligado ao plasmídeo pGEM-T Easy linearizado (Ampr; 
Tabela 1), de acordo com as instruções do fabricante (Promega). O produto da reação foi usado 
 30 
 
para transformar células competentes de cepa DH5α de E. coli, que foram selecionadas em placa 
de LB-ágar contendo ampicilina (item 3.2.3). Células de oito colônias foram analisadas quanto à 
presença de plasmídeos, e em sete delas, plasmídeos com a mesma mobilidade eletroforética foram 
encontrados. 
 
Figura 6 - Análise eletroforética do DNA plasmidial extraído de duas colônias (1 e 2) da cepa DH5α de E. 
coli, possivelmente positivas para o plasmídeo recombinante pGEM.vc0489. Gel de agarose 1% em TAE 
1X. 
 
Plasmídeos de duas colônias (1 e 2) foram selecionados aleatoriamente (Fig. 6) para 
digestão com a enzima de restrição Sma I (item 3.2.2), que reconhece a sequência 5´-CCCGGG-
3´, presente nas extremidades 5´ dos oligonucleotídeos 489proFw e 489expRv, utilizados para a 
amplificação do fragmento clonado no pGEM-T Easy. Nessa digestão eram esperados dois 
fragmentos de DNA, um de cerca de 2,0 kb, correspondente ao gene vc0489 e sua região 
reguladora, e outro de cerca de 3,0 kb, correspondente ao plasmídeo linearizado. Entretanto, os 
fragmentos gerados na digestão de ambos os plasmídeos apresentaram mobilidades eletroforéticas 
correspondentes, respectivamente, às dos fragmentos de 3,0 kb e 5,0 kb do padrão de 1,0 kb (Fig. 
7). 
 
 
 
 31 
 
 
Figura 7 - Análise eletroforética do produto da digestão de plasmídeos extraídos de duas colônias distintas 
de DH5α (1 e 2), contendo supostamente o plasmídeo recombinante pGEM.vc0489, com a enzima Sma I. 
Padrão de peso molecular 1kb DNA Ladder (Sigma). Gel de agarose 1% em TAE 1X. 
 
Para esclarecer a dúvida, o DNA plasmidial isolado da colônia 2 (Fig. 6) mais os 
oligonucleotídeos 489proFw e 489expRv foram usados em um teste de PCR (item 3.2.2). Análise 
eletroforética do produto da reação mostrou uma banda de cerca de 2,0 kb, indicando que o 
fragmento contendo o gene vc0489 e sua região reguladora, foi clonado no pGEM-T Easy, como 
esperado (Fig. 8). O plasmídeo recombinante foi denominado pGEM.vc0489 e células de DH5α 
contendo o plasmídeo (DH5α.pGEM.vc0489) foram armazenados em nitrogênio líquido para os 
experimentos subsequentes. 
 
 
 32 
 
 
Figura 8 - Análise eletroforética do fragmento de DNA gerado no teste de PCR utilizando o DNA plasmidial 
isolado de células do clone 2 de DH5α (Fig. 6) como molde e os oligonucleotídeos 489proFw e 489expRv 
(item 3.2.2). Padrão de peso molecular 1kb Ladder (Promega); gel de agarose 1% em TAE 1X. 
 
 Quanto a mobilidade eletroforética alterada dos fragmentos de digestão do pGEM.vc0489 
no gel da Figura 7, é possível que seja devido a presença de sal na mistura da reação, uma vez que 
a amostra foi aplicada no gel, antes de passar por uma etapa de precipitação para purificar os 
produtos da digestão. Sabe-se que sal pode causar uma anomalia na migração dos fragmentos de 
DNA em gel de agarose, pois pode afetar a corrente que passa pelo gel e também o estado de carga 
dos ácidos nucléicos (HA e cols., 1999). 
4.2 Perfis proteicos das cepas DH5α e DH5α.pGEM.vc0489 de E. coli cultivadas sob limitação 
e abundância de Pi 
 
E. coli é uma espécie bacteriana que não produz LOs (GEIGER e cols., 2010). Assim sendo, 
a cepa DH5α.pGEM.vc0489 foi usada para verificar se haveria expressão heteróloga do gene 
vc0489 com produção de LO e se esse processo seria dependente dos níveis extracelulares de Pi, 
como observado em Sinorhizobium meliloti e Serratia proteamaculans (GEIGER e cols., 1999; 
VENCES-GUZMÁN e cols., 2015). 
Inicialmente, células de DH5α.pGEM.vc0489 e de DH5α (controle negativo), foram 
cultivadas em meio MG com alta (MGHP) ou baixa (MGLP) concentração de Pi (item 3.1), 
https://www.future-science.com/doi/10.2144/99263bm11
 33 
 
condições estas definidas previamente para V. cholerae (VON KRÜGER e cols., 1999). Lisados 
totais das células dessas culturas foram preparados (3.3.1) e as proteínas foram analisadas por SDS-
PAGE (item 3.3.2) (Fig. 9). 
 
