Aula 3 quantificação de acidos nucleicos por espectrofotometria, e eletroforese em gel de agarose

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Disciplina: Plataformas Moleculares para as
Atividades Biológicas
Aula 3: Quanti�cação de ácidos nucleicos por
espectrofotometria, e eletroforese em gel de agarose
Apresentação
Nas aulas anteriores, isolamos os ácidos nucleicos, e nesta aula precisaremos avaliar o grau de pureza da sua preparação e
seu rendimento.
Vamos nos certi�car de que a quantidade de material presente no extrato é su�ciente para realizar a reação de PCR e, de
fato, corresponde apenas ao RNA ou DNA de interesse, livre de possíveis contaminações.
Depois de ampli�carmos exponencialmente o número de cópias do alvo, precisaremos conferir se o seu produto de PCR está
de fato presente, e se corresponde efetivamente ao alvo, e não a uma ampli�cação inespecí�ca. Por �m, garantiremos que o
amplicon de interesse está presente de forma exclusiva na preparação, e não associado a outros produtos de PCR.
Bons estudos!
Objetivos
Discutir os princípios da quanti�cação de ácidos nucleicos;
Analisar o fundamento da técnica de eletroforese;
Correlacionar o resultado das técnicas com limitações e di�culdades com as metodologias de extração e PCR.
Espectrofotometria
Nas aulas anteriores, você aprendeu duas técnicas que são o coração da Biologia Molecular. Tanto a extração de ácidos nucleicos
quanto a PCR são os passos iniciais para qualquer desdobramento da investigação laboratorial.
Para garantir uniformização nos experimentos, até mesmo para �ns de comparação de resultados, o ideal é quanti�car a matéria-
prima destinada a PCR. Se todas as reações partirem da mesma quantidade de ácido nucleico, seja ele DNA ou RNA,
eliminaremos a possibilidade de erro ou viés em seus resultados.
 Bristol Robotics Laboratory, Reino Unido |Foto: Louis Reed on Unsplash
Mas, outras possibilidades de erro podem ser introduzidas se o PCR não estiver bem estabelecido no laboratório.
Já imaginou se os primers forem complementares a outras regiões além do alvo?

Isso implicaria em amplicons especí�cos e inespecí�cos no tubo de PCR.
Após executar a extração de ácidos nucleicos, é necessário avaliar o rendimento e o grau de pureza do método. Desse modo, é
importante quanti�car e analisar a qualidade das moléculas de DNA/RNA, descartando a presença de contaminantes, como
proteínas, por exemplo.
Uma forma simples de executar essa avaliação é por meio de espectrofotometria.
Trata-se de uma técnica analítica de mensuração, que leva em conta a absorção ou transmissão de luz pela matéria que está
sendo investigada, após sua interação com a radiação eletromagnética. Ela baseia-se no princípio de que quando um feixe de luz
monocromática incide em uma solução, parte da luz é absorvida, enquanto a outra parte é transmitida.
De acordo com a Lei de Lambert-Beer, a absorção de luz depende justamente da concentração de moléculas absorventes que
estejam presentes e da espessura da solução, conforme ilustra a �gura a seguir.
 Absorção de luz | Ilustração:Roberto Bindes Jr
Absorbância e transmitância
A absorção de luz pela matéria envolve a incorporação da energia contida no fóton à estrutura das moléculas absorventes, de
modo que os elétrons saem de um estado fundamental para um estado excitado. No retorno ao estado fundamental, a energia é
liberada na forma de calor ou luz visível, a qual possui diferentes comprimentos de onda.
Dessa forma, a intensidade da cor de uma solução é proporcional à concentração das moléculas absorventes de luz que a
compõem. Quanto mais concentrada for a solução, maior será a absorção de luz. Entretanto, é a luz transmitida que determina a
cor da solução.
Observe esse processo na �gura a seguir.
 Porque as soluções são coloridas
O equipamento
Para avaliar os parâmetros colorimétricos e avaliar as concentrações das soluções, devemos utilizar um aparelho conhecido
como espectrofotômetro. Para isso, basta seguir o passo a passo:
1
Diluir a amostra
2
Aplicá-la em uma cubeta feita de material transparente,
normalmente quartzo
3
Inseri-la no equipamento para a leitura
 Espectrofotômetro | Fonte: Choksawatdikorn / Shutterstock
Os espectrofotômetros possuem, principalmente, além de uma
fonte de luz, um prisma que dispersa a luz incidente (branca)
nas cores do espectro visível (de 380nm a 750nm) antes de ela
atingir a cubeta onde a amostra está repousada. Após a
cubeta, e do lado oposto à fonte incidente, há um detector
sensível à radiação luminosa, que avalia a transmitância dessa
amostra — ou seja, a radiação que não é absorvida — a qual é
inversamente proporcional a sua concentração. O aparelho
fornece resultados numéricos de absorbância, ou densidade
ótica (DO), os quais são determinados pela relação entre luz
incidente e luz transmitida. 
