Amplificação in Vitro de DNA

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DESCRIÇÃO
Técnicas de amplificação e detecção de ácidos nucleicos in vitro e introdução de suas
aplicações em rotina laboratorial.
PROPÓSITO
Compreender a teoria por trás da amplificação de ácidos nucleicos in vitro em suas diferentes
formas e entender quais são suas vantagens, desvantagens e aplicações em contextos diversos
é importante para o profissional de laboratório, pois lhe fornecerá poderosa ferramenta de
trabalho.
OBJETIVOS
MÓDULO 1
Reconhecer elementos fundamentais à amplificação de ácidos nucleicos in vitro
MÓDULO 2
Diferenciar as variações entre cada técnica de PCR
MÓDULO 3
Identificar aplicações apropriadas ao uso de cada método
INTRODUÇÃO
Os ácidos nucleicos são as estruturas fundamentais que carregam informações genéticas. Você
já parou para pensar como certas características físicas passam dos pais para os filhos? Traços
físicos como formato do rosto, altura, cor da pele e dos olhos são traduções de informações
transmitidas às gerações futuras dos ácidos nucleicos. No corpo humano e na maioria dos seres
vivos, encontramos dois tipos de ácidos nucleicos: o ácido desoxirribonucleico (ADN – também
conhecido pela sigla em inglês, DNA), e o ácido ribonucleico (ARN, ou RNA, em inglês).
Cada uma dessas moléculas – DNA e RNA – tem funções diferentes dentro da menor unidade
viva conhecida, a célula. O DNA possui fita dupla, sendo mais estável e resistente que o RNA. Por
isso, a célula utiliza o DNA para armazenar as informações genéticas em longo prazo. Já o RNA,
normalmente, em fita simples e mais instável, tem como principal função intermediar a informação
entre o DNA e as unidades efetoras da maioria das funções celulares, as proteínas.
Formato do rosto e altura, por exemplo, são decorrentes da estrutura óssea que, em grande
parte, é feita de proteínas. O papel das proteínas não se limita apenas em traços físicos, mas
também em funcionais.
 
Fonte: Alejandro Porto/Wikimedia commons/licença(CC BY-SA 3.0).
 Dogma central da Biologia Molecular: DNA replica-se em DNA e é transcrito em RNA, que é
traduzido em proteína.
Você deve estar se perguntando: o que isso tem a ver com a amplificação de ácidos
nucleicos?
Em uma célula viva e saudável, as enzimas fazem toda a amplificação do DNA por conta própria
em um ambiente extremamente complexo e controlado – do pH e nível de oxigênio disponível, ao
momento que a célula está em seu ciclo de vida. São dezenas de enzimas envolvidas na síntese
de novas moléculas de DNA, tantas que os cientistas ainda não compreendem completamente
todas as etapas envolvidas nesse processo. Apesar de toda a complexidade da duplicação do
DNA in vivo , já somos capazes de sintetizar pequenos trechos do DNA em um tubo de ensaio.
Incrível, não? Vamos ver com detalhes como isso é possível neste material.
MÓDULO 1
 Reconhecer elementos fundamentais à amplificação de ácidos nucleicos in vitro
PRINCÍPIOS DA PCR CONVENCIONAL
Para entendermos como funciona a amplificação de DNA in vitro , devemos primeiro relembrar
algumas informações sobre o DNA e o RNA: suas funções, composições, similaridades e
diferenças. Tanto o DNA quanto o RNA são formados por nucleotídeos, que são como os tijolos
dos ácidos nucleicos e, consequentemente, do material genético. A partir da junção de tais tijolos,
formamos as estruturas de DNA e RNA. Mas como são esses tijolos?
Em primeiro lugar, os nucleotídeos contêm um açúcar chamado ribose. Essa ribose é uma das
formas mais simples dos carboidratos – a forma mais conhecida de um açúcar simples é a
glicose. É na ribose que reside a principal diferença entre DNA e RNA: o RNA possui uma
molécula de oxigênio ligada ao segundo carbono da ribose que o DNA não possui – por isso, o
DNA é chamado de desoxirribonucleico.
DESOXIRRIBONUCLEICO
Prefixo “des” significa a ausência (como em desinteresse), portanto, “desoxi” representa o
oxigênio que está ausente.
O segundo componente são as bases nitrogenadas. Para o DNA, existem quatro tipos diferentes
de bases nitrogenadas:
ADENINA (A)
CITOSINA (C)
GUANINA (G)
TIMINA (T)
Para o RNA, as bases nitrogenadas A, C e G são as mesmas, mas, em vez de T, existe uma
Uracila (U). Essas bases são as responsáveis pela informação genética.
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Imagine escrever um texto codificado, tão complexo quanto um ser humano, usando apenas uma
das letras do teclado do computador. Como seria possível entender a informação que você quis
codificar? Agora, se você escrever um texto com pelo menos duas letras (ou números) do teclado,
usará um código binário. Isso também acontece com a informação genética: a célula utiliza
essas cinco bases nitrogenadas para codificar, em sequência, uma informação preciosa.
Finalmente, os nucleotídeos possuem grupamentos fosfatos no quinto carbono da (desoxir)ribose,
que são capazes de interagir com a hidroxila (álcool orgânico) presente no terceiro carbono da
(desoxir)ribose, fazendo a ligação entre um nucleotídeo com o próximo. Essa ligação é conhecida
como fosfodiéster, sendo considerada o “cimento” dos nossos “tijolos”: a partir dela, longas
sequências de DNA ou RNA são formadas. É importante manter em mente que o grupamento
fosfato confere carga negativa à molécula de DNA (Figura 1) – vamos voltar a falar a respeito
disso mais à frente.
CÓDIGO BINÁRIOS
Formado por sequências de 0 e 1 que, em trechos longos, podem codificar informação,
como computadores.
 
Fonte: Shutterstock.com
 Figura 1: Esquema da estrutura básica dos desoxirribonucleotideos, compostos por fosfato,
desoxirribose e base nitrogenada.
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A interação entre a hidroxila no carbono 3 da (desoxir)ribose e o fosfato de outro nucleotídeo no
carbono 5 deixam as bases nitrogenadas livres para interação com outras bases nitrogenadas,
normalmente, do tipo oposto. As principais bases nitrogenadas (A, T, C, G, U) são divididas em
dois grupos químicos, de acordo com o número de anéis aromáticos que possuem:
PIRIMIDINAS
(C, T, U) - Possuem um anel
PURINAS
(A, G) - Possuem dois
As bases interagem entre si, mas entre grupos opostos: ou seja, Pirimidinas pareiam com
Purinas, de acordo com as cargas livres de cada base. Desse modo, A interage com T, pois
ambas têm duas cargas livres para interação, e C interage com G através de três cargas. Essas
interações são chamadas de pontes de hidrogênio e são consideradas fracas por serem
facilmente quebradas por agentes físicos, como a temperatura, e químicos, como o pH (Figura 2).
Veja o esquema mostrando a estrutura do DNA e o pareamento das bases por
complementariedade. Note as pontes de hidrogênio duplas (seta verde) entre Adenina e Timina, e
as triplas (seta preta) entre Citosina e Guanina.
 
Fonte: Shutterstock.com
 Figura 2: Pareamento de bases nitrogenadas.
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No entanto, essas pontes de hidrogênio são importantes para manter a sequência de DNA livre
de erros e garantem à molécula uma de suas características fundamentais: a
complementariedade. É a partir dessa complementariedade que as enzimas responsáveis pela
síntese do DNA e do RNA, as polimerases, sabem qual nucleotídeo adicionar para manter a
mesma mensagem na hora de duplicar o DNA. Ao mesmo tempo, é a característica que dá ao
DNA seu formato em fita dupla. Chamamos essa característica de replicação semiconservada.
SEMICONSERVADA
Uma fita original (fita parental) é mantida na duplicação, como molde para a síntese da fita
nova (fita filha).
 IMPORTANTE
Se olharmos para essa fita dupla em um sentido único, da esquerda para a direita, por exemplo,
veremos que uma das fitas se encontra com o carbono 5 da desoxirribose livre na extremidade à
esquerda, enquanto a outra fita tem o carbono 3 da desoxirribose livre à esquerda. Isso acontece
porque, para interagirem, as duas fitas precisam estar em sentidos opostos – por isso, nós as
chamamos de fitas antiparalelas. Esse sentido de interação por complementariedade traz à
tona outra característica do DNA: sua replicaçãodeve ser feita de forma semidescontínua.
SEMIDESCONTÍNUA
Replicação de forma semidescontínua: In vivo , apenas a fita no sentido antiparalelo
(3’→5’) é lida de forma contínua, e a fita de DNA molde no sentido paralelo (5’→3’) é lida de
forma descontínua. Isso acontece por causa do sentido de abertura da forquilha de
replicação.
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REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE:
AMPLIFICANDO DNA IN VITRO
Em uma célula viva, as enzimas polimerases têm ao seu dispor todos os itens necessários para
duplicar o DNA, de nucleotídeos a todas as enzimas (Figura 3).
 
Fonte: Shutterstock.com
 Figura 3: Representação do complexo de replicação do DNA em uma célula.
Imagine quão complexo seria reproduzir o ambiente celular em um tubo de ensaio! Precisamos
utilizar os conhecimentos da físico-química do DNA e os princípios básicos de sua replicação
para simplificação e adaptação da técnica in vitro .
 
Fonte: Shutterstock.com
A primeira característica do DNA que é importante na sua replicação in vitro é a
complementariedade entre fitas antiparalelas: as bases nitrogenadas de uma fita interagem
especificamente com as bases correspondentes da outra fita (A-T, C-G) por meio de interações
frágeis que podem ser desfeitas pelo calor. Ao aquecermos a solução acima de 90 oC, podemos
desfazer essas interações e abrir a fita dupla em duas fitas simples. Isso deixa as bases
nitrogenadas expostas para interagirem e, ao abaixarmos a temperatura, conseguimos fazer com
que a fita dupla se refaça e a informação seja mantida. Vamos ver como esse processo funciona
passo a passo mais à frente.
 