Figura 9 - Perfis eletroforéticos de proteínas dos lisados totais de células de DH5α e DH5α.pGEM.vc0489, 
cultivadas em MGLP (LP) e MGHP (HP). A banda protéica entre 50 e 75 kDa (marcada com uma seta azul, 
à direita) e presente apenas no lisado de DH5α.pGEM.vc0489 cultivada em MGLP, foi extraída do gel para 
identificação por espectrometria de massas (item 3.3.3). Padrão de proteínas (kDa), Broad Range Protein 
Molecular Weight Markers (Promega). SDS-PAGE em gel de poliacrilamida 12,5% corado com azul de 
Coomassie G-250 (item 3.3.2). 
 
O perfil proteico das células de uma mesma cepa varia com o meio de cultura. Isto pode ser 
observado ao compararmos os perfis de células de DH5α e de DH5α.pGEM.vc0489, cultivadas em 
MGHP e MGLP (Fig. 9). 
Além disto, é possível observar diferenças entre os perfis das proteínas das células de DH5α 
e de DH5α.pGEM.vc0489, cultivadas em um mesmo meio (Fig. 9). Dentre as bandas proteicas 
diferenciais nos perfis das duas cepas em MGLP, chama atenção uma banda forte entre 50-75 kDa 
(marcada com uma seta azul à direita), presente apenas entre as proteínas de DH5α.pGEM.vc0489. 
Esta banda foi extraída do gel, digerida com tripsina e analisada por espectrometria de massas (item 
3.3.3), e 3 proteínas diferentes foram identificadas (Tabela 2), duas de E. coli, e o produto do gen
 34 
 
e vc0489 de V. cholerae. Vale ressaltar que, por ser uma banda em gel unidimensional (SDS-
PAGE), não é surpreendente que proteínas com mobilidades eletroforéticas semelhantes tenham 
sido encontradas na mesmaregião, já que a separação neste tipo de gel se dá apenas pelo peso 
molecular da proteína. 
Uma das proteínas de E. coli encontradas foi a GroEL (WP_000729122), que é uma 
chaperona indispensável para a sobrevivência e o crescimento da célula, uma vez que auxilia no 
enovelamento correto de muitas proteínas na célula, sob várias condições (KWAK e cols., 2000). 
A outra proteína de E. coli também identificada na banda do gel foi a piruvato cinase PykF 
(WP_001300312), que catalisa a formação do piruvato na última reação da glicólise (PONCE e 
cols., 1995). A terceira proteína identificada na banda é codificada pelo gene vc0489, e anotada 
como hemolisina (WP_000953506) da família das N-acetiltransferases de V. cholerae (BARBOSA 
e cols., 2018; VENCES-GUZMÁN e cols., 2015). 
Embora não tenhamos verificado, é possível que as proteínas GroEL e piruvato cinase PykF 
também estejam entre as produzidas pela DH5α.pGEM.vc0489 em MGHP e por DH5α em MGHP 
e MGLP, uma vez que GroEL é sintetizada continuamente pela bactéria (KWAK e cols., 2000) e 
PykF é a piruvato cinase mais importante da bactéria (PONCE e cols., 1995). 
Os resultados acima mostram, portanto, que o gene vc0489 foi expresso em E. coli cultivada 
sob limitação, mas não em abundância de Pi, o que sugere que sua expressão possa ser diretamente 
dependente do sistema PhoB/PhoR da bactéria, ou seja, que o gene seja um novo membro do 
regulon Pho de V. cholerae. A favor desta hipótese está o fato de que na região reguladora (300 
bp) de vc0489, já havia sido encontrada uma sequência com alta similaridade a caixa Pho consenso 
do gênero Vibrio (score >4, considerada forte), centrada a -158 do códon de início da tradução 
(COSTA LEITE, 2016). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 35 
 
Tabela 2 - Proteínas de células de DH5α.pGEM.vc0489 cultivadas em MGLP e identificadas na banda de 
peso molecular entre 50-75 kDa removida do gel de SDS-PAGE 
 
Gene 
(ID) 
Proteína 
 
Função MW 
(kDa) 
Score Peptídeos Peptídeos 
únicos 
Cobertura 
(%) 
Organismo 
gi|44687
6250 
WP_000
953506 
 
 
Hemolisina 
putativa 
(VC0489) 
65,65 595 9 2 17 V. choleare 
gi|14216
48 
 
 
WP_000
729122 
Chaperona 
GroEL 
(cadeia A) 
57,03 551 11 1 25 E. coli 
gi|55872
8963 
WP_001
300312 
Piruvato 
Cinase 
(PykF) 
50,54 89 2 2 11 E. coli 
Proteínas identificadas com o programa Mascot. (http://www.matrixscience.com), utilizando os dados de 
MS/MS e busca no banco de dados NCBI limitado a bactérias. 
4.3 Perfis lipídicos das cepas DH5α e DH5α.pGEM.vc0489 de E. coli cultivadas sob limitação 
e abundância de Pi 
 
