Estudo dirigido - PCR

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Lara Honório – Acadêmica de Medicina
Estudo dirigido – Genética: PCR
1.No processo de extração de DNA/RNA qual o papel da solução de lise?
Tem fundamental importância para o rompimento da membrana plasmática e outras estruturas do tipo membranas com o intuito de liberar os componentes citoplasmáticos e nucleares da célula. Dentro da solução, o papel do detergente é desestruturar as moléculas lipídicas dessas membranas enquanto o sal faz com que o ambiente esteja favorável para a remoção do DNA e assim neutraliza a carga negativa do grupo fosfato.
 
2.Após a separação do DNA de todos os outros componentes celulares qual o procedimento realizado para tirar o DNA de solução e transferi-lo para um novo microtubo?
Posteriormente a lise utilizando a solução de detergente e sal se adiciona o etanol em temperatura fria/gelada e é isso que faz com que o DNA permaneça unido. O próximo passo é a centrifugação da mistura onde o objetivo já é a separação do DNA, que precipita. Vemos um experimento demonstrado de forma bifásica onde o álcool fica em cima com o sal. É retirado o álcool e colocado água e essa extração é feita com auxílio de uma pipeta.
3.Após a extração de DNA quais técnicas podem ser utilizadas para qualificação e quantificação? Explique essas técnicas.
A técnica de espectrofotômetro é usada para medir o DNA qualitativamente e quantitativamente. Esse aparelho mede a quantidade de luz absorvida pela solução e identifica a concentração de substâncias que são capazes de absorver energia radiante em um solvente. A técnica do espctrofômetro é de exclusividade para determinação de DNA e exige que haja um padrão comparativo para tal amostra.
Já a técnica de eletroforese coloca o DNA no gel e em seguida no campo elétrico, separa biomoléculas e as separa por tamanho, forma e carga elétrica. O gel de agarose é a substância usada no processo, ele é aquecido e depois esfriado polimerizando e endurecendo. A migração do DNA acontece do polo negativo para o positivo e segue quatro etapas: preparação da amostra e do gel > aplicação do gel >eletroforese >coloração do gel > fixação > registro/documentação. É importante salientar que quando o DNA é exposto ao campo e faz a migração, isso ocorrerá para o eletrodo na velocidade proporcional a forca exercida pelo campo. Portanto, moléculas leves são rapidamente processadas enquanto as pesadas vão migrar devagar. É a concentração do gel quem determina o tamanho dos poros e o gel, quanto mais concentrado, maior a resistência à migração celular.
4.O que é eletroforese?
Técnica que permite a separação de substâncias de cargas diferentes que compõem uma mistura em um determinado valor de pH. Deve-se Coloca o material poroso em contato com a substância tampão, liga a uma fonte de ddp que faz acontecer a geração de um eletrodo de carga positiva e um de carga negativa. Uma cuba tem carga elétrica positiva e na outra a carga negativa. No material poroso aplica-se a mistura de AA (que tem cargas diferentes) com uma pipeta. O AA de carga positiva em uma cuba negativa será atraído e migra pro polo negativo. O AA de carga negativa em uma cuba será atraído para a cuba de carga positiva. É importante lembrar que, se o AA não tiver carga, ele não migra para nenhum dos polos. Portanto, por eletroforese só se separa substâncias de uma mistura com cargas diferentes.
 
5.Por que na eletroforese o DNA migra para o polo positivo?
Pelo fato de que o DNA tem carga negativa.
6.Por que após a eletroforese as moléculas menores de DNA ficam mais abaixo no gel?
A retenção das moléculas no gel faz com que surjam as bandas, o peso molecular acaba sendo diferente então quanto menor for o fragmento, mais rápido ele vai fazer a migração para se aproximar do eletrodo.
7.Quais são os componentes da replicação do DNA in vivo que diferem da reação PCR?
Para a replicação são utilizadas algumas enzimas de extrema relevância como a helicase, que separa a fita dupla; girasse ou topoisomerase, que estabiliza o lado do DNA que não está sendo aberto; ligase, que liga os fragmentos de okazaki; primase, que irá formar os primers. Já no processo da técnica de PCR as enzimas são substituídas por outros agente. Há uma substituição por calor para separar as pontes de hidrogênio e dessa forma abrir o DNA e a única que precisa ser feita de forma laboratorial é a primase, ademais, todas são dispensáveis.
8.Quais são as três etapas da reação? O que acontece em cada uma delas?
1- Melting/desnaturação: separação da fita dupla do DNA, que seguirá integro devido as suas ligações covalentes;
2- Annealing/anelamento/hibridização: ligação do primer ao DNA que se deseja ampliar;
3- Extension ou extensão: polimerização.
9.Porque precisamos de utilizar DNA polimerases de bactérias termófilas?
As bactérias termófilas, que são nomeadas de Tag polimerases, resistem a altas temperaturas (calor) e são mais reativas enquanto que as DNA polimerase dos seres humanos resistem até 37°, sendo necessária a utilização da TAG.
10.Por que a PCR precisa acontecer em ciclos?
Porque a replicação do DNA na técnica de PCR é feita exponencialmente, se trata de uma reação em cadeia que irá se repetir por 30 vezes.
11.Cite todos as diferenças entre a PCR convencional e a PCR Real Time.
Suas discrepâncias giram em torno dos fatos de que a PCR real time não tem manipulação pós-PCR, apresenta resultados quantitativos, pede menores concentrações de DNA e tem o tempo da reação reduzido, tem maior reprodutibilidade, sensibilidade e precisão, e, por fim, faz uso de uma 3° sonda fluorescente.
12.Cite três aplicações da PCR na medicina. Requer resposta. 
Fundamental para fechar diagnóstico de câncer no colo do útero por HPV, por exemplo; diagnóstico de covid 19 (SARS-CoV-19; Realização do exame de sexagem fetal após 8° semana de gestação.