As amostras obtidas para serem testadas em laboratório

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As amostras obtidas para serem testadas em laboratório são muito
sensíveis e podem degradar com relativa facilidade. Assim, esse
material deve ser guardado de forma adequada até o momento de
ser submetido à extração do DNA. Amostras de sangue e de outros
tecidos animais devem ser refrigeradas até chegarem ao laboratório
para realização dos testes. Para que se realizem os testes de
amplificação de DNA por meio da técnica de reação em cadeia da
polimerase (PCR), as amostras devem ser mantidas sob baixas
temperaturas, variando de –20°C a –80°C, dependendo do tempo
de armazenamento. Para utilização de amostras conservadas em
estoque (amostra em grande volume), é interessante que se realize
o fracionamento em pequenas alíquotas, ou seja, separar uma
“amostra maior” em pequenas amostras, para que o material não
sofra descongelamentos sucessivos. O fato de congelar e
descongelar diversas vezes sua amostra contribui para a oxidação
do tecido e para a degradação do DNA, perdendo o material. O
manuseio dessas amostras deve ser feito com o uso de luvas, para
que os ácidos nucleicos não sejam degradados por enzimas
denominadas “nucleases”, que estão presentes no corpo humano,
principalmente nas mãos das pessoas. Alguns cuidados devem ser
tomados durante e após a extração do material genético como o
DNA, separando um espaço isolado somente para essa finalidade.
Salas e ambientes separados e climatizados para a extração do DNA
são essenciais, sendo que as extrações devem ser trabalhadas em
Eppendorfs, pequenos tubos de material plástico (polipropileno)
esterilizados ou preferencialmente novos (não deve ser usado
material reciclado), para que as amostras não apresentem
contaminações durante suas análises. Ultimamente, os laboratórios
procuram comprar Eppendorfs RNASE e DNASE free, para não
correrem o risco de degradação do material genético
OBTENÇÃO DE AMOSTRAS PARA
EXTRAÇÃO DE DNA
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Digestão da amostra
 As amostras de tecidos que são submetidas à extração de DNA
passam pelo processo de fragmentação e digestão enzimática das
proteínas. Para isso, as amostras são homogeneizadas ou
quebradas e submetidas ao congelamento em nitrogênio líquido e
rapidamente devem ser “amassadas ou trituradas” manualmente
(utilizando-se um bastão). Essa fase é importante para que ocorra o
rompimento das paredes celulares e membranas plasmáticas, cujo
material obtido seria uma mistura de componentes celulares como:
DNA, RNA, proteínas, carboidratos e lipídios. Pequenas quantidades
da amostra (200 mg até 1 g) são adicionadas a uma solução-tampão
de digestão (na quantidade proporcional de 1,2 mL de solução
tampão para cada 100 mg de tecido) e colocadas em condições de
banho-maria, em temperatura próxima a 50°C, para que aconteça a
digestão. O tempo de incubação pode variar entre 8 e 12 horas, ou
até que a amostra encontre-se totalmente digerida. Esse fato
acontece quando a amostra apresenta um aspecto viscoso. Assim,
essa parte experimental dura mais do que um dia, devendo o
profissional se preparar para gastar esse tempo nos referidos
testes. 
Extração do DNA com fenol – purificação do DNA por meio de
precipitação com etanol O método mais utilizado para que ocorra a
purificação do DNA é a extração com fenol provocando a
desnaturação de proteínas de modo eficiente. O fenol não é solúvel
em água, fazendo com que, quando agitado com o devido extrato a
ser testado, origine duas camadas, sendo que as proteínas
desnaturadas se precipitam na interface do tubo. Após a extração
de proteínas, os ácidos nucleicos são precipitados, concentrando a
amostra e eliminando todo o fenol que posteriormente poderia
desnaturar as proteínas nos próximos passos Dessa forma, para
extrair o DNA de plantas e animais, usa-se primeiramente o fenol, no
qual há a separação da camada aquosa (que contém DNA e RNA),
uma interface (que é a proteína) e a camada de fenol bem abaixo da
proteica. Em seguida, após obter-se as três camadas, adiciona-se
etanol + solução salina obtendo uma configuração homogênea,
seguida por centrifugação. Após a centrifugação consegue-se o
DNA precipitado, que é então quantificado.
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Leitura da concentração de DNA das amostras 
As variadas amostras de DNA obtidas e analisadas em laboratório
podem ser avaliadas com relação à sua concentração e pureza por
meio da análise da densidade óptica (DO) com a leitura em
espectrofotômetro. O DNA consegue absorver luz em comprimento
de onda de 260 nm, no entanto, a leitura das proteínas ocorre em
280 nm. As amostras de DNA são preparadas em diluições diversas,
também lidas em espectrofotômetro. A relação entre a quantidade
de DNA e de proteína é usada como parâmetro para avaliar a
qualidade do DNA extraído. Assim, quando valores dessa relação
são inferiores a 1,8 apresentam contaminação com proteínas. O DNA
é facilmente quantificado e analisado quanto à sua qualidade, pela
análise de gel de agarose 1%.
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