 Para verificar um possível envolvimento do gene vc0489 na síntese de LOs em E. coli, os 
lipídios de membrana das cepas DH5α (controle negativo) e DH5α.pGEM.vc0489, ambas 
cultivadas em MGHP e MGLP, foram extraídos e analisados por cromatografia de camada fina 
(TLC) (itens 3.4.1 e 3.4.2). Três tipos de lipídios com intensidades distintas foram detectados nas 
amostras analisadas na placa de TLC corada com solução de ninidrina (Fig. 10). Um lipídio 
corresponde às manchas mais fortes nas quatro amostras, na parte superior da placa e, um outro, às 
manchas menos intensas mais abaixo e detectado em três das amostras. Estes lipídios foram 
identificados anteriormente por nosso grupo, como sendo respectivamente, fosfatidiletanolamina 
(PE) e fosfatidilglicerol (PG) (BARBOSA e cols., 2018), e corroboram informações de que as 
membranas internas e externa de E. coli são compostas de cerca de 70% de fosfatidiletanolamina 
(PE), seguido por fosfatidilglicerol (PG, ~20%) e pequenas quantidades de cardiolipina (CL, ~5%) 
(MATSUMOTO, 2001). Um terceiro lipídio foi detectado apenas entre os sintetizados nas células 
de DH5α.pGEM.vc0489 em MGLP. Esse resultado indica que o gene vc0489 de V. cholerae foi 
expresso nesta cepa, sob limitação de Pi, e que seu produto, a proteína VC0489, catalisou a síntese 
deste lipídio, que foi incorporado na membrana da bactéria (Fig. 10). Em outras análises de lipídios 
conduzidas em nosso laboratório (BARBOSA e cols., 2018) foi demonstrado, que além do PE, o 
lipídio exclusivo das células de DH5α.pGEM.vc0489 em MGLP corresponde a LO. Portanto, 
 36 
 
a proteína VC0489 deve ser uma transacetilase bifuncional, assim como a OlsF de Serratia 
proteamaculans (VENCES- GUZMÁN e cols., 2015). 
A síntese de um lipídio novo nas células de DH5α.pGEM.vc0489 apenas em MGLP, 
quando o PhoB/PhoR estava ativo, também sugere regulação da expressão de vc0489 pela proteína 
PhoB (Fig. 10). 
 
 
Figura 10 - Cromatografia de camada fina (TLC) representativa dos lipídios extraídos das membranas de 
E. coli cepas DH5α (controle) e DH5α/pGEM.vc0489, cultivadas em MGLP e MGHP, respectivamente, 
sem ou com ampicilina (itens 3.4.1 e 3.4.2). Os lipídios foram corados com solução de ninidrina, porém não 
foi possível fazer a identificação a partir dessa placa. Outros experimentos conduzidos em nosso laboratório 
demonstraram fostatidiletanolamina (PE), nas duas cepas e que a banda presente exclusivamente em células 
de DH5α.pGEM.vc0489 em MGLP (sinalizada com uma seta azul, à direita) corresponde a LOs 
(BARBOSA e cols., 2018). 
4.4 Caracterização funcional de VC0489 por bioinformática 
 
 Como mencionado anteriormente (item 1.3), na via OlsBA de síntese de LOs a partir da 
ornitina, duas aciltransferases distintas catalisam as duas etapas do processo: a OlsB, que tem 
 37 
 
atividade N-aciltransferase e a OlsA, com atividade, O-aciltransferase. No caso de OlsF, ambas as 
atividades se encontram na mesma proteína que é, portanto, uma aciltransferase bifuncional 
(VENCES-GUZMÁN e cols., 2015). 
Nenhum gene que codifica um homólogo da N-aciltransferase OlsB, ou da O-
aciltransferase OlsA, foi identificado no genoma da cepa pandêmica de V. cholerae N16961. 
Porém, genes que codificam homólogos de OlsF foram detectados nos genomas de cerca de 25% 
das bactérias sequenciadas, incluindo na cepa N16961 de V. cholerae (WP_000953507.1) 
(VENCES-GUZMAN e cols, 2015). 
O alinhamento (item 3.5) entre as sequências de OlsF de S. marcescens (WP_193842811.1, 
que já foi bem caracterizada) e VC0489 de V. cholerae (WP_000953507.1) mostrou um número 
semelhante de resíduos de aminoácidos, ou seja, 573 e 586, respectivamente, além de alta 
identidade (34%, 190/565) e similaridade de 50% (283/565) (Fig. 11), indicando que a VC0489 
pode ser de fato homóloga a OlsF de S. marcescens. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 38 
 
(i) Identities:190/565(34%), Positives:283/565(50%), Gaps:42/565(7%) 
 
Query 29 KRLNQFYAQRPASGDTQAFLRFTLDVLGIDYQVVRGKLTHVPAQGATIVVANHPLGCVEG 88 
 K QF A P + +D + ++V G L ++P+QG ++VANHP+G ++G 
Sbjct 32 KEFKQFAADYPHLKGLD-LIEQVVDYFNLSCELVDGDLENIPSQGPVVLVANHPIGSLDG 90 
 
Query 89 VILAELLLCVRSDVKILANQYLKLVPELTSLFIGVDVFEGADAAKANLHALRQAHKHLEQ 148 
 ++L + VR DVK++A+Q L + L SLF+ VD A K + + + L+ 
Sbjct 91 LVLLRAVAAVRPDVKVVASQLLTYIEPLRSLFVPVDNV----AYKTSRKQIEGMQQQLDN 146 
 