Fonte: Shutterstock.com
A segunda característica importante para a replicação do DNA in vitro é a síntese enzimática
pela polimerase. Essa enzima lê cada base nitrogenada da fita simples como se fosse um molde,
e adiciona a base nitrogenada complementar na fita que está sendo sintetizada através da
ligação fosfodiéster. In vivo , a polimerase inicia a duplicação do DNA sozinha, pois ela não
consegue abrir a fita dupla em fitas simples, identificar o local certo de início de replicação ou
adicionar os primeiros nucleotídeos. A célula utiliza enzimas para abrir a fita dupla, as helicases ,
e adição dos primeiros nucleotídeos é feita por outra enzima, chamada primase .
Na amplificação do DNA in vitro , chamada de reação em cadeia da polimerase (em inglês,
polymerase chain reaction – PCR), a abertura do DNA em fitas simples é feita através de calor.
Para isso, utilizamos uma enzima termorresistente chamada de Taq polimerase. Além disso,
usamos pequenas sequências de nucleotídeos em fitas simples e complementares à sequência-
alvo do DNA a ser amplificado. Essas sequências sintéticas são chamadas de iniciadores ou
oligonucleotídeos (oligo = poucos), algo em torno de 20 nucleotídeos, que, em inglês, são
chamados de primers . Normalmente, são usados dois oligonucleotídeos por reação: um
chamado senso, que se liga ao DNA molde fita simples no sentido 3’→5’; e um
antissenso, que se liga à fita no sentido 5’→3’.
Lembre-se de que o sentido de duplicação contínua do DNA ocorre apenas no sentido 5’→3’,
pois o trifosfato (na posição 5) do nucleotídeo livre dará a energia necessária à ligação
fosfodiéster com o carbono 3 da ribose do nucleotídeo que já estará na fita. Isso acontece em
ambas as fitas (paralela 5’→3’ e antiparalela 3’→5’), e ambos os oligonucleotídeos são
sintetizados em laboratório no sentido 5’→3’. Os oligonucleotídeos iniciadores irão demarcar a
região do genoma a ser amplificada. Essa informação é importante para dar especificidade à
PCR!
ETAPAS DA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
Agora, já compreendemos que a fita dupla de DNA se abre em duas fitas simples quando
aquecida próximo a 100 oC, e sabemos que a reação de síntese de novas fitas de DNA é feita
por meio de uma enzima termorresistente chamada Taq polimerase. Também descobrimos que
a enzima precisa de oligonucleotídeos iniciadores que se ligam por complementariedade ao
DNA-alvo desnaturado em uma fita simples. Agora, podemos entender como essa última se
desenvolve. Assim como em qualquer receita de bolo, uma PCR precisa de seus ingredientes
básicos – ou reagentes mínimos – para a síntese de DNA acontecer. Desse modo, adicionamos
esses ingredientes a um microtubo. Os reagentes mínimos necessários para a amplificação são:
O DNA molde, dupla fita, extraído a partir de amostras biológicas.
Os oligonucleotídeos sintéticos que são complementares à região do DNA molde a ser
amplificado.
A Taq polimerase, termorresistente.
Cátions de magnésio (Mg2+), cofator necessário ao funcionamento eficaz da polimerase.
Os desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs – dATP, dGTP, dCTP, dTTP) – lembre-se
de que os três fosfatos são usados como fonte de energia para que a reação fosfodiéster
catalisada pela Taq polimerase aconteça.
A água ultrapura, livre de contaminantes de DNA, RNA e de nucleases. (Figura 4).
 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal
 
Fonte: Shutterstock.com
 Figura 4: Esquema dos reagentes necessários a uma reação em cadeia da polimerase
(PCR).
O microtubo com esses poucos reagentes é, então, submetido a diversos ciclos de elevação e
redução da temperatura do qual a PCR consiste.
A primeira etapa de qualquer PCR consiste na abertura da fita dupla de DNA em suas fitas
simples pelo aquecimento da reação a, pelo menos, 95 oC, por um tempo prolongado – algo em
torno de 5 a 10 minutos. Esse tempo é necessário para abrir por completo as fitas de DNA que
podem estar muito concentradas, superenoveladas e ser muito longas.

Em seguida, começam os ciclos. Cada ciclo contém, pelo menos, 3 etapas: desnaturação,
anelamento e extensão (Figura 5).
Note na ilustração a desnaturação das fitas duplas de DNA em fitas simples, o anelamento dos
iniciadores à sequência-alvo por complementariedade e a extensão pela Taq polimerase.
 
Fonte: Shutterstock.com
 Figura 5: Ilustração das etapas da PCR.
DESNATURAÇÃO
É a primeira etapa de cada ciclo em que a temperatura é aquecida a 95 oC por cerca de 1
minuto. O tempo de desnaturação pode variar de acordo com cada reação e genoma. Por
exemplo, genomas ricos em CG precisam de tempo e temperatura maiores para desnaturar, pois
C faz pontes triplas com G, enquanto genomas ricos em AT precisam de tempos menores por
possuírem ligações duplas.
ANELAMENTO
A segunda etapa de cada ciclo é o anelamento. A temperatura será reduzida para cerca de 50 a
65 oC por, aproximadamente, 30 segundos. Essa redução da temperatura deve ser feita com
exatidão para que os iniciadores se liguem especificamente à fita simples de DNA. Se a
temperatura for baixa demais, a fita se renatura e a PCR não acontece, ou ainda outros
fragmentos do DNA extraído podem se ligar inespecificamente e sua reação não funcionará
apropriadamente. Se for alta demais, os oligonucleotídeos se ligarão apenas parcialmente, ou até
mesmo não se ligarão, e a eficiência da sua reação será gravemente comprometida. Você pode
estar se perguntando como saber exatamente a temperatura a ser usada. A resposta certa
dependerá de vários fatores, como o tamanho do seu oligonucleotídeo, seu conteúdo de CG, e a
concentração de sais no tampão de PCR. De modo geral, quanto maior o tamanho e o conteúdo
de CG, maior será a temperatura de anelamento.
Uma vez que os oligonucleotídeos tenham se anelado à fita de DNA molde, a Taq polimerase
reconhecerá esse local e fará a extensão da fita dupla. Como a Taq polimerase é
termorresistente, a elevação da temperatura a 95 oC não a destrói – na realidade, ela funciona
melhor em temperaturas mais elevadas. No caso da maioria das polimerases disponíveis
comercialmente, a melhor temperatura de adição de nucleotídeos em uma PCR é, em
torno, de 70 oC a 72 oC.
 ATENÇÃO
O tempo de extensão depende da velocidade da polimerase usada e do tamanho da sequência
entre os oligonucleotídeos. Uma reação para amplificarmenos de 500 pares de bases que utilize
uma polimerase com uma velocidade de incorporação de nucleotídeos mediana deve ter um
tempo de extensão de 30 a 40 segundos.
Após o término da extensão, a reação é aquecida novamente a > 95 oC, para que as fitas duplas
recém-sintetizadas sejam separadas, e o ciclo desnaturação-anelamento-extensão se repita de
30 a 40 vezes. No final, é recomendável ter um ciclo final de extensão maior para garantir que a
síntese de todas as fitas seja concluída. Após o término, a reação deve ser mantida refrigerada
para preservar o material amplificado.
A PCR acontece em equipamentos que, como um ferro de passar, aquecem e resfriam
rapidamente: os termocicladores. Esses aparelhos foram um grande avanço para as ciências
biológicas e permitiram a grande difusão da PCR em diversas áreas. Graças a eles, uma PCR
convencional média dura de 1 hora e meia a 2h.
A cada ciclo, a quantidade de sequência-alvo – aquela contida entre os iniciadores senso e
antissenso, conhecida como amplicon (Produto amplificado) – dobra. Dessa forma, se, no
primeiro ciclo, tínhamos apenas uma cópia de tal sequência (limite teórico da PCR), ao final do
primeiro ciclo, teremos 2 cópias; no final do terceiro ciclo, 4; depois, 8, e então 16, e assim
sucessivamente.
A cada ciclo, vemos um aumento exponencial do número de cópias da sequência-alvo.
Assim, no final de 30 ciclos, teremos algo na ordem de 1 bilhão de cópias da mesma sequência!
Um número tão grande de uma mesma sequência vai ser muito mais facilmente identificado
posteriormente (Figura 6).
 
