Replicação do DNA

Prévia do material em texto

Ana Victoria Soares 2021.1 
 
Ana Victoria Soares 2021.1 
 
REPLICAÇÃO DO DNA 
 
 
Motivo para replicar: 
O principal motivo que faz a célula se duplicar é a 
divisão celular. 
 
A replicação é um processo semiconservativo, ou seja, 
conserva metade da fita velha de DNA. 
A fita velha se abre e, a partir da abertura de fitas velhas, 
uma delas é usada como fita molde para que a partir 
delas, sejam feitas novas fitas de DNA. 
 
É a partir disso que se consegue realizar 
estabelecimento de vínculos genéticos entre indivíduos. 
Ex: teste de paternidade. 
 
Como o processo é iniciado: 
Isso diverge de organismo para organismo. Em seres 
mais primitivos como as bactérias que tem o DNA 
menos complexo quimicamente e estruturalmente, 
circular, possui um ponto inicial de replicação, um 
ponto específico. 
No caso de espécies que são mais novas evolutivamente 
e que tem maior quantidade de material genético e de 
maior complexidade, são encontradas múltiplas 
origens de duplicação. 
Então, a duplicação sempre vai começar em locais 
conhecidos como “origens de replicação”. Na espécie 
humana, essas origens estão distribuídas por todo o 
DNA. 
Nas origens de replicação existe uma grande 
quantidade de Adenina e Timina, já que entre essas 
duas bases existem duas pontes de hidrogênio. As 
origens de replicação são locais que precisam ser 
abertos para molécula se replicar, portanto, precisa que 
essas ligações sejam mais fracas e que esses locais 
possuam uma maior tendência a abrir. Com a quebra e 
consequentemente afastamento das bases, são 
formadas “bolhas de replicação.” 
Quando essas bolhas vão se conectando umas as outras 
e aumentando, elas dão origem as forquilhas de 
replicação – estruturas bifurcadas. 
O processo de replicação precisa obedecer uma 
cronologia, tem que ter um passo a passos e eles 
precisam acontecer no momento certo. 
 
O primeiro passo é a abertura da fita dupla de DNA. 
ABERTURA DA FITA DE DNA: 
 
Para que esse processo de abertura ocorra, é necessário 
um repertório enzimático. 
A primeira enzima é a DNA HELICASE, enzima 
responsável por desfazer a dupla hélice 
A enzima, nada mais é do que uma molécula que vai 
promover a quebra das pontes de hidrogênio entre as 
bases nitrogenadas das fitas complementares. Essas 
fitas apesar de serem complementares, são 
independentes, conectadas por pontes de hidrogênio. 
Quando essas pontes de hidrogênio são quebradas, as 
fitas vão se separar, sendo esse justamente o principal 
objetivo da enzima – abrir para que cada pedaço da fita 
seja usado como um molde. 
O grande problema é que a molécula de DNA é muito 
sensível, fina e susceptível a quebra. 
 
TOPOISOMERASE: grupo de enzimas, tendo a 
principal delas a GIRASE. 
A girase vai atuar desenrolando a molécula de DNA e, 
consequentemente, ela vai aliviar a tensão que é gerada 
nesse ponto, relaxando a dupla fita no momento em que 
ela ta sendo tensionada pela helicase. 
Existem alguns tipos diferentes de girasse que 
executam tarefas diferentes nesse processo. 
As proteínas ligadoras de fita simples são 
importantíssimas no processo de abertura, elas atuam 
mantendo as fitas separadas. Quando são abertas, as 
fitas se separam das bases na medida em que as pontes 
de hidrogênio são quebradas. Para impedir que ocorro 
o desalinhamento, elas se ligam a proteínas ligadoras de 
fitas simples para manter as fitas abertas. 
 
Ana Victoria Soares 2021.1 
 
Ana Victoria Soares 2021.1 
 
 
 
DNA POLIMERASE: 
 
A fita azul é a fita velha, fita mãe; e a fita vermelha é a 
fita nova que ta sendo polimerizada pela DNA 
polimerase. 
A DNA polimerase vai pegar um nucleotídeo e ligar ao 
outro, estabelecendo entre eles uma ligação 
fosfodiester, que é a ligação do fosfato de um 
nucleotídeo com a pentose (açúcar) do outro. 
Características importantes da enzima: 
Enzima que catalisa a adição de nucleotídeos á 
extremidades 3’ de uma fita de DNA; 
Precisa de um molde – a cadeia molde complementar; 
Mecanismo de polimerização é no sentido 5’->3’; 
Incapaz de fazer DNA do zero (precisa ter extremidade 
3’OH livre) – Porém, só tem OH livre na molécula de 
RNA. Ou seja, a DNA polimerase precisa da molécula 
de RNA para continuar o seu processo. 
Possui mecanismo de correção de erros no sentido 3’ 
->5’. 
 
A enzima primase sintetiza um PRIMER (molécula 
uniciadora de 10 nucleotideos) de RNA para que a DNA 
polimerase consiga se ligar a OH livre. 
Ao final do processo de replicação, esse primer e 
removido e ficam só moléculas de DNA. 
 
A enzima DNA-polimerase só sintetiza na direção 5’-3’ 
As fitas são antiparalelas e a enzima só funciona no 
sentido 5’-3’. Esses dois fatores justificam o processo ser 
unidirecional. 
 