Query 149 GGLLLMFPAGEVSQLVDSKQGRLEDKEWSQSVSRLVKKHQAHTVPVYIDGHNSTPFYLAG 208 
 G L++FPAGEVS++ S +G + D W RL K +A VP++I NS FY 
Sbjct 147 QGALILFPAGEVSRM--SPKG-IRDGHWHTGFLRLAAKARAPIVPIHISARNSNLFYFTS 203 
 
Query 209 KIHPMLRTLMLGRELLNKQHTQIGIAIGEGISHSEVQ--HLCDQQLVNYLRLNTYLL-QS 265 
 ++ L TL+L RE+ ++ +I I +G + + H + L R + Y L Q 
Sbjct 204 LVYRPLSTLLLVREMFQQRGGRIKIRVGGRVPFANWHDGHTSAKDLAERFRRHVYRLGQG 263 
 
Query 266 SPVRNKTASDRSLPPVAERLPLADLLEDIAQL---PYADHMLRHNQFDVYCTTADNIPSL 322 
 P + S +LP +RL L L + +L P + + + D T + 
Sbjct 264 KPGLFASESPIALP--EDRLELKKALANCERLGVTPDGKTIYLYRRHDEART------PI 315 
 
Query 323 MHEIGRIRELNFREVGEGTGCALDIDRFDRDYLHLFIWDREKNQLVGAYRLGLVDKLIEH 382 
 + E+GR+RE+ FR VGEG+G D+D +D DY HL +WD E+ ++VGAYR + I 
Sbjct 316 LRELGRLREIAFRAVGEGSGRRRDLDSYDDDYYHLVLWDEEELEIVGAYRFIPTAEQIAR375 
 
Query 383 KGISGLYSSTLFHYDQRFLNNMGNAIEMGRSVIDSQYQKSMAALLLLWKGIGTYVERHPQ 442 
 KG+ +YS++LFHYD+ + IE+GRS I Y L LW GIG Y+ ++PQ 
Sbjct 376 KGLESIYSNSLFHYDRDMEPILAQGIELGRSFIQPAYWGKR-GLDYLWLGIGAYLSKYPQ 434 
 
Query 443 YTHLFGPVSISNDYSEQARRLLADTMTLHYYDSEQAELVMATNPLPTGQAQWNASLLTS- 501 
 Y +LFGPVSIS AR LL L++ S + P P Q A 
Sbjct 435 YRYLFGPVSISGGMPLAARDLLIAFYRLYF--SPDHAFGQSRRPYPASLPQVLAQFAGDN 492 
 
Query 502 -LADLQLLSRVIARIDEGKGIPVLLRQYLGL----NGKLVSFNVDPAFNNALDGLIVVDL 556 
 DL L +++ I G IP L +QY L + + F DPAFNN +DGL++VD 
Sbjct 493 YQEDLVRLKSLLSNI--GCSIPTLYKQYTELCEPGGVQFIDFGTDPAFNNCIDGLVLVDT 550 
 
Query 557 RNVPTKTLARYMGQSEALRYLATHQ 581 
 + +RY RY+A HQ 
Sbjct 551 TRLKP---SRYQ------RYIAVHQ 566 
 
(ii) WP_000953507.1- (VC0489) Hypothetical protein de V. cholerae N16961 
MLSTSPFVLPRKTPFGLGEHLAEWATGLKRLNQFYAQRPASGDTQAFLRFTLDVLGIDYQVVRGKLTHVPAQGATIVVANHPLGCVEGVILAELLLC
VRSDVKILANQYLKLVPELTSLFIGVDVFEGADAAKANLHALRQAHKHLEQGGLLLMFPAGEVSQLVDSKQGRLEDKEWSQSVSRLVKKHQAHTVPV
YIDGHNSTPFYLAGKIHPMLRTLMLGRELLNKQHTQIGIAIGEGISHSEVQHLCDQQLVNYLRLNTYLLQSSPVRNKTASDRSLPPVAERLPLADLL
EDIAQLPYADHMLRHNQFDVYCTTADNIPSLMHEIGRIRELNFREVGEGTGCALDIDRFDRDYLHLFIWDREKNQLVGAYRLGLVDKLIEHKGISGL
YSSTLFHYDQRFLNNMGNAIEMGRSVIDSQYQKSMAALLLLWKGIGTYVERHPQYTHLFGPVSISNDYSEQARRLLADTMTLHYYDSEQAELVMATN
PLPTGQAQWNASLLTSLADLQLLSRVIARIDEGKGIPVLLRQYLGLNGKLVSFNVDPAFNNALDGLIVVDLRNVPTKTLARYMGQSEALRYLATHQY
FSDI 
 