Fonte: Shutterstock.com
 Figura 6: Esquema da amplificação exponencial do DNA-alvo por ciclo a partir de uma cópia,
em aparelho termociclador.
Via de regra, podemos subdividir a PCR em duas categorias:
PCR qualitativa, em que todos os ciclos ocorrem em um termociclador comum, precisa de
etapas posteriores para revelar o resultado. Nesse tipo, o resultado se dá pela constatação da
presença ou ausência do produto alvo da amplificação. Abordaremos alguns outros tipos de PCR
que se encaixam nessa categoria.
PCR quantitativa, também conhecida como em tempo real, em que os ciclos se dão em um
aparelho capaz de ler automaticamente a amplificação e, assim, é capaz de quantificar em tempo
real. Existem dois métodos que são mais comuns para a quantificação. Nesse caso, não há
necessidade de revelação posterior à reação, o que a torna mais rápida.
ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE:
SEPARANDO E REVELANDO O RESULTADO
Após a amplificação da sequência-alvo pela polimerase, temos um microtubo com nosso DNA
amplificado em um tampão de reação que é transparente como a água. Naturalmente, não
podemos observar a olho nu o resultado da reação: é necessário revelá-la. Para isso,
precisamos manter em mente que, após uma PCR bem-sucedida, temos uma sequência de DNA
em um tamanho exato graças ao anelamento específico dos oligonucleotídeos à sequência-alvo.
Portanto, precisamos separar as sequências por tamanho para verificarmos se o tamanho
corresponde ao do nosso produto. Também vamos precisar de algo que revele a localização do
DNA, ou um agente revelador especial.
 DICA
Para separar o DNA de acordo com seu tamanho, usamos uma espécie de malha gelatinosa
chamada de matriz ou gel de agarose.
Você deve estar familiarizado com a gelatina que fazemos na cozinha, certo? A agarose funciona
de maneira semelhante: é um polissacarídeo que se dissolve em líquido aquoso quando aquecido
e, quando resfriado, se solidifica, ou polimeriza. Ao polimerizar, a agarose forma uma malha com
pequenos orifícios que permitirão a passagem do DNA, de forma que moléculas menores de
DNA passarão com maior facilidade e mais rapidamente, enquanto moléculas maiores de DNA
terão maior dificuldade de passar e, por isso, demorarão mais tempo para viajarem pela malha.
Assim, podemos separar as moléculas de DNA de acordo com tamanho. Dependendo do
tamanho do nosso DNA amplificado, poderemos usar uma malha mais fechada ou mais aberta
simplesmente variando a concentração da agarose que usamos para fazer o gel.
O DNA será inserido no gel de agarose através de pequenos orifícios chamados de poços, feitos
com um pente com pequenos dentes largos. Para podermos visualizar a passagem do tampão
da PCR pelo gel de agarose, usamos corantes como o azul de bromofenol, o qual é mais denso
do que o tampão de corrida e faz com que o DNA se assente no fundo do poço, o que é
necessário para que a separação funcione adequadamente.
 
Fonte: Shutterstock.com
 Montagem de gel de agarose e uso de pentes para formação de poços para aplicação do
produto de PCR.
Uma vez que o gel de agarose esteja pronto e que o DNA tenha sido pipetado nos poços do gel
com o corante azul, podemos começar a eletroforese. Para a eletroforese, precisaremos ainda
de uma cuba, ou recipiente que contenha entradas para corrente elétrica, uma fonte elétrica e um
tampão ionizável. A eletroforese parte do princípio de que um tampão, quando submetido a uma
corrente elétrica, tem suas moléculas ionizadas migrando em direção a um dos polos: as
moléculas negativas migram para o polo oposto, o cátodo, e as moléculas positivas migram para
o polo negativo, o ânodo.
No caso do DNA, seu grupamento fosfato lhe dá carga negativa, fazendo que o DNA migre para o
polo positivo (cátodo) quando em solução submetida à corrente elétrica. Como o DNA está no
fundo do gel de agarose graças ao corante mais pesado que o tampão eletroforético, ele passa
por dentro da agarose e, assim, será separado de acordo com seu tamanho pela trama do gel.
Por sua vez, o corante azul, também de carga negativa e de tamanho muito inferior à complexa
molécula de DNA, migrará pelo gel mais rapidamente, servindo apenas como marcador da
velocidade de migração, e não da posição do DNA.
 
Fonte: Shutterstock.com
 Representação esquemática de uma eletroforese em gel de agarose.
Para sabermos o tamanho e a posição do DNA, precisaremos de um marcador de tamanho
molecular do DNA que consiste em sequências de DNA de tamanhos conhecidos, como se
fosse uma escada cujos degraus representam os tamanhos. Ele é um parâmetro para
estimarmos o tamanho das sequências de DNA que amplificamos – coloquialmente, chamamos
essas sequências em gel de agarose de bandas.
Também precisamos de um revelador da localização do nosso produto amplificado no gel de
agarose. Esse reagente, chamado de fluoróforo, é uma molécula capaz de fluorescer quando
excitada no comprimento de onda correto. Em gel de agarose, usamos fluoróforo que intercale
especificamente com o DNA. A molécula mais comumente utilizada é o brometo de etídio, que é
capaz de se intercalar com qualquer fita dupla de DNA. Sua capacidade de se ligar ao DNA o
torna potencialmente tóxico, carcinogênico e teratogênico, e precisamos manter nossa segurança
e as boas práticas laboratoriais para evitar de nos contaminarmos com ele.
Existem diversas formas de se utilizar brometo na revelação do gel, podendo ser adicionado
antes da solidificação do gel (antes da eletroforese) ou depois da eletroforese, com uma
incubação extra. Finalmente, o brometo de etídio é excitado no comprimento de onda ultravioleta
em um equipamento chamado transiluminador. Ao ser excitado, o fluoróforo emite fluorescência e
dá a localização das bandas de DNA amplificado de acordo com o marcador de tamanho
molecular.
 
Fonte: Shutterstock.com à esquerda e Joseph Elsbernd/Flickr/licença(CC BY-SA 2.0) à direita.
 Imagem de um gel de agarose e sua revelação por fluorescência do brometo de etídio em luz
ultravioleta.
Dependendo da técnica de PCR utilizada, assim como do objetivo da PCR, seu resultado pode
ser uma única banda de DNA no gel de agarose ou múltiplas bandas. Algumas vezes, resultados
inesperados também podem aparecer, como múltiplas bandas de DNA, onde apenas uma banda
única era esperada. Cada situação demandará a experiência e o conhecimento do
profissional para interpretação e resolução depossíveis problemas. Existem alternativas
ao uso do gel de agarose para separação de ácidos nucleicos. Um exemplo é o gel de
acrilamida/bisacrilamida, usado para separar sequências de DNA com alta resolução, de forma
que bandas com até um nucleotídeo de diferença em tamanho possam ser diferenciadas. O gel
de acrilamida/bisacrilamida também permite a separação de RNA e proteínas. No entanto, exige
revelação por sistemas diferentes, mais complexos, que nem todos os laboratórios possuem
estrutura para execução. Além de mais tóxica que a agarose, a montagem do gel e sua corrida
eletroforética também são mais trabalhosas. Desse modo, o gel de agarose corado por
brometo de etídio é a técnica de revelação de PCR mais utilizada.
PCR E ELETROFORESE
VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. VIMOS QUE A PCR É UMA FERRAMENTA MOLECULAR PARA
AMPLIFICAÇÃO DO DNA IN VITRO. SOBRE A PCR, É CORRETO AFIRMAR
QUE:
A) A polimerase utilizada é capaz de adicionar todos os nucleotídeos necessários, de maneira
inespecífica.
B) A especificidade da reação é por oligonucleotídeos iniciadores para demarcar a sequência e
permitir que a polimerase inicie a síntese.
C) A PCR ocorre de forma linear, ou seja, nenhuma etapa de variação de temperatura se repete.
D) A Taq polimerase é uma enzima sensível ao calor e deve ser adicionada a cada novo ciclo.
E) Apenas nucleotídeos com hidroxilas no terceiro carbono da ribose são adicionados pela Taq
polimerase.
2. A PCR CONTÉM DIVERSAS ETAPAS, DESDE PIPETAGEM DA REAÇÃO
ATÉ SUA LEITURA. CONSIDERANDO AS ETAPAS, É INCORRETO AFIRMAR
QUE:
A) A temperatura de desnaturação deve ser alta o suficiente para separar as fitas duplas de DNA
em fitas simples.
B) A Taq polimerase é termorresistente e sua temperatura ótima de síntese de DNA é próxima a
70oC.
C) Após a amplificação, podemos facilmente visualizar o resultado, pois se trata de reação
colorimétrica.
D) Para identificarmos se nossa sequência-alvo foi amplificada, devemos separar as moléculas
de acordo com o tamanho, através de eletroforese em gel de agarose, e depois revelar, usando
intercalantes de DNA fluorescentes em ultravioleta.
E) A eletroforese usa a carga negativa do DNA para fazê-lo migrar através do gel e em direção
ao cátodo, quando submetido à corrente elétrica.
GABARITO
1. Vimos que a PCR é uma ferramenta molecular para amplificação do DNA in vitro. Sobre
a PCR, é correto afirmar que:
A alternativa "B " está correta.
 
As DNA-polimerases são incapazes de reconhecer o local de início de replicação, sendo função
das primases a colocação dos primeiros nucleotídeos. Assim, precisamos usar iniciadores que
se anelarão por complementariedade específica à sequência-alvo desejada. O anelamento dos
oligonucleotídeos permite o reconhecimento pela polimerase, que sintetizará a fita dupla a partir
do molde.
2. A PCR contém diversas etapas, desde pipetagem da reação até sua leitura.
Considerando as etapas, é incorreto afirmar que:
A alternativa "C " está correta.
 