Esquema de um mecanismo simplificado de espectrofotometria | Fonte: Extender_01 /
Shutterstock
Na rotina laboratorial
Enquanto nucleotídeos e ácidos nucleicos (seja RNA, ou DNA �ta-simples e dupla-�ta) absorvem luz no comprimento de onda (λ)
de 260 nm, as proteínas absorvem luz no λ de 280nm.
Isso faz com que a razão A /A forneça pistas quanto à contaminação por proteínas ou outros contaminantes, como o
fenol.
Estabelece-se que valores inferiores a 1,8 indicam má qualidade da sua preparação de DNA. Se o extrato de DNA apresenta razão
maior do que 2, indica que o mesmo está contaminado com RNA.
Além disso, preconiza-se que 1 DO = 40µg de RNA �ta simples ou 50µg de DNA �ta dupla em 1 mL de amostra. Tendo em vista
essa relação, e conhecendo a diluição da amostra aplicada na cubeta, �ca fácil calcular a concentração do DNA/RNA. Basta
seguir as fórmulas:
260nm 280nm
[DNA (µg/µL)] = Valor da leitura em DO X 0,05 µg X Fator de diluição
[RNA (µg/µL)] = Valor da leitura em DO X 0,04 µg X Fator de diluição
260nm
260nm
Vamos a um exemplo prático?
Exemplo
Imagine que você vai quanti�car uma amostra de DNA. Inicialmente, é necessário diluir sua amostra. Supondo que você dilua
10uL de DNA em 990uL de água pura.
Você sabe dizer qual foi o fator de diluição?
A resposta é fácil! Você tem 10uL de DNA em um volume �nal de 1000uL (10 + 990). Ou seja, isso corresponde matematicamente
a 10/1000 = 1/100. Ou, ainda, 1:100. Logo, seu fator de diluição equivale a 100.
Você transfere esse volume para uma cubeta de espectofotômetro, e observa o valor da leitura da DO
Supondo que o valor obtido seja 0,080, qual seria, então, o valor da concentração
de DNA em µg/µL?
Basta aplicar a fórmula:
[DNA (µg/µL)] = Valor da leitura em DO X 0,05 µg X Fator de diluição 
[DNA (µg/µL)] = 0,080 X 0,05 µg X 100 = 0,4 µg/µL
260nm.
260nm
Atividade
1. UFES (2011): O espectrofotômetro é um instrumento que permite:
a) Avaliar a turbidez de amostras de água.
b) Analisar o espectro de radiações em soluções orgânicas.
c) Analisar o espectro de radiações em soluções básicas.
d) Analisar o espectro das radiações de soluções ácidas.
e) Comparar a radiação absorvida ou transmitida por uma solução.
Eletroforese em gel de agarose
Após realizar a PCR para o alvo genômico, é preciso conferir se o produto de interesse está de fato presente no volume �nal da
reação. Além disso, é necessário con�rmar que houve apenas ampli�cação do alvo de interesse, e que não existem amplicons
diferentes no tubo de reação.
Como você procederia?
A resposta é muito simples! Você pode realizar uma corrida eletroforética em gel de agarose.
Vejamos como realizar esse procedimento.
A agarose
A agarose é um polissacarídeo extraído da parede celular de algumas algas marinhas.
Após hidratação em uma solução tampão, fusão e, em seguida, resfriamento à temperatura ambiente, assume uma consistência
de gelatina resistente. A forma que essa gelatina vai assumir depende da cuba em que �cará repousando até atingir o
esfriamento, conforme ilustra a �gura a seguir.
Você pode preparar o gel com a consistência que quiser,
variando a concentração da agarose, dependendo do objetivo.
A �nalidade do gel é funcionar como uma malha para retenção
das moléculas de interesse de acordo com os seus
respectivos tamanhos:
1 Géis mais concentradoslevarão à formação de tramas mais apertadas e, portanto, poros menores.
2 Géis mais frouxos levarão à formação de tramas mais largas e, portanto, poros maiores.
Preparo do gel de agarose | Fonte: Rattiya Thongdumhyu / Shutterstock
Com isso, a concentração escolhida in�uenciará diretamente na e�ciência de separação das moléculas.