(iii) WP_193842811.1- (OlsF) Ornithine lipid synthase de Serratia marcescens 
MFSLDSLLQDAFPHRNTPAWQRSLLRTLLFEKEFKQFAADYPHLKGLDLIEQVVDYFNLSCELVDGDLENIPSQGPVVLVANHPIGSLDGLVLLRAV
AAVRPDVKVVASQLLTYIEPLRSLFVPVDNVAYKTSRKQIEGMQQQLDNQGALILFPAGEVSRMSPKGIRDGHWHTGFLRLAAKARAPIVPIHISAR
NSNLFYFTSLVYRPLSTLLLVREMFQQRGGRIKIRVGGRVPFANWHDGHTSAKDLAERFRRHVYRLGQGKPGLFASESPIALPEDRLELKKALANCE
RLGVTPDGKTIYLYRRHDEARTPILRELGRLREIAFRAVGEGSGRRRDLDSYDDDYYHLVLWDEEELEIVGAYRFIPTAEQIARKGLESIYSNSLFH
YDRDMEPILAQGIELGRSFIQPAYWGKRGLDYLWLGIGAYLSKYPQYRYLFGPVSISGGMPLAARDLLIAFYRLYFSPDHAFGQSRRPYPASLPQVL
AQFAGDNYQEDLVRLKSLLSNIGCSIPTLYKQYTELCEPGGVQFIDFGTDPAFNNCIDGLVLVDTTRLKPSRYQRYIAVHQQQPAETA 
Figura 11- (i) Alinhamento entre as sequências de VC0489 [(ii) WP_000953507.1; 586 aa] de V. cholerae 
N16961 (Query) com a OlsF [(iii) WP_193842811.1; 573 aa] de Serratia marcescens (Sbjct). (+) entre 
aminoácidos com propriedades químicas semelhantes. 
 39 
 
Na OlsF de S. proteamaculans, o domínio C-terminal é responsável pela etapa de N-
aciltransferase (VENCES-GUZMAN e cols, 2015). Para chegar a esses resultados os autores 
usaram o programa BlastP para comparar as sequências da OlsF com a de OlsB de Sinorhizobium. 
melliloti (NP_384499.1), e identificaram uma sequência de 101 aminoácidos no domínio C-
terminal da OlsF contendo o motivo H349(X)4D354 (H349LVLWD354) indicativo de uma 
aciltransferase, com 36% de identidade com a sequências de OlsB, sugerindo que esse domínio de 
OlsF, deve ser o responsável pela N-acilação da ornitina. 
O alinhamento entre as sequências de 241 aa do domínio C-terminal de VC0489 (Fig. 12 
ii, negrito; Sbjct) e os 220 aa finais de OlsB de S. melliloti (NP_384499.1) (Fig. 12 iii, negrito; 
Query) revelou 32% identidade em 101 aminoácidos e presença do motivo H356(X)4D361 
(H356LFIWD361) em VC0489 (Fig. 12 i; negrito amarelo), indicando que a N-acilação da ornitina 
deva ser catalisada por uma sequência desse domínio da proteína VC0489. 
 
(i) Identities:32/101(32%), Positives:50/101(49%), Gaps:10/101(9%) 
 
Query 77 DIDSWDAICDHLLVLDTSIEGDAEEQIVGTYRL-LRQDVAERTG--GFYSASEFAIGELL 133 
 DID +D HL + D + Q+VG YRL L + E G G YS++ F + 
Sbjct 46 DIDRFDRDYLHLFIWDRE-----KNQLVGAYRLGLVDKLIEHKGISGLYSSTLFHYDQRF 100 
 
Query 134 SRHPGKRFMELGRSCVLPEY-RTKRTVELLWQGNWAYALKH 173 
 + G +E+GRS + +Y ++ + LLW+G Y +H 
Sbjct 101 LNNMGNA-IEMGRSVIDSQYQKSMAALLLLWKGIGTYVERH 140 
 
(ii) WP_000953507.1, VC0489 de Vibrio cholerae N16961 (Sbjt) 
MLSTSPFVLPRKTPFGLGEHLAEWATGLKRLNQFYAQRPASGDTQAFLRFTLDVLGIDYQVVRGKLTHVPAQGATIVVANHPLGCVEGVILAELLLC
VRSDVKILANQYLKLVPELTSLFIGVDVFEGADAAKANLHALRQAHKHLEQGGLLLMFPAGEVSQLVDSKQGRLEDKEWSQSVSRLVKKHQAHTVPV
YIDGHNSTPFYLAGKIHPMLRTLMLGRELLNKQHTQIGIAIGEGISHSEVQHLCDQQLVNYLRLNTYLLQSSPVRNKTASDRSLPPVAERLPLADLL
EDIAQLPYADHMLRHNQFDVYCTTADNIPSLMHEIGRIRELNFREVGEGTGCALDIDRFDRDYLHLFIWDREKNQLVGAYRLGLVDKLIEHKGISGL
YSSTLFHYDQRFLNNMGNAIEMGRSVIDSQYQKSMAALLLLWKGIGTYVERHPQYTHLFGPVSISNDYSEQARRLLADTMTLHYYDSEQAELVMATN
PLPTGQAQWNASLLTSLADLQLLSRVIARIDEGKGIPVLLRQYLGLNGKLVSFNVDPAFNNALDGLIVVDLRNVPTKTLARYMGQSEALRYLATHQY
FSDI 
 