A fita de baixo vai ser fragmentada, são formados os 
fragmentos de Okazaqui causados pela replicação 
descontinua, formando espaços chamados GAPs, que 
são unidos a partir da DNA ligase ao final do processo, 
formando uma fita contínua. 
OBS: 
A replicação ocorre na interfase do ciclo celular 
A replicação é simiconservativa 
É um processo bidirecional 
Envolve várias enzimas 
 
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) 
É um método in vitro de replicação de DNA, ou seja, 
acontece em tubos de ensaio em que se é possível fazer 
a replicação do DNA sem o processo de mitose. 
Amplifica sequências específicas de DNA 
Processo realizado em vários ciclos com diferentes 
temperaturas. 
 
Ana Victoria Soares 2021.1 
 
Ana Victoria Soares 2021.1 
 
A reação de PCR é dividida em 3 etapas. 
1 FASE – DESNATURAÇÃO: 
Na desnaturação, ocorre a separação das pontes de 
hidrogênio. Não confundir esse processo de 
desnaturação com o de desnaturação proteica, 
Aquecimento a mais de 90 graus para separação da 
dupla fita 
Separa tanto a fita de DNA original quanto os produtos 
da amplificação. 
As pontes de hidrogênio são relativamente fracas, então 
quando se coloca a uma temperatura maior que 90 
graus elas rompem. É possível analisar a temperatura 
através do termômetro. 
 
2 FASE- ANELAMENTO DOS PRIMERS: 
Os primers são os oligonucleotideos iniciadores que vão 
dar especificidade a reação. 
Ex: gemona de um paciente infectado com HTLV – se 
tem uma sequencia de um genoma viral inserida em 
uma sequência de genoma humano. 
Para saber, é necessário desenhar uma sequencia que 
seja complementar a sequência do genoma viral. 
Nessa fase, ocorre basicamente a ligação dos primers 
com a sequencia de interesse (hibridização) 
Temperatura varia entre 40 a 70 graus conforme o par 
de primers. A temperatura nessa fase será diferente, já 
que para permitir o ligamento não pode manter a 
temperatura muito alta, se não elas irão se separar. 
O primer determina a especificidade da reação. 
 
 
 
 
 
Ex: se tem uma sequência do vírus da hepatite e quer 
amplificar essa sequencia pra saber se o paciente ta com 
a doença. 
Se desenha a sequência complementar para cada 
primer. Se a sequencia se encaixar na amostra do 
paciente e a polimerase estender, é porque o paciente ta 
infectado. 
É um exame direto porque vai no microrganismo que 
você ta buscando. 
 
3 FASE – EXTENSÃO: 
Atividade da Taq DNA polimerase (Taq porque foi 
retirada de microrganismos aquáticos, que vivem em 
áreas próximas a vulcões, com temperaturas mais altas. 
Caso fosse usada a DNA polimerase humana, ela não 
iria sobreviver as variações de temperatura. 
Duplicação da DNA 
Temperatura ótima em torno de 72 graus 
 
 
Ana Victoria Soares 2021.1 
 
Ana Victoria Soares 2021.1 
 
OBS: Professor, então eu posso afirmar que na amostra 
recolhida terei amostras do DNA humano e DNA viral, 
o primer é que será especifico para a identificação do 
DNA viral, se o vírus não estiver presente, o primer não 
exercerá a sua função e não teremos a replicação da 
sequência. Correto? 
Correto. Se tem amostra de vírus, em vários números de 
amostras variadas e se o primer não for específico, ele 
vai se ligar em qualquer lugar. Por isso precisa ser um 
primer muito bem desenhado, e ele se ligara apenas na 
amostrado vírus se tiver presente. Se não tiver, não se 
liga em nada, consequentemente não há infecção, o 
diagnostico será negativo. 
 
 
As amostras são armazenadas dessa forma. Para que 
elas seja visualizadas, existe a necessidade de técnicas 
especificas com corantes. 
Ex: eletrosforese. 
Se coloca o corante na amostra e em seguida submete 
essa amostra a uma voltagem que faz ela ligar para o 
polo positivo do gel, já que o DNA é muito negativo por 
conta do fosfato. 
 
 
TIPOS DE PCR: 
PCR convencional – mais utilizado 
Nested PCR- é utilizado quando a amplificação da um 
resultado muito fraco na banda. Pega-se a banda que 
ficou clara e realiza um novo PCR daquela parte, é como 
se fizesse um PCR do PCR. 
PCR em tempo real (Qpcr) – também chamado de 
quantitativo. É um PCR que a medida em que ele vai 
sendo feito, você já consegue saber naquele momento se 
ele ta funcionando, não precisa fazer eletroforese 
depois. 
RT-PCR – é o PCR mais utilizado no mundo, ele 
consegue realizar uma transcrição reversa. 
PCR Multiplex- é usado quando o paciente apresenta 
muitos sintomas parecidos. Ex: dengue, zika e 
Chikungunya. Usa-se um primer só com florescência, 
então coloca-se os 3 primers no mesmo tubo, fazendo 
uma só reação com múltiplas buscas. Custo menor e 
tempo mais curto. 
 
Aplicações do conhecimento: diagnóstico de infecções 
de bactérias, vírus, fungos e protozoários. 
Quantificação de DNA ou RNA viral/ célula 
hospedeira.