Na PCR, ocorre o aumento exponencial do número de fitas duplas de DNA correspondentes à
sequência-alvo. No entanto, esse aumento é invisível a olho nu e precisa ser revelado.
MÓDULO 2
 Diferenciar as variações entre cada técnica de PCR
VARIAÇÕES DA TÉCNICA DE PCR
Existem situações em que a PCR qualitativa e convencional pode não ser a técnica ideal para o
nosso objetivo. Podemos nos deparar com casos em que a concentração do DNA total da
amostra é muito baixa, o que pode limitar o uso do produto amplificado em outras aplicações,
como o sequenciamento. Em determinadas ocasiões, queremos saber o quanto de determinada
sequência temos em nossas amostras. Em outras situações, podemos estar interessados no
produto da expressão de um determinado gene, e precisamos olhar para o RNA mensageiro ao
invés do DNA, já que os níveis de DNA de uma célula são mantidos constantes, salvo raras
exceções.
 DICA
Como você pode ver, existem diversos outros interesses, e uma PCR convencional dará apenas
a base para que variações mais complexas, específicas e úteis sejam desenvolvidas, validadas e
usadas.
REAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO REVERSA
Como já sabemos, a DNA polimerase é capaz de sintetizar uma nova fita de DNA a partir de uma
fita de DNA molde. Afinal, ela é uma DNA polimerase DNA-dependente. Mas, em muitas
ocasiões, é necessário investigar a expressão de um gene, ou até mesmo diagnosticar doenças
causadas por vírus que não têm material genético feito por DNA. Nesses casos, a molécula a ser
detectada e quantificada indiretamente é o RNA. A Taq polimerase, no entanto, não é capaz de
reconhecer ou de adicionar nucleotídeos a riboses; ela só trabalha com desoxirriboses.
Como conseguimos resolver esse problema?
 RESPOSTA
Pelos organismos que conseguem sintetizar DNA a partir de RNA!
Assim como o SARS-CoV2, coronavírus causador da COVID-19, existem outros vírus de genoma
RNA. Os primeiros vírus a serem estudados pela humanidade foram os de genoma RNA
chamados de retrovírus. Esses vírus têm algo de especial: a capacidade de inverter a ordem DNA
→ RNA → proteína do dogma central da Biologia Molecular, usando uma enzima para sintetizar
um DNA complementar (cDNA) ao seu genoma RNA. Isso mesmo, os retrovírus usam o RNA de
seu genoma como molde para síntese de DNA.
 
Fonte: Shutterstock.com
Os retrovírus possuem uma enzima capaz de sintetizar DNA a partir de RNA cujo nome oficial é
DNA polimerase RNA-dependente. Corriqueiramente, ela é chamada de transcriptase
reversa, ou TR, pois faz o reverso da transcrição: sintetiza DNA a partir do RNA. Uma vez que os
pesquisadores conseguiram isolar a TR, ela passou a ser usada para reações in vitro . Na
maioria dos casos, é usada uma TR purificada a partir de vírus aviários, de forma que as TR não
representam nenhum risco de infecção ao manipulador e são seguras para diagnóstico e
pesquisa.
 
Fonte: Shutterstock.com
Assim como uma reação pela polimerase, a reação de transcrição reversa (RT (Usada daqui em
diante para designar a reação em si.) ) precisa de alguns fatores elementares. O primeiro fator
necessário é o RNA de polaridade positiva (RNA+) de qualidade, o que requer muito cuidado na
manipulação e extração do material. Esse RNA é assim chamado por possuir o mesmo sentido
de transcrição e tradução que um RNA mensageiro (mRNA), mas expande o entendimento para
vírus que nem sempre tem seu RNA+ diretamente traduzido na célula, como, por exemplo, os
próprios retrovírus. Além do RNA+, a RT também precisará da enzima transcriptase reversa para
fazer a síntese de cDNA a partir do RNA+.
Assim como as primeiras DNA-polimerases usadas na PCR mais rudimentar, a TR não é
resistente à temperatura. Dessa forma, a reação de transcrição reversa deve preceder a PCR,
pois a TR é inativada pelas temperaturas de desnaturação. Da junção de reação de transcrição
reversa (RT) seguida por PCR, vem o termo RT-PCR. A TR precisará de pequenos
oligonucleotídeos, menores ainda que os usados em uma PCR convencional, para iniciar a
transcrição. Esses oligonucleotídeos têm, em média, apenas 6 bases e, por isso, são chamados
de hexâmeros. Eles podem ser específicos para uma determinada sequência de RNA, ou
podem ser uma sequência curta rica em timinas (poli-T) que se anelará à cauda poli-A do
mRNA, ou podem ser aleatorizados, sendo este último o mais usado por permitir a síntese e o
armazenamento do cDNA derivado de diversas sequências diferentes.
PRIMEIRO CASO
Sintetizamos apenas cDNAs correspondentes ao RNA (mensageiros ou não) ao qual os
hexâmeros se anelam.
SEGUNDO CASO
Podemos criar cDNA complementares a todos os mRNA da célula, o que constitui uma biblioteca
de expressão gênica.
TERCEIRO CASO
Com uso de iniciadores aleatorizados, criamos uma biblioteca de cDNA correspondente a todos
os RNAs da célula, mensageiros ou não. Similar à PCR, uma vez que os oligonucleotídeos se
ligam à fita de RNA+, a TR começa a sintetizar uma fita de cDNA complementar usando o quarto
reagente, os desoxirribonucleotídeostrifosfatados (dNTPs).
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Ao contrário da PCR, que contém ciclos que se repetem várias vezes para a amplificação de
determinada sequência, a RT é linear: cada etapa acontece apenas uma vez, o que não permite
amplificação de sinal. Primeiro, a reação começa com o anelamento dos hexâmeros ao RNA+
por poucos minutos. Na maioria dos casos, não há necessidade de temperaturas altas de
desnaturação, pois o RNA+ já é uma fita simples. Contudo, podem ocorrer estruturas secundárias
no RNA que precisam de temperaturas moderadas para desnaturação. (Figura 7)
Veja na imagem a desnaturação de eventuais estruturas secundárias do RNA, seguido por
anelamento dos hexâmeros iniciadores à sequência-alvo por complementariedade e síntese de
cDNA pela transcriptase reversa.
 
Fonte: Shutterstock.com
 Figura 7: Ilustração das etapas da reação de transcrição reversa (RT).
Em seguida, o tubo será aquecido ou resfriado até a temperatura de extensão pela TR.
Diferentemente da PCR convencional, a RT possui diversas TR de origens diferentes que podem
ser usadas. Assim, os protocolos variam entre diferentes marcas de enzimas. Em alguns casos, a
RT pode ter apenas essas duas temperaturas, de anelamento e extensão, de 25 e 37 oC,
respectivamente. O cDNA produzido pode ser armazenado por meses a anos em geladeira (4
oC) ou freezer (-20 oC), ou usado imediatamente como molde em uma PCR – a chamada RT-
PCR. (Figura 8)
 
Fonte: Shutterstock.com
 Figura 8: Resumo esquemático dos reagentes necessários, das etapas e da amplificação do
cDNA em uma RT-PCR.
NESTED -PCR
A PCR convencional é muito útil, mas, às vezes, não consegue amplificar uma determinada
sequência que esteja presente em pouquíssima quantidade. Quando há dificuldade em se
amplificar o DNA alvo na PCR convencional, o gel de agarose pode não ter capacidade suficiente
para evidenciar o amplicon . Nós chamamos essa capacidade de o resultado representar a
realidade de sensibilidade. Em outras palavras, a sensibilidade da PCR reflete a capacidade de
detecção do sinal do DNA-alvo, em amostras que possuem o DNA-alvo na realidade.
Normalmente, a PCR tem ótima sensibilidade por aumentar exponencialmente a sequência-alvo.
No entanto, em alguns casos, a sensibilidade da PCR convencional pode não ser suficiente, pois
existe uma saturação da reação por volta do 35º ciclo: atingimos um platô em que não há
aumento do número de fitas devido ao esgotamento dos reagentes. Então, ter mais de 40 ciclos
em uma PCR não oferecerá nenhum benefício, porém, pode aumentar as chances de produtos
inespecíficos que atrapalharão a interpretação. (Figura 9).
Observe no gráfico que a quantidade de DNA, detectada por fluorescência, aumenta
exponencialmente até chegar a um platô, em que não há mais aumento significativo de DNA a
cada ciclo.
 
Fonte: EnsineMe.
 Figura 9: Gráfico representativo das qPCR.
A solução para PCR com baixa sensibilidade é relativamente simples: usar uma fração da
primeira reação como molde para uma segunda PCR, em uma técnica conhecida como nested -
PCR (Ou PCR aninhada, em português.) . Para isso, utilizamos dois pares de iniciadores, sendo
o par de primers para a primeira reação chamado de iniciadores externos, e os primers
usados na segunda PCR conhecidos como internos. Dessa maneira, a segunda PCR sempre
gera um produto menor que a primeira reação, e conseguimos aumentar o número de ciclos de
amplificação de, no máximo, 40 (na PCR convencional) para entre 60 e 80 ciclos no total de
ciclos combinados nas duas reações subsequentes. Consequentemente, aumentamos a
quantidade de DNA amplificado obtido ao final da segunda PCR. Caso seja utilizada
corretamente, a adição de etapa nested pode melhorar muito a sensibilidade e a especificidade
da PCR.
Para isso, são necessários alguns cuidados especiais. O primeiro deles está no desenho da
reação, que deve ser pensada como um conjunto. A primeira PCR deve possuir oligonucleotídeos
que, ao se anelarem a uma determinada região, permitam que a polimerase produza um
amplicon longo e específico o suficiente para ser usado como DNA-molde na segunda reação.
 SAIBA MAIS
Isso significa que, caso desejemos amplificar sequências altamente repetitivas, precisaremos
levar em consideração uma primeira PCR cujo amplicon contenha regiões específicas ao redor
das repetições para que haja uma boa reação secundária. Isso porque, essa última precisa de
iniciadores que se anelem especificamente à região que foi amplificada anteriormente.
Contudo, devemos evitar o uso dos mesmos oligonucleotídeos da primeira reação, já que podem
reduzir a eficácia da segunda reação, além de gerar produtos inespecíficos. Outro cuidado
recomendável para a segunda reação é a purificação do produto da primeira reação antes de
utilizá-lo na segunda, o que evita contaminações entre amostras, reduz o risco de
inespecificidade e aumenta a eficácia da segunda PCR (Figura 10). Note o uso de iniciadores
externos na primeira reação, amplificando um produto que será usado como molde de
amplificação na segunda reação, que usa iniciadores internos.
 