(iii) AGG72973.1, OlsB de Sinorhizobium meliloti 2011 (Query) 
MTIELLDSMGVVDTSNAYIRKAVAAPASDVLGRIANLETRLARSAAEIDAAQAVRYRVFVEEMKAQVAPEAGRRKRDIDSWDAICDHLLVLDTSIEG
DAEEQIVGTYRLLRQDVAERTGGFYSASEFAIGELLSRHPGKRFMELGRSCVLPEYRTKRTVELLWQGNWAYALKHGIDAMFGCGSFPGVVPEEHAL
ALSFLHHNVRVRDEWAVSARPELYRTMDLMPPEAINPKKALAALPPLIKGYMRLGAMVGDGAVVDQAFRTTDVLIVLPIGKISGRYLNYYGADAGRF
SSPVS 
 
Figura 12- (i) Alinhamento da sequência de 241 aa do domínio C-terminal da proteína VC0489 [negrito 
em (ii) WP_000953507.1; 586 aa] de V. cholerae N16961 (Sbjct) com 220 aa finais da proteína OlsB 
[negrito em (iii) AGG72973.1, 296 aa] de Sinorhizobium meliloti (Query). (+) entre aminoácidos com 
propriedades químicas semelhantes. Em amarelo os motivos H(X)4D indicativos da atividade “N-
aciltransferase” (VENCES-GUZMÁN e cols., 2015). 
 
 40 
 
Quanto ao domínio da OlsF de S. marcescens responsável pela O-aciltransferase, ele foi 
atribuído ao N-terminal da proteína. A OlsF não apresenta similaridade de sequência com a OlsA 
de S. melliloti (AGG72984.1, que tem atividade O-aciltransferase), porém o domínio N-terminal 
de OlsF possui o motivo característico da O-aciltransferase OlsA do tipo H73(X)5D78 (Fig 13 ia, 
negrito azul), que no caso da OlsF é (H83PIGSLD89) (Fig. 13 iii; negrito azul) (VENCES-
GUZMAN e cols., 2015). 
Também não foi observado similaridade entre as sequências de VC0489 e da proteína OlsA 
de S. melliloti, porém, a VC0489 possui no seu domínio N-terminal o motivo aciltransferase 
(H81PLGCVE87) (Fig. 13 ii; negrito azul), típico da OlsA (H73(X)4D78) (Fig. 13 ia; negrito azul). 
Esta informação reforça a hipótese de que o domínio N-terminal da VC0489 catalisa a segunda 
etapa (O-acilação) na síntese de LOs, assim como a OlsF de S. proteamaculans (VENCES-
GUZMAN e cols, 2015). 
(ia) AGG72984.1- OlsA, O-aciltransferase de Sinorhizobium meliloti 2011 
MINWVRVALCGMLLVMVSLVLMPVQILCLWLDLKPRRWLPRHWHRVACLLLGLRVRVHGELDRRRPLLLSANHVSWKDILVLSSVADVVFVAKSDVK
SWPIFGLLARLQASVFVEREQKRTTGHQVNDIGRRLADGEIVVLFPEGTTSDGNRLLDIKTSLFGAAASAVPQSPTGVVHVQPLAISYTGIHGMPMG
RYHRPIAAWPGDIGLVPHLLGVLREGALEVDVDFGEAVDYDRHANRKEVSRLIGQRIRKMLSDRLRGRSRSAAKGEPAPACSAAPDIPSDAQRSRLA
P 
 
(ib) AGG72973.1 OlsB, N-aciltransferase de Sinorhizobium meliloti 2011 
MTIELLDSMGVVDTSNAYIRKAVAAPASDVLGRIANLETRLARSAAEIDAAQAVRYRVFVEEMKAQVAPDIDSWDAICDHLLVLDTSIEGDAEEQIV
GTYRLLRQDVAERTGGFYSASEFAIGELLSRHPGKRFMELGRSCVLPEYRTKRTVELLWQGNWAYEAGRRKRALKHGIDAMFGCGSFPGVVPEEHAL
ALSFLHHNVRVRDEWAVSARPELYRTMDLMPPEAINPKKALAALPPLIKGYMRLGAMVGDGAVVDQAFRTTDVLIVLPIGKISGRYLNYYGADAGRF
SSPVS 
 
(ii) WP_000953507.1- VC0489, Proteína hipotética de V. cholerae N16961 
MLSTSPFVLPRKTPFGLGEHLAEWATGLKRLNQFYAQRPASGDTQAFLRFTLDVLGIDYQVVRGKLTHVPAQGATIVVANHPLGCVEGVILAELLLC
VRSDVKILANQYLKLVPELTSLFIGVDVFEGADAAKANLHALRQAHKHLEQGGLLLMFPAGEVSQLVDSKQGRLEDKEWSQSVSRLVKKHQAHTVPV
YIDGHNSTPFYLAGKIHPMLRTLMLGRELLNKQHTQIGIAIGEGISHSEVQHLCDQQLVNYLRLNTYLLQSSPVRNKTASDRSLPPVAERLPLADLL
EDIAQLPYADHMLRHNQFDVYCTTADNIPSLMHEIGRIRELNFREVGEGTGCALDIDRFDRDYLHLFIWDREKNQLVGAYRLGLVDKLIEHKGISGL
YSSTLFHYDQRFLNNMGNAIEMGRSVIDSQYQKSMAALLLLWKGIGTYVERHPQYTHLFGPVSISNDYSEQARRLLADTMTLHYYDSEQAELVMATN
PLPTGQAQWNASLLTSLADLQLLSRVIARIDEGKGIPVLLRQYLGLNGKLVSFNVDPAFNNALDGLIVVDLRNVPTKTLARYMGQSEALRYLATHQY
FSDI 
 