Mas, como utilizar esse gel para a nossa �nalidade?
Imagine que você possa aplicar o seu produto de PCR nesse gel, que vai funcionar como uma peneira, separando todos os
amplicons ali existentes em função do seu tamanho e carga elétrica.
Como você aplicaria as amostras nesse gel? 
Como as amostras podem ser separadas? 
Como você pode visualizar o resultado?
Vamos continuar acompanhando o procedimento.
A aplicação no gel
Para aplicar as amostras no gel, é necessário que você faça poços (slots) nos quais você irá depositá-las. Para isso, basta
introduzir um pente, que vai funcionar como molde, na agarose ainda quente. Após a solidi�cação do gel e remoção desse pente,
você já tem todas as cavidades necessárias, prontas para serem preenchidas. Observe a �gura a seguir.
Pentes para gel de agarose | Fonte: Rattiya Thongdumhyu / Shutterstock
Outra di�culdade é a aplicação das amostras. Esses poços são pequenos, e a reação de PCR costuma ser incolor, com uma
viscosidade semelhante à água.
Imagine a di�culdade para a pipetagem de um líquido transparente, semelhante à água, nesse poço! Para contornar esse desa�o,
existem tampões de amostra , que podem ser disponíveis comercialmente, ou manufaturados no laboratório.1
Esses tampões de amostra são compostos por corantes como
azul de bromofenol e xileno cianol, que ajudam a tornar a
amostra visível para a aplicação — tornando-a colorida —, além
de glicerol ou �col, que aumentam a densidade da amostra,
facilitando a sua entrada, por gravidade, nos poços.
Aplicação de amostra no gel de agarose | Fonte: Rattiya Thongdumhyu / Shutterstock
Fonte de corrente elétrica
http://estacio.webaula.com.br/cursos/go0072/aula3.html
Agora que as amostras já estão aplicadas, como separá-las?
Lembra-se de que o gel solidi�cou dentro de uma cuba?
Devemos, então, seguir o procedimento:
1
Após o gel ter polimerizado, e estar homogêneo e translúcido,
devemos banhá-lo em uma solução tampão, normalmente o
Tris-acetato EDTA (TAE) ou Tris-borato EDTA (TBE). Esses
tampões servem para manter os ácidos nucleicos protegidos
da degradação enzimática.
2
Em seguida, basta ligar a cuba a uma fonte de corrente
elétrica, forçando a migração dos amplicons presentes na
amostra pelos orifícios da trama do gel.
Como isso é possível?
Você se lembra de que comentamos na aula 1 que o DNA possui grupamentos fosfato
que têm carga negativa?
Em pH neutro ou alcalino, podemos assumir que esses grupamentos conferem ao DNA carga negativa. Dessa forma, se
aplicarmos uma corrente elétrica a essa cuba, o DNA será forçado a migrar do polo negativo (catodo) para o polo positivo (anodo),
para o qual será atraído, conforme ilustra a �gura a seguir.
Esquema simplificado da eletroforese | Fonte: WATSON; BAKER; STEPHEN; GANN;
LEVINE; LOSICK, 2015.
Após a PCR a amostra pode ter diferentes amplicons
presentes, não só aqueles relacionados ao alvo, mas também
os inespecí�cos. Dessa forma, eles poderão migrar com maior
ou menor facilidade, em função dos seus respectivos
tamanhos, que podem ser medidos em função do número de
pares de base (pb).
Interpretando a corrida
Produtos de PCR menores (mais curtos
em pb)
Percorrem o gel primeiro, ou seja, alcançam mais
rapidamente o limite do gel, em direção ao polo positivo.
Produtos de PCR maiores (mais longos
em pb)
São retardados na malha do gel, �cando posicionados
mais próximos ao polo negativo.
Você se lembra de que o loading dye possui dois corantes?
Eles também serão úteis no monitoramento da corrida eletroforética.
Além de não interferirem no per�l de corrida da amostra, os corantes servem para monitorar a velocidade com que os amplicons
migram.
 O azul de bromofenol tem comportamento semelhante a produtos de PCR de 300 bp, o xileno cianol de 4000 bp.
 O corante Orange G migra como os fragmentos menores de aproximadamente 50 bp.