Fonte: EnsineMe.
 Figura 10: Representação esquemática de uma nested -PCR.
PCR QUANTITATIVO EM TEMPO REAL – QPCR
Até agora, todas as técnicas que discutimos precisam da eletroforese em gel de agarose para
separação dos produtos da PCR e posterior revelação das bandas através de agentes
intercalantes do DNA que emitem fluorescência; por exemplo, o brometo de etídio, quando
submetido à luz ultravioleta. Esses tipos de PCR são categorizados como qualitativos e podem
ser muito úteis, especialmente, quando o DNA amplificado for utilizado em outra técnica
subsequente. Entretanto, existem situações em que a PCR qualitativa se torna pouco informativa.
 EXEMPLO
Quando queremos determinar se um tratamento está surtindo efeito na redução de um marcador
genético específico. Nesse caso, a PCR convencional e suas variações vistas até agora não
informam o suficiente para tomada de decisões. Precisamos, assim, de técnicas que revelem a
quantidade de certa sequência específica de DNA com o máximo de precisão possível. Entra em
cena a PCR quantitativa (também conhecida como PCR em tempo real.) (qPCR).
A qPCR tem a capacidade de quantificação da sequência-alvo e de leitura em tempo real dos
resultados, sem necessidade de revelação posterior. Isso porque, ela possui dois fatores
adicionais a uma PCR qualitativa: a adição de fluoróforos à própria reação e o uso de um
termociclador capaz de detectar o sinal fluorescente. Dessa forma, a cada novo ciclo de
desnaturação-anelamento-amplificação, ocorre aumento da quantidade de DNA-alvo e da
emissão de fluorescência proporcional à quantidade de DNA sendo sintetizada naquele ciclo.
Para que a fluorescência seja detectada, a qPCR exige a utilização de termocicladores que
contenham lasers para excitação do fluoróforo e detectores da fluorescência. Esse aparelho é
mais sofisticado, mais caro e mais complexo do que um termociclador convencional, porém, seus
resultados podem ser igualmente mais informativos e precisos. Outra diferença da qPCR é que,
em alguns casos, podemos ter uma temperatura única para anelamento e extensão: todas as
duas acontecem a 60 oC (Figura 11).
 
Fonte: EnsineMe.
 Figura 11: Exemplo dos ciclos de temperatura usados em SYBR qPCR contendo a fase de
amplificação e a fase de curva de dissociação.
Existem duas técnicas de qPCR largamente usadas: SYBR Green e TaqMan. Elas diferem
especialmente na forma como a fluorescência é emitida e na especificidade do sinal
fluorescente. As formas de quantificação são, por outro lado, semelhantes. Vamos explorar as
duas em mais detalhes?
SYBR GREEN
O SYBR é fluoróforo que, como o brometo de etídio, é capaz de intercalar em fitas duplas de
DNA. Quando está associado ao DNA, o SYBR pode ser excitado em comprimento de onda azul,
e então emite fluorescência verde. Quando não está ligadoao DNA fita dupla, o SYBR tem sua
fluorescência drasticamente reduzida. Por sua capacidade de fluorescer quando ligado ao DNA
fita dupla, ele também é usado como um sistema alternativo na revelação da PCR convencional
em gel de agarose, já que é menos tóxico que o brometo de etídio.
Quando adicionado à qPCR, o SYBR emitirá o máximo de fluorescência na fase de extensão,
pois esse é o momento em que há maior número de bases pareadas em fitas duplas. O aparelho
termociclador irá incidir um laser, excitando o SYBR a emitir fluorescência verde. Essa
fluorescência será detectada pelo aparelho, que mostrará a quantidade de fluorescência por
ciclo. A cada novo ciclo, maior será a fluorescência emitida, pois maior será a quantidade de
DNA fita dupla sendo sintetizada. Desse modo, a progressão de fluorescência será proporcional
à quantidade de DNA amplificado a cada ciclo, até que a reação atinja sua saturação, e um platô
após a curva de crescimento exponencial será observado (Figura 12). Repare que, quando não
está ligado ao DNA dupla fita, devido à sua desnaturação, o SYBR não emite fluorescência. Ao
ligar-se à fita dupla de DNA, durante a sua extensão, a fluorescência é emitida.
 
Fonte: Cindy J. Smith, A. Mark Osborn, 2009
 Figura 12: Esquema ilustrando a teoria por trás da fluorescência do SYBR.
É importante considerarmos que essa interação entre o SYBR e a fita dupla de DNA não é
controlada – o SYBR irá se intercalar com qualquer fita dupla de DNA. Isso faz com que a
emissão de fluorescência seja menos específica: como em uma reação convencional, apenas os
oligonucleotídeos iniciadores são responsáveis pela especificidade. Assim, outras formas de
controle da reação foram criadas para garantirmos que o sinal fluorescente usado na
quantificação corresponde apenas ao produto desejado.
Portanto, adicionamos um passo a mais a qPCR: a curva de dissociação (melting curve ).
Nessa etapa, o termociclador aquecerá a PCR lentamente, para medir em qual temperatura 50%
das fitas duplas de DNA sintetizadas se dissociam. Essa dissociação será medida, mais uma
vez, através da fluorescência pelo SYBR. Essa temperatura dependerá de dois fatores principais:
o conteúdo CG e o tamanho da sequência. Por isso, reações de SYBR tem amplicons com
tamanho limitado em cerca de 100 nucleotídeos em média. Em uma curva de dissociação boa e
específica, todas as moléculas amplificadas irão se dissociar na mesma temperatura e, assim, só
um pico é observado no gráfico. Em uma qPCR por SYBR sem especificidade, mais de um pico
será visto na curva de dissociação, e a reação precisará ser ajustada. Esse é um importante nível
de controle de qualidade da reação que não deverá ser ignorado.
Note na figura a seguir, a existência de um único pico (a 76,49 °C) indica que há apenas um
produto amplificado, o que confirma a especificidade da qPCR.
 
Fonte: EnsineMe.
 Figura ilustrativa: Exemplo de resultado de uma curva de dissociação dos produtos de uma
qPCR por SYBR Green.
QUANTIFICAÇÃO ABSOLUTA POR SYBR
TAQMAN
Outra forma bastante comum de qPCR é chamada de TaqMan, cujo nome vem da referência ao
jogo de videogame dos anos 1980, PacMan. Assim como na técnica SYBR, a quantificação em
tempo real na TaqMan ocorre através da emissão e detecção de fluorescência a cada ciclo de
amplificação. Entretanto, a TaqMan difere do SYBR na forma como a emissão da fluorescência
acontece. No TaqMan, além de todos os reagentes que uma PCR convencional possui, temos a
presença de uma sequência extra, complementar à região interna dos iniciadores. Essa
sequência extra é conhecida como sonda e é curta, com tamanho aproximadamente igual ao dos
oligonucleotídeos iniciadores, e possui temperatura de anelamento pouco superior à deles. A
sonda contém uma molécula fluorescente na extremidade 5’, e uma outra molécula na
extremidade 3’, que bloqueia a emissão de fluorescência.
A existência de uma sonda que se anela à região alvo a ser amplificada não representa muito, se
a molécula fluorescente não for liberada de seu bloqueador. Para isso, a enzima Taq polimerase
usada na TaqMan é diferente das outras Taq polimerases. Ela adiciona nucleotídeos
(polimerização), como as demais polimerases, e remove nucleotídeos (função exonuclease).
A remoção de nucleotídeos é fundamental para a detecção da fluorescência, pois, quando
a enzima chega ao nucleotídeo da sonda que contém o fluoróforo e o remove da sequência, o
fluoróforo estará livre de seu bloqueador e poderá emitir fluorescência detectável (Figura 13). A
cada novo ciclo da PCR, as fitas duplas serão desnaturadas, os iniciadores e a sonda se
anelarão, e a TaqMan polimerase fará síntese do DNA. Com remoção dos nucleotídeos da
sonda, o fluoróforo nela contida é liberado para emitir fluorescência proporcional a cada nova
sequência-alvo sintetizada.
Repare na ilustração que a sonda anelada entre os dois iniciadores é clivada pela TaqMan
polimerase durante a extensão do DNA, permitindo a emissão de fluorescência.
 
Fonte: Shutterstock.com
 Figura 13: Representação esquemática da qPCR pelo método de TaqMan.
 SAIBA MAIS
A TaqMan apresenta uma vantagem extra para especificidade da reação: o anelamento da sonda
é específico para a região alvo a ser amplificada. A especificidade dada pela sonda é tamanha
que diferenças de apenas um nucleotídeo podem ser detectadas – essas mutações são
conhecidas como single nucleotide polymorphism (SNP) .
Assim sendo, a TaqMan dispensa técnica complementar para avaliação da especificidade, como
a curva de dissociação, o que a faz mais rápida do que a técnica de SYBR. Entretanto, as sondas
tornam a reação mais cara. Outra vantagem que a TaqMan traz em relação ao SYBR é a
capacidade de múltiplas detecções na mesma reação com maior precisão e confiabilidade.
Veremos isso em mais detalhes à frente.
Tanto a técnica de SYBR quanto a TaqMan são capazes de quantificar o DNA ou cDNA. A técnica
como a quantificação é obtida varia, mas a maioria das análises posteriores podem ser usadas
igualmente – uma vez que resultados confiáveis tenham sido obtidos através de rigoroso controle
de qualidade.
QUANTIFICAÇÃO
Na qPCR, cada ciclo desnaturação-anelamento-extensão produzirá fluorescência, que será
detectada pelo aparelho.