(iii) WP_193842811.1- OlsF, Síntese de lipídio de ornitina (LO) de Serratia marcescens 
MFSLDSLLQDAFPHRNTPAWQRSLLRTLLFEKEFKQFAADYPHLKGLDLIEQVVDYFNLSCELVDGDLENIPSQGPVVLVANHPIGSLDGLVLLRAVAAVRPDVKVVASQLLTYIEPLRSLFVPVDNVAYKTSRKQIEGMQQQLDNQGALILFPAGEVSRMSPKGIRDGHWHTGFLRLAAKARAPIVPIHISAR
NSNLFYFTSLVYRPLSTLLLVREMFQQRGGRIKIRVGGRVPFANWHDGHTSAKDLAERFRRHVYRLGQGKPGLFASESPIALPEDRLELKKALANCE
RLGVTPDGKTIYLYRRHDEARTPILRELGRLREIAFRAVGEGSGRRRDLDSYDDDYYHLVLWDEEELEIVGAYRFIPTAEQIARKGLESIYSNSLFH
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AQFAGDNYQEDLVRLKSLLSNIGCSIPTLYKQYTELCEPGGVQFIDFGTDPAFNNCIDGLVLVDTTRLKPSRYQRYIAVHQQQPAETA 
Figura 13- (ia e ib) Sequências de aminoácidos das proteínas OlsA e OlsB, respectivamente, O-
aciltransferase e N-aciltransferase de Sinorhizobium meliloti 2011; (ii) de VC0489 de V. cholerae N16961 
e (iii) de OlsF, uma aciltransferase bifuncional de Serratia marcescens. Em azul, motivos H(X)4/5D, 
característicos das O-aciltransferases e em amarelo, motivos H(X)4D, característicos das N-aciltransferases. 
 41 
 
Em conjunto, os resultados desta análise indicam que a VC0489 tem características de uma 
transacetilase bifuncional, cuja expressão é dependente dos níveis de Pi no meio, como observado 
(Fig. 9). 
4.5 Cinética de crescimento das cepas DH5α e DH5α.pGEM.vc0489 de E. coli sob limitação 
e abundância de Pi 
 
Para verificar se a presença de LOs na membrana da bactéria influencia, de alguma forma, 
o crescimento da E. coli, células das cepas DH5α e DH5α.pGEM.vc0489 foram cultivadas em 
MGLP e MGHP, e o crescimento celular foi acompanhado por leituras da DO600nm, por 8 horas 
(Fig. 14) 
 
 
Figura 14 - Cinética de crescimento das cepas de E. coli, DH5α e DH5α.pGEM.vc0489, em MGHP e 
MGLP. Bactérias foram inicialmente cultivadas por 5 horas em meio LB (DH5α) ou LB/amp 
(DH5α.pGEM.vc0489) a 37° C até DO600nm 0,5 e então transferidas para os meios MGHP e MHLP sem 
(DH5α) ou com ampicilina (DH5α.pGEM.vc0489) como descrito no item 3.5. O crescimento, a 37° C, sob 
agitação de 200 rpm, foi acompanhado por 8 horas, com leituras da OD600nm a cada hora. 
 
 Como esperado, a taxa de crescimento na fase exponencial (aproximadamente entre 4-6 h) 
e a densidade final das culturas de ambas as cepas sob limitação de Pi (MGLP) foram menores que 
em MGHP, mas, não foram observadas diferenças nos parâmetros de crescimento das duas cepas 
 42 
 
nem MGHP, nem MGLP (Fig. 14). Portanto, a presença de LO nas células de DH5α.pGEM.vc0489 
cultivadas em MGLP não afetou o crescimento da bactéria, nas condições do experimento. No 
entanto, há evidências de que os LOs são importantes na sobrevivência de várias espécies, como 
as do gênero Vibrio, em ambientes aquáticos, onde são expostas a concentrações muito baixas de 
fosfato (PAYTAN e MCLAUGHLIN, 2007). Além disto, o fato de que cerca de 50% das bactérias, 
cujos genomas foram sequenciados, terem potencial para formar LOs é um forte argumento para a 
importância ecológica desses lipídios (VENCES-GUZMAN e cols., 2015). 
4.6 Envolvimento do sistema PhoB/PhoR na expressão de vc0489 e na síntese de LOs em V. 
cholerae 
 
A expressão do gene vc0489 sob limitação, mas não abundância de Pi (Fig. 9) e a presença 
de uma caixa Pho na região reguladora (300 bp) de vc0489, com alta similaridade a caixa Pho 
consenso do gênero Vibrio (5´TTGTCACATAAATTTCAG 3´; score > 4, considerada forte), 
centrada a -158 do códon de início da tradução do gene phoB (COSTA LEITE, 2016), sugerem 
dependência direta do sistema PhoB/PhoR (item 4.2) 
Para verificar experimentalmente se PhoB interage com a caixa Pho putativa, foi realizado 
em nosso laboratório um ensaio de retardo de mobilidade eletroforética (EMSA - Electrophoretic 
Mobility Shift Assay), no qual colaborei em algumas etapas. Para esse ensaio foi usada PhoB 
purificada de V. cholerae N16961 e um fragmento do promotor do gene vc0489 (sonda de 300 bp) 
marcado com 5´-biotina e amplificado por PCR como descrito no item 3.2.2. Para o ensaio de 
competição, à mistura da reação foi adicionado o fragmento de 300 bp não marcado (competidor), 
também obtido por PCR (item 3.2.2) (BARBOSA e cols., 2018, Anexo). 
Dados da Figura 15, mostram que PhoB se ligou à sonda de DNA contendo a região 
reguladora do gene vc0489, dando origem a uma banda retardada, no gel EMSA, que desapareceu 
quando um excesso da sonda de DNA não marcada foi adicionado à reação de ligação. 
 
 
 43 
 
 
Figura 15 - Interação de PhoB à região reguladora de vc0489 avaliada por ensaio de retardo de 
mobilidade eletroforética (EMSA). Na reação controle, fragmento de DNA.biotina livre; na reação de 
retardo, PhoB ligado ao DNA.biotina, originando uma banda de retardo correspondente a (DNA.biotina-
PhoB); na reação de competição, o DNA não marcado foi adicionado a mistura da reação (DNA.biotina + 
PhoB). Fragmento de DNA.biotina (300 bp) contendo o promotor do gene vc0489; competidor, DNA (300 
bp) não marcado contendo o promotor do gene vc0489; PhoB, proteína purificada de V. cholerae N16961. 
Adaptado de BARBOSA e cols., 2018. 
 
Neste mesmo trabalho (BARBOSA e cols. 2018), a expressão de vc0489 nas células de V. 
cholerae N16961 e WK10 (um mutante isogênico no gene phoB; VON KRÜGER e cols. 1999) 
cultivadas em MGHP e MGLP, foi analisada por PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR). Os 
resultados da análise mostraram que a expressão relativa de vc0489 em células de N16961 em 
MGLP foi cerca de 50 vezes maior que em MGHP e que em WK10, independentemente da 
condição de crescimento. 
 Além disso, em trabalho anterior de nosso grupo (GOULART e cols., 2009) foi mostrada 
substituição quase completa de PE, o principal lipídio em células de V. cholerae cepa N16961 
cultivadas em MGHP, por LOs nas células cultivadas em MGLP. Em contraste, não foi observada 
produção de LOs pelo mutante WK10 nessas condições. 
 44 
 
Em conjunto, os dados deste trabalho e os mencionados acima (GOULART e cols., 2009; 
BARBOSA e cols. 2018), confirmam que a expressão de vc0489 é dependente da privação de Pi 
extracelular e de um sistema PhoB/PhoR funcional e que a regulação de sua expressão deve 
envolver interação direta entre PhoB com a caixa Pho na região reguladora do gene, e que, portanto, 
vc0489 é um novo membro do regulon Pho de V. cholerae N16961. Ademais, eles mostraram que 
vc0489 codifica uma aciltransferase bifuncional, homóloga a OlsF de S. proteamaculans 
(VENCES-GUZMAN e cols, 2015), que catalisa a síntese de LOs apenas sob limitação, mas não 
abundância de Pi extracelular. 
5 CONCLUSÕES 
 
● O gene vc0489 de V. cholerae quando expresso em E. coli leva a produção de uma proteína 
sob limitação, mas não abundância de Pi. 
 
● Células de E. coli que carreiam o gene vc0489, sintetizam lipídios de ornitina (LOs), que 
se acumulam nas membranas da bactéria, sob limitação, mas não abundância de Pi. 
 
● A proteína VC0489 tem alta similaridade/identidade de sequência com a OlsF de Serratia 
proteamaculans, uma aciltransferase bifuncional, que catalisa a produção de LOs na espécie. 
 
● A produção de LOs pelas células de E. coli contendo o gene vc0489 não influencia o 
crescimento celular da bactéria nas condições experimentais avaliadas. 
 
● A expressão de vc0489 sob limitação de Pi depende da interação entre PhoB e uma caixa 
Pho, na região reguladora do gene. 
 
● O gene vc0489 é um novo membro do regulon Pho de V. cholerae. 
 
 
 
 
 45 
 
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 
 
ALI, M., NELSON, A.R., LOPEZ, A.L., SACK, D.A. Updated global burden of cholera in 
endemic countries. PLoS Negl Trop Dis, v. 9 (6), p. 1-13, 2015. 
ALMAGRO-MORENO, S., PRUSS, K., TAYLOR, R.K. Intestinal colonization dynamics of 
Vibrio cholerae. PLoS Pathog, v. 11 (5): e1004787, 2015. 
ALMAGRO-MORENO S., TAYLOR R.K. Cholera: Environmental Reservoirs and Impact on 
Disease Transmission. Microbiol Spectr, v. 1 (2), p. OH-0003-2012, 2013. 
BARBOSA, L.C., GOULART, C.L., AVELLAR, M.M., BISCH, P.M., VON KRÜGER, W.M. 
Accumulation of ornithine lipids in Vibrio cholerae under phosphate deprivation