Dado que todos os amplicons estão submetidos à mesma corrente elétrica, e possuem a mesma distância passível de percorrer,
correspondente ao comprimento do gel, você consegue observar macroscopicamente a migração dos corantes, e ter uma ideia
da localização do seu produto de interesse, conforme ilustra a imagem a seguir.
 Perfil de corrida eletroforética dos corantes do tampão de amostra | Fonte: Rattiya Thongdumhyu / Shutterstock
Dessa forma, diminui o risco de errar no tempo estimado da corrida eletroforética, e perder o produto de PCR. Mas, para isso, você
precisa conhecer bem o seu alvo e, consequentemente, sua extensão de ponta a ponta em pb, ou seja, a sua extensão de primer
direto a reverso do seu amplicon.
Além disso, é necessário incorporar ao seu gel uma amostra conhecida como padrão de peso molecular, para a qual deve ser
reservada um poço individualmente.
Trata-se de uma amostra que funciona como referência, composta por fragmentos de DNA de diferentes tamanhos — que são
indicados na bula fornecida pelo fabricante —, e que serve para ajudar a estimar o tamanho aproximado em pb do produto de
PCR, e conferir se, de fato, corresponde ao alvo.
Revelação do resultado
É necessário revelar o resultado e, para isso, usamos um corante chamado brometo de etídio (EtBr), que atua como intercalante
de DNA, e que é excitável por luz ultravioleta (UV). Você pode aplicá-lo diretamente no gel, antes da polimerização, ou após a
corrida, com um banho de imersão. A quantidade de DNA presente será proporcional à quantidade de �uorescência emitida.
Atenção
Embora seja mais utilizado que os demais, o EtBr é tóxico. Dessa forma, existem algumas alternativas como a coloração por
GelRed, GelGreen e o SYBR Safe®, que são menos tóxicos, mas que apresentam diferentes sensibilidades e termoestabilidades.
Após a coloração �nal, basta expor o gel a um transiluminador de luz UV — ou luz azul, dependendo do corante escolhido — e
captar uma foto através de uma câmera digital.
Na presença de amplicons, você verá bandas que assumirão o formato do poço que você preparou e poderá con�rmar se as
bandas que serão reveladas correspondem ao produto de PCR através de comparação com o padrão de peso molecular. Observe
a imagem a seguir.
 Exposição do gel de agarose à luz UV | Fonte: Kallayanee Naloka / Shutterstock
No caso de moléculas de RNA, é necessário adaptar a corrida eletroforética. Como o RNA se apresenta na forma de �ta-simples e
tende a formar estruturas secundárias, é ideal acrescentar ao seu gel um agente desnaturante, como o formaldeído, para garantir
que as moléculas permaneçam �ta-simples
Atividade
2. HCFMUSP (2015): A eletroforese em gel de agarose separa as moléculas de DNA em função da sua forma e compactação.
Essa técnica é rápida, sensível e precisa. Moléculas de DNA de um mesmo tamanho migram com diferentes velocidades se
estiverem na forma circular relaxada, linear ou supertorcida. O DNA pode ser visualizado na presença de compostos intercalantes
como:
a) Azul de bromofenol.
b) Brometo de etídio.
c) Corante leishman.
d) Corante fucsina.
e) Corante azul cresil brilhante.
3. UFVJM-MG (2017): As técnicas de eletroforese são usadas para a separação e análise de amostras de biomoléculas. Essas
técnicas diferenciam trechos de amostras que migram por um campo elétrico em um gel. Essas técnicas são utilizadas para as
seguintes biomoléculas:
a) Proteínas e lipídeos.
b) Lipídeos e carboidratos.
c) Carboidratos e ácidos nucleicos.
d) Ácidos nucleicos e proteínas.
e) Nenhuma das respostas acima.
Um pouco mais de conhecimento
Atualmente, existem espectrofotômetros mais sensíveis e especí�cos, como os do tipo NanoDrop®. Esses equipamentos
dispensam a necessidade de diluição da amostra, e fornecem, de forma acurada, quantidades de ácido nucleico baseadas em 1-2
uL de amostra.Possíveis fatores, na eletroforese, que interferem na migração de moléculas através de um gel de agarose:
1
A concentração de gel estabelecida previamente — uma vez
que ela vai re�etir no intervalo de tamanho de moléculas que
podem ser separadas.
2
A conformação das moléculas de ácido nucleico — que podem
implicar na necessidade de um gel desnaturante.
3
A intensidade da corrente elétrica aplicada à cuba de
eletroforese.