Primeiro, deve-se ajustar o programa do aparelho para que ele saiba qual laser e quais filtros
usar para a excitação de cada fluoróforo e em qual espectro da emissão ele deverá buscar o
sinal para detecção. Em outras palavras, você é o responsável em dizer ao aparelho o que ele
deve fazer.
Em seguida, o aparelho determinará, nos ciclos iniciais de amplificação, qual é o nível em que o
sinal obtido é superior ao sinal de ruído. Como a qPCR utiliza fluoróforos para a quantificação,
por vezes existe um “vazamento” de fluorescência no início da reação que não está relacionada
com a amplificação da sequência-alvo em si. Esse sinal inespecífico, geralmente, obtido nos
primeiros ciclos, chamamos de sinal de ruído, ou background , em inglês. O ruído vai ser
utilizado para determinar o limiar de detecção.


O primeiro ciclo em que a fluorescência de uma determinada amostra ultrapassa o limiar de
detecção acima do ruído (Ou da fluorescência de base) é chamado de valor de Ct. Esse valor
é importante por estar diretamente relacionado à quantidade inicial de DNA-alvo da amostra
amplificada. A relação entre concentração inicial de DNA-alvo na amostra e Ct é inversamente
proporcional, o que significa que, quanto menor for o Ct de uma amostra, maior a
quantidade de DNA que ela originalmente continha.
Outros dois parâmetros usados pelo aparelho para ajustar (Ou normalizar) a reação
internamente são a ROX, um fluoróforo passivo usado como referência, e o Rn, que representa
um ajuste (Ou normalização) entre o sinal do fluoróforo de escolha (SYBR ou da sonda TaqMan)
e a referência ROX. A maioria dos reagentes para qPCR já possuem ROX adicionados ao
tampão, cabendo a nós apenas a observaçãopara eventual detecção de anomalias que podem
invalidar a reação. Mais uma vez, a qPCR tem que manter padrões rígidos de controle de
qualidade para que diferenças mínimas na quantidade sejam confiáveis.
FLUORÓFORO PASSIVO
Cuja fluorescência não aumenta de acordo com a amplificação do DNA.


Com todos esses fatores ajustados corretamente, os aparelhos mais modernos detectarão o
sinal emitido a cada ciclo e darão, em tempo real, o resultado na tela do computador ao qual ele
precisa estar ligado para funcionar, em um gráfico chamado de curva de amplificação.
Veja o exemplo de gráfico de amplificação para o gene Suc2 da Saccharomyces cerevisae .
Note a reta paralela ao eixo x (horizontal), que representa o valor de limiar de detecção /
javascript:void(0)
quantificação. Abaixo dela, temos o ruído da reação. As curvas amarelas e vermelhas
representam a quantificação das amostras e, como você pode observar, existem 4 amostras em
duplicata; a com maior quantidade de DNA é a mais à esquerda no gráfico, com menor Ct.
Você consegue dizer qual é o Ct da amostra mais concentrada?
 
Fonte: EnsineMe.
 Figura 14: Gráfico de amplificação.
Existem duas formas de se quantificar o produto amplificado:
PELA CURVA PADRÃO
Em muitos casos, a quantificação absoluta do DNA alvo na amostra é necessária. Para isso,
devemos ter em mãos uma curva padrão, com concentrações conhecidas do DNA alvo. Essa
curva pode ser comprada de laboratórios especializados em sua fabricação ou produzida por nós
mesmos, através de clonagens e purificação. A partir da concentração mais alta, faremos uma
diluição seriada. Para isso, colocamos uma fração da solução de maior concentração em um
tubo contendo apenas água, e depois deste tubo para outro com apenas água, e assim
sucessivamente até termos pelo menos 5 pontos de curva.
 
Fonte: Shutterstock.com
 Diluição seriada usando a escala em mililitro (mL) para a nossa metodologia é utilizado em
microlitro (µL).
Em seguida, informamos ao aparelho em quais posições cada concentração da curva está, de
forma que o próprio computador calcule os parâmetros de qualidade da curva. Com esses
valores, o computador calcula a quantidade de DNA existente nas nossas amostras de
concentração desconhecida. Alguns dos principais valores dados pela curva padrão que usamos
para determinar a concentração da amostra-teste são a linearidade da curva e a eficiência de
amplificação.
Repare na imagem a seguir que existem 5 quantidades diferentes da curva padrão (em
vermelho), obtidas pela diluição seriada, e três amostras desconhecidas (em azul) cuja
quantidade de DNA foi calculada a partir de seus Cts e com base na linearidade da curva padrão.
 
Fonte: EnsineMe.
 Exemplo de curva padrão para quantificação absoluta do DNA.
LINEARIDADE DA CURVA
Matematicamente conhecida como R2,, deve ser superior a 0.985 para que a reação seja
aceitável, e a quantificação de sua amostra-teste seja calculada com máximo de precisão.
Usando fórmulas de linearidade, calculamos o valor preciso de DNA-alvo na amostra antes da
amplificação começar, baseado no Ct de cada uma.
EFICIÊNCIA DE AMPLIFICAÇÃO
Com ela, a cada ciclo, espera-se que a quantidade de DNA-alvo amplificado dobre, o que
significaria uma eficiência de 100% da reação. Porém, devido a pequenos erros, podemos
considerar aceitáveis eficiências que variem entre 90 e 110%. Esses parâmetros serão mais
robustos com uso de replicatas.
javascript:void(0)
REPLICATAS
São repetições da mesma reação em poços diferentes.
POR QUANTIFICAÇÃO RELATIVA, OU MÉTODO DE
DELTA-DELTA-CT (OU ΔΔCT)
Nesse método, você precisará quantificar dois DNA-alvos diferentes: o DNA de interesse, cuja
quantidade é desconhecida na amostra, e o DNA de referência. A determinação da quantidade
de um DNA-alvo de interesse é feita a partir da subtração (ou seja, o delta ) do Ct (ciclo em que
a amostra ultrapassou o limiar) pelo Ct do outro DNA quantificado na amostra, o de referência.
Isso porque, a quantidade do gene de interesse pode variar de acordo com diversos fatores
biológicos, mas também pode ser devido à quantidade de material usado na extração.
Nesse caso, o ideal é fazer uma normalização pela quantidade de cDNA total e, para isso,
usamos um cDNA de referência, que, geralmente, é um gene constitutivo expresso em níveis
estáveis nas células. O segundo delta, ou a segunda subtração, é feita entre a diferença da
primeira subtração na amostra-teste e uma amostra controle, usada como calibradora. A
amostra calibradora também precisará ter passado pela primeira subtração; ou seja, também
terá sido normalizada. Dessa forma, temos:
ΔCT 
Seguido por
ΔΔCT = (CTGENE ALVO –
 CTGENE DE REFERÊNCIA)CALIBRADOR –
 (CTGENE ALVO –
 CTGENE DE REFERÊNCIA)AMOSTRA 
 Atenção! Para visualização completa da equação utilize a rolagem horizontal
Essas subtrações são possíveis apenas quando as curvas de quantificação dos dois DNAs-alvo
têm eficiência entre 90-110%, e não devem diferir em mais de 10% entre si. Por isso, curvas
padrão iniciais para cada gene devem ser construídas para se verificar as eficiências da reação,
antes de procedermos para a técnica de quantificação relativa.
Se quisermos comparar a expressão de dois genes entre uma amostra e um calibrador, usamos
um método especial. Você consegue identificar qual? A pista mais importante é: você está
investigando a expressão gênica, e não a existência do gene em si. Portanto, você não está
olhando diretamente o genoma, mas um produto dele. Qual produto do DNA podemos detectar
via PCR?
 RESPOSTA
Se você respondeu RNA, acertou! Nesse caso, o nome correto e completo da técnica utilizada é
RT-qPCR: uma reação de transcrição reversa acoplada a uma reação em cadeia da polimerase
quantitativa.
PCR EM MULTIPLEX
Até agora, falamos sobre detectar apenas um DNA-alvo por reação, seja de PCR convencional,
nested-PCR, RT-PCR ou qPCR. Contudo, podemos detectar mais de um alvo por reação.
Precisaremos ajustar as reações separadamente, utilizando pares de oligonucleotídeos
iniciadores específicos para cada produto desejado, e depois fundir as duas PCRs em uma.
Esse tipo de PCR em que mais de um produto alvo é identificado chamamos de multiplex –
múltiplos produtos são detectados, e até quantificados.
Em uma PCR convencional, vamos utilizar todos os reagentes que já conversamos e, é claro, os
quatro (ou mais) oligonucleotídeos necessários, sendo cada par correspondente à sua
sequência-alvo. O mais importante para fazermos um multiplex em uma PCR convencional é que
os amplicons tenham tamanhos distintos o suficiente para serem separados pelo gel de
agarose para que os sinais de ultravioleta não sejam confundidos. Normalmente, os produtos
menores de 1000 pares de base (pb) devem ter mais de 200 pb de diferença. Para produtos
maiores de 1000 pb, a diferença entre os produtos também deve ser maior.
 ATENÇÃO
Lembre-se de que você deverá levar em consideração o tamanho do maior produto para o tempo
de extensão. Outro fator ao qual você deverá estar atento é a temperatura de anelamento dos
múltiplos pares de iniciadores, que devem ter temperaturas o mais próximas possível.
Em uma qPCR por TaqMan, a amplificação e quantificação de diferentes sequências na mesma
reação é possível ao utilizarmos duas (ou mais) sondas distintas, cada uma capaz de hibridizar
especificamente a sua sequência-alvo, e ambas marcadas com fluoróforos que se excitem e
emitam fluorescência em comprimentos de onda diferentes.
 EXEMPLO
Você poderá usar um fluoróforo que seja excitado no comprimento de onda azul e emita
fluorescência no espectro verde, e outro fluoróforo que seja excitado e floresça no comprimento
vermelho, e assim por diante.
Por outro lado, reações multiplex quantitativas usando o sistema SYBR são mais difíceis. Isso
porque a emissão de fluorescência pelo SYBR é inespecífica e ocorre sempre que o fluoróforo
intercala com fitas duplas do DNA. Assim, a reação multiplex fica limitada e, muitasvezes, não é
possível distinguirmos entre os sinais dos diferentes produtos. Em alguns casos, entretanto, a
distinção é possível graças à curva de dissociação. Isso ocorre quando os produtos distintos têm
sequências diferentes o suficiente para terem temperaturas de dissociação de 50%. Então,
observamos dois picos na curva de dissociação, em temperaturas diferentes. No entanto,
sequências distintas sem diferença suficiente em seus conteúdos CG não poderão ser
multiplexadas, pois não veremos diferenças em suas curvas de dissociação.
VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. A PCR É UMA TÉCNICA MUITO ÚTIL, ESPECIALMENTE, POR TER
VARIAÇÕES QUE PODEM SER AINDA MAIS INFORMATIVAS. SOBRE AS
VARIAÇÕES DA PCR, ASSINALE A ALTERNATIVA CORRETA:
A) Na nested-PCR, fazemos duas reações em um único tubo, amplificando regiões diferentes que
geram produtos de tamanhos distintos.
B) O SYBR é um fluoróforo presente em PCR multiplex que dá maior estabilidade à reação.
C) Na RT-PCR, ocorrem duas reações subsequentes: uma de síntese de cDNA a partir de RNA, e
outra de amplificação da sequência-alvo presente no cDNA.
D) Uma PCR multiplex consiste em utilizar duas reações subsequentes, sendo que o produto
amplificado da primeira serve como molde para amplificação na segunda.
E) A reação de transcrição reversa utiliza uma polimerase especial, capaz de sintetizar RNA a
partir de DNA.
2. VIMOS QUE PODEMOS QUANTIFICAR UMA OU MAIS SEQUÊNCIAS DE
DNA-ALVO ATRAVÉS DE QPCR. CONSIDERANDO O MATERIAL
ESTUDADO, ESCOLHA A ALTERNATIVA CORRETA:
A) A quantificação do DNA ou cDNA na amostra se dá através da intensidade do sinal total,
detectado pelo aparelho, dependendo apenas da fluorescência de ROX.
B) O SYBR e um fluoróforo que se liga de forma inespecífica ao DNA dupla hélice e, com isso, a
curva de dissociação informa qual é a quantidade de DNA para cada amostra.
C) A quantificação na técnica TaqMan é proporcional à fluorescência emitida na remoção de
nucleotídeos da sonda marcados com fluoróforos, o que permite a realização de reações
quantitativas multiplex.
D) A quantificação do DNA alvo pode ser feita pelo uso de curva padrão, em que as diferenças
entre Cts de dois genes é subtraída da diferença entre amostras-teste e amostra de calibração.
E) A quantificação de uma sequência em amostra-teste, de concentração desconhecida, é feita
por ΔΔCt, a partir da linearidade da diluição seriada.
GABARITO
1. A PCR é uma técnica muito útil, especialmente, por ter variações que podem ser ainda
mais informativas. Sobre as variações da PCR, assinale a alternativa correta:
A alternativa "C " está correta.
 
A Taq polimerase usada para amplificação de DNA não é capaz de reconhecer e polimerizar
RNA. Quando queremos analisar RNAm, precisamos que o cDNA seja sintetizado pela DNA-
polimerase RT dependente, ou transcriptase reversa. Então, usamos o cDNA sintetizado como
molde em uma PCR.
2. Vimos que podemos quantificar uma ou mais sequências de DNA-alvo através de
qPCR. Considerando o material estudado, escolha a alternativa correta:
A alternativa "C " está correta.
 
A qPCR-TaqMan possui uma enzima polimerase capaz tanto de polimerizar DNA quanto de
remover nucleotídeos. Quando a TaqMan chega à sonda, que é marcada com fluoróforo e
bloqueador, a enzima cliva os nucleotídeos, liberando o fluoróforo de seu bloqueador. Assim, o
fluoróforo poderá emitir seu sinal, que será proporcional à quantidade de sondas ligadas e
clivadas. Graças ao fato das sondas se ligarem especificamente às suas sequências alvo, e
serem passíveis de marcação por diferentes fluoróforos, qPCR-TaqMan multiplex são possíveis.
MÓDULO 3
 Identificar aplicações apropriadas ao uso de cada método
APLICAÇÕES DA PCR
Até agora, vimos os reagentes necessários à amplificação exponencial de uma sequência
específica de DNA até termos milhões e bilhões de cópias da mesma exata sequência, ou
amplicon , que pode ser visualizada a partir de técnicas especiais. Também vimos algumas
variações da PCR que a tornam ainda mais relevante e útil em diversos contextos.
Mas, afinal, para que precisamos de tantas sequências idênticas? Quais são as aplicações
disso? Vamos ver um pouco sobre alguns exemplos delas para ilustrar melhor o quão útil a PCR
é.
A PCR E AS SUAS VARIANTES EM CIÊNCIAS
FORENSES
A primeira, e talvez uma das mais famosas para o grande público, é a aplicação forense. Você já
deve ter entrado em contato com a identificação de um criminoso a partir do seu DNA deixado na
cena do crime, seja por ter assistido a alguma série policial seja por ter lido alguma reportagem
da vida real. Isso só é possível porque cada ser humano possui um genoma completamente
único, exceto de gêmeos idênticos.
Em nosso genoma, temos regiões especiais nas quais um cientista forense pode olhar para
confirmar a origem do DNA. Chamadas de marcadores moleculares, elas são conhecidas pela
alta frequência de polimorfismos genéticos – regiões com grande variação na sequência de
DNA entre indivíduos sem causar nenhum tipo de interferência funcional, pois são mais frequentes
em regiões não codificantes.
 
Fonte: Shutterstock.com
 ATENÇÃO
Um dos principais marcadores moleculares utilizados em análises forenses são as repetições
curtas em tandem (ou STRs – short tandem repeats , em inglês). As STRs variam em tamanho
e em conteúdo entre as pessoas e oferecem grande precisão na identificação de indivíduos se
a detecção de várias STRs for usada em conjunto.
As regiões de interesse são amplificadas por PCR e, em seguida, o perfil genético pode ser
visualizado por separação das bandas em gel de agarose e coloração por brometo de etídio.
Existem casos em que é necessário aumentar o material genético a ser usado para, assim,
aumentarmos o sinal durante a revelação. Nesse caso, o perito pode optar pelo uso de uma
nested-PCR, lembrando que os primers externos e interno precisam de regiões não repetidas
para se anelarem. Um cientista forense, além de fazer a extração do DNA e sua amplificação por
PCR, fará a identificação de indivíduos através do seu perfil genético.
 
Fonte: Shutterstock.com
 Ilustração de um gel de agarose mostrando múltiplas bandas e representando os marcadores
moleculares.
A PCR E AS VARIAÇÕES USADAS NO
DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS GENÉTICAS
Existe uma gama de aplicações de PCR e suas variações na Medicina, de prevenção ao
diagnóstico, acompanhamento e prognóstico, ou evolução, de doenças. Ao amplificarmos certas
regiões do DNA, podemos identificar a presença ou ausência de sequências que deveriam ou
não existir em determinado contexto. Seu uso pode auxiliar, ou até mesmo determinar, o
diagnóstico de diversas doenças que variam desde genéticas a infecciosas. As doenças
genéticas podem ser muito complexas em sua apresentação e possuir diferentes perfis –
autossômico dominante ou recessivo, ligado ao cromossomo X, multifatoriais e multigênicas. O
uso da PCR no diagnóstico dessas doenças pode ser feito de diversas maneiras, dependendo
de qual é a doença e de seu perfil genético.
 
Fonte: Shutterstock.com
O PCR multiplex pode ser utilizado para verificar qual alelo está sendo expresso, dentre dois
alelos distintos, em uma mesma reação e assim ajudar no reconhecimento de pequenas
mutações que levariam ao desenvolvimento de uma doença genética. Mas temos outras
aplicações, usando PCR convencional. Vamos usar a doença de Huntington como exemplo.
Nessa doença genética autossômica dominante, ocorre um excesso de repetição de três
nucleotídeos (CAG) do DNA que codifica uma proteína chamada Huntingtina. Esse excesso leva
a uma doença neurodegenerativa sem cura que causa perdas motoras, cognitivas e psiquiátricas
ainda na idade adulta, apesar de poder aparecer em forma juvenil também. A PCR torna-se uma
importante ferramenta diagnóstica, pois, ao amplificar sequências próximas da região de
repetição, pode nos dizer seu tamanho e, assim, informar o risco e até o prognóstico da doença
em si.
Em um gene saudável, é normal tercerca de 20 repetições (CAG); em pessoas portadoras de
Huntington, o número de repetições aumenta para 35 ou mais. De modo geral, quanto maior o
número de repetições, maior o risco de aparecimento e de progressão da doença. Essa
gradação de fenótipo – no caso da doença de Huntington, de sintomas – é algo conhecido em
genética como penetrância.
 ATENÇÃO
Lembre-se de que, para regiões repetitivas, é necessário usar iniciadores que se anelem
próximo a STRs, mas não nas STRs em si, pois isso geraria inespecificidade e muitas bandas
em um gel de agarose.
A PCR E AS VARIAÇÕES USADAS NO
DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS INFECCIOSAS
Outro exemplo diagnóstico que você já pode ter ouvido falar é o uso da PCR para diagnóstico
de doenças infecciosas. Ao utilizar a técnica para amplificar o DNA (ou RNA) de algum agente
infeccioso, podemos diagnosticar uma infecção, já que o material genético de tal agente não
deveria estar presente naquela amostra biológica. Sua simples presença pode indicar o agente
etiológico e, assim, descobrir a causa da doença. A PCR é especialmente útil no diagnóstico de
organismos fastidiosos, que não crescem bem em cultivo, como o Mycobacterium tuberculosis ,
por possuir alta sensibilidade e especificidade. Em outros casos, a presença do material
genético de um determinado microrganismo não é suficiente para seu diagnóstico como agente
causador da doença, e testes complementares a PCR podem ser necessários, assim como
técnicas de PCR mais elaboradas que darão maiores informações.
 
Fonte: Shutterstock.com
Temos, como exemplo, o diagnóstico molecular de COVID-19. O SARS-CoV2, assim como os
demais coronavírus, tem RNA fita simples como material genético. Dessa forma, usamos a
transcrição reversa para sintetizarmos um cDNA viral, e o utilizamos em qPCR – ou seja, fazemos
uma RT-qPCR. Esse é considerado o melhor teste, ou padrão-ouro, para a identificação de
casos ativos de infecção pelo SARS-CoV2. Isso porque, o material genético viral é identificado
de forma relativamente rápida – entre coleta, extração, RT e qPCR, o resultado pode sair em
algumas horas. Além disso, esse método é muito sensível e específico, conseguindo detectar nas
amostras pequenas concentrações do vírus (carga viral).
 
Fonte: Shutterstock.com
A RT-qPCR também é utilizada no diagnóstico e acompanhamento de outras infecções virais. A
efetividade do tratamento para HIV pode ser monitorada através de RT-qPCR, sendo esperadas
reduções drásticas na carga viral após introdução da terapia. O mesmo princípio de quantificação
de cDNA obtido por transcrição reversa também é aplicado em tratamentos oncológicos,
especialmente, em leucemias e linfomas: o oncologista pode requerer uma RT-qPCR para
acompanhamento de determinado marcador gênico do câncer em questão. Nos dois
casos, a redução (ou não) das sequências alvo na RT-qPCR ao longo do tempo podem ser
cruciais no tratamento e evolução do paciente. A PCR convencional multiplex também pode
ser utilizada no diagnóstico diferencial entre dois patógenos que possam causar os
mesmos sintomas, mas que exigem abordagens clínicas diferentes.
 EXEMPLO
Um paciente transplantado renal pode apresentar alteração em exames bioquímicos que levem o
nefrologista a pensar em duas possibilidades: na primeira, uma infecção por um vírus sem
gravidade pode estar acontecendo no órgão, e nenhum tratamento seria necessário; na segunda,
pode estar acontecendo uma infecção viral grave no rim transplantado que poderia rapidamente
levar à perda do órgão e até mesmo ao óbito do paciente.
Nesse último caso, seria necessário reduzir as drogas que suprimem o sistema imunológico e
impedem que o paciente rejeite o rim novo, para que o próprio sistema imunológico consiga
combater a infecção viral – o que leva ao risco de o paciente rejeitar o órgão enxertado. Uma
PCR multiplex poderia identificar a presença ou ausência de dois ou mais tipos de genomas
virais na urina ou sangue do paciente, acelerando o diagnóstico e a tomada de decisão por parte
do médico nefrologista.
A PCR E AS SUAS VARIANTES EM PESQUISA
CIENTÍFICA
Outro campo que utiliza a PCR é a pesquisa científica. Em diversas ocasiões, a PCR pode ser
utilizada para manipulação genética de organismos simples, como bactérias, leveduras e células
em cultivo. Nesse contexto, podemos usar a PCR para, por exemplo, clonarmos um gene.
Fazemos isso ao amplificarmos a sequência gênica que desejamos clonar usando
oligonucleotídeos longos que têm duas regiões distintas. A primeira região liga-se ao gene que
queremos manipular – deletar, adicionar ou mutar – no organismo alvo; a segunda é a região que
se liga ao DNA molde do vetor dentro do qual queremos colocar nosso gene clonado.
O vetor é, em muitos casos, uma sequência independente do genoma do organismo alvo, mas
que é capaz de se replicar autonomamente quando inserido na célula. Um exemplo de vetores
muito usados são os plasmídeos, pequenos DNA circulares autorreplicantes e transferíveis de
uma célula a outra, comuns em bactérias.
 
Fonte: Takometer/Wikimedia commons/licença(CC BY 2.5).
 Figura 14: Representação esquemática de uma técnica de clonagem por restrição, com a
inserção (ou clonagem) de um gene de origem diferente, que foi amplificado por PCR, ao vetor
original.
Normalmente, usamos a clonagem por PCR em duas etapas: uma para amplificarmos o gene
alvo que queremos clonar; na segunda etapa, usamos o produto amplificado, juntamente com o
vetor, para inserirmos o gene clonado no vetor. Outra forma de clonagem inclui o uso de enzimas
de restrição para cortar o DNA em pontos específicos, após amplificação por PCR.
 SAIBA MAIS
A pesquisa científica é uma área de atuação muito grande e, por vezes, ela está interessada em
entender mecanismos complexos de regulação genética sob diversas condições. A RT-qPCR é
uma ferramenta muito útil nesse caso, para a avaliação dos níveis de expressão de genes
em células submetidas a diversas condições diferentes.
É comum utilizarmos a quantificação relativa (em que comparamos a quantidade de um gene de
interesse com um gene constitutivo de expressão estável) para avaliarmos como o metabolismo
celular pode mudar mediante o meio que se encontra. Em geral, você pode considerar que
qualquer aplicação que determinado método ou técnica tenha em rotinas laboratoriais das mais
diversas áreas não apenas é usada em pesquisa científica, como, provavelmente, foi originada
de uma.
QUANTIFICAÇÃO RELATIVA DE GENES POR
RT-QPCR E SEU USO EM PESQUISA
VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. A RESPEITO DA APLICAÇÃO DA PCR E DE SUAS VARIAÇÕES EM
CIÊNCIAS FORENSES, É CORRETO AFIRMAR QUE:
A) A nested-PCR não é útil, uma vez que o material genético é encontrado em abundância em
situações forenses.
B) A PCR pode nos dar informações importantes, mas não pode determinar a identidade de
indivíduos.
C) As STRs são regiões cuja variabilidade as tornam úteis para distinguir indivíduos
geneticamente.
D) A qPCR é uma ferramenta necessária para amplificação do material genético de uma amostra
antes de seu sequenciamento.
E) O sequenciamento do genoma não é uma ferramenta viável para a identificação de indivíduos,
além de ser trabalhoso e caro.
2. ESCOLHA A ALTERNATIVA INCORRETA:
A) A RT-qPCR é a técnica considerada ideal para diagnóstico do SARS-CoV2.
B) Podemos usar PCR convencional para amplificar um gene e cloná-lo em um vetor, e
modificarmos geneticamente um organismo simples.
C) Pelo uso de diferentes sondas marcadas com sinais diferentes, a qPCR-TaqMan pode ser
usada na identificação e quantificação de mutações em diferentes alelos.
D) As técnicas moleculares são de pouca importância na rotina clínica, pois são demoradas e de
aplicações muito restritas.
E) O tamanho de STRs é relevante no diagnóstico de doenças genéticas, pois as STRs sempre
estão localizadas em regiões não-codificantes.
GABARITO
1. A respeito da aplicação da PCR e de suas variações em ciências forenses, é correto
afirmar que:
A alternativa"C " está correta.
 
Short tandem repeats (STRs) apresentam grande variação de sequência e de tamanho entre
indivíduos. Pela identificação de diferentes padrões de um conjunto de STRs, podemos
correlacionar amostras com grande precisão, além ser possível também estabelecer grau de
parentesco.
2. Escolha a alternativa incorreta:
A alternativa "D " está correta.
 
As técnicas moleculares, como a PCR e as suas variações, têm ganhado muito espaço na rotina
clínica. Há situações em que o diagnóstico por amplificação de ácidos nucleicos é o padrão-ouro
e, às vezes, é a única opção. Suas aplicações vão de diagnóstico de doenças genéticas e
infecciosas ao acompanhamento da evolução e tratamento de cânceres e infecções crônicas,
assim como determinação de riscos genéticos e aconselhamentos.
CONCLUSÃO
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Vimos que a amplificação de DNA in vitro é feita pela reação em cadeia da polimerase, em que
a variação cíclica de temperatura permite a desnaturação, o anelamento e a extensão de
sequências-alvo específicas, de acordo com aquelas que desejamos detectar. Como estudado,
os oligonucleotídeos iniciadores se ligam à fita simples de DNA que foi aberta por desnaturação
por complementariedade entre as bases nitrogenadas. Essas últimas são elementos
fundamentais dos nucleotídeos por conterem a informação genética.
As variações da PCR são úteis de diferentes formas, e devemos conhecê-las para podermos
escolher qual a melhor técnica para cada caso: para aumentar a quantidade final de DNA-alvo
amplificado, para síntese de cDNA a partir de RNA polaridade positiva, para quantificação de
DNA ou cDNA e para diferenciação rápida entre diferentes produtos de amplificação.
Além disso, aprendemos algumas das diversas aplicações que a PCR e as suas variações têm
em áreas da ciência, como na forense, na pesquisa e na clínica, participando do diagnóstico,
acompanhamento e prognóstico.
Agora você está pronto para continuar progredindo no conhecimento da Biologia Molecular, uma
área empolgante e que se torna, a cada dia, mais importante para diversas áreas das ciências
biológicas.
REFERÊNCIAS
ASSOCIAÇÃO BRASIL HUNTINGTON. O que é a Doença de Huntington. In : ABH.
Consultado em meio eletrônico em: 18 out. 2020.
CABELLO, G. M. K. Genética Clínica: Métodos de diagnóstico. In : DBBM FIOCRUZ.
Consultado em meio eletrônico em: 18 out. 2020.
DOLINSKY, L. C.; PEREIRA