É possível utilizar o gel de agarose para obter estimativas aproximadas de rendimento, uma vez que a intensidade das bandas e,
consequentemente, a intensidade da �uorescência, são um indicativo de maior ou menor quantidade de DNA. Para isso, basta
acrescentar um padrão chamado Low DNA Mass Ladder®, que corresponde a uma amostra contendo seis fragmentos de DNA,
cuja intensidade de �uorescência é crescente.
Cada banda tem uma quantidade de DNA em µg predeterminada, e que é fornecida pelo fabricante. Correndo o Low Mass em
paralelo ao padrão de peso molecular e às amostras, você consegue não só ter uma ideia do tamanho do seu amplicon em pb,
como também uma noção da quantidade de DNA ali existente.
Atividade
4. IFB (2016): A técnica de eletroforese permite separar fragmentos de proteínas e ácidos nucleicos por tamanho e carga elétrica.
Com base na �gura a seguir, que representa uma corrida de eletroforese de DNA, marque a alternativa correta:
a) Os fragmentos maiores de DNA migram mais rápido do que os fragmentos menores, devido ao seu alto peso molecular.
b) A utilização do Marcador Molecular é indicada para auxiliar na estimativa da concentração dos fragmentos de DNA que aparecerem no
gel.
c) A coloração é feita por um corante intercalante de DNA que tem afinidade com as ligações fosfodiéster da referida molécula.
d) A migração das amostras ocorre no sentido do polo negativo (–) para o polo positivo (+), por causa da carga negativa do fosfato
localizado no nucleotídeo de DNA.
e) Os fragmentos menores de DNA migram mais rápido do que os fragmentos maiores, pois se aderem mais facilmente aos íons do
tampão utilizado na eletroforese.
5. IF Farroupilha – RS (2016, Adaptada): A análise de DNA engloba uma série de procedimentos, sendo a eletroforese uma das
técnicas utilizadas para separação dos seus fragmentos. Analise as a�rmativas a seguir: 
 
1 -Bandas podem ser observadas na luz ultravioleta.
2 -Ampli�cação do ácido nucleico através de PCR.
3 -DNA é extraído e puri�cado, eliminando proteínas e RNA.
4 -Padrões de tamanho conhecido são inseridos para comparação.
5 -Fragmentos de DNA, com carga negativa, migram para o polo positivo.
6 -Amostras são colocadas em um gel no qual se aplica um campo elétrico.
 
A sequência da realização da etapa de eletroforese é:
a) 6, 2, 1, 4, 5, 3.
b) 6, 4, 3, 2, 5, 1.
c) 5, 1, 4, 2, 3, 6.
d) 5, 2, 3, 1, 4, 6.
e) 1, 2, 3, 5, 4, 6.
Notas
Tampões de amostra 1
Também conhecidos como loading dyes.
Título modal 1
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tipográ�ca e de impressos.Referências
ALBERTS, B; JOHNSON, A; LEWIS, J.; RAFF, M.; WALTER, P.; ROBERTS, K.; MORGAN, D. Biologia Molecular da Célula. 6.ed. Porto
Alegre: Editora ArtMed, 2017.
BIANCO, B.; LIPAY, M.V.N. Biologia Molecular – Métodos e Interpretação. 1.ed. São Paulo: Roca, 2015.
COMPRI-NARDI, M.; STELLA, M. B.; OLIVEIRA, Carolina de. Práticas de laboratório de bioquímica e biofísica. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2009.
MENCK, C. F. M.; SLUYS, M-A. V. Genética Molecular Básica: dos Genes aos Genomas. 1.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,
2017.
WATSON, J. D.; BAKER, T. A.; STEPHEN, P. B.; GANN, A.; LEVINE, M.; LOSICK, R. Biologia Molecular do Gene. 7.ed. Porto Alegre:
Editora ArtMed 2015
Editora ArtMed, 2015.
ZAHA, A.; FERREIRA, H. B.; PASSAGLIA, L. M. P. (Org.). Biologia Molecular Básica. 5.ed. Porto Alegre: Editora ArtMed, 2014.
Próxima aula
Estudo de expressão de RNAm;
Limitações e di�culdades da técnica de qPCR;
Analogia com processos de transcrição e processamento de RNAm.
Explore mais
Assista aos vídeos:
Introdução à espectrofotometria. <https://www.youtube.com/watch?v=F5dCva8fnDg>
Eletroforese em gel. <https://www.youtube.com/watch?v=B2KLuzD_suQ>
https://www.youtube.com/watch?v=F5dCva8fnDg
https://www.youtube.com/watch?v=B2KLuzD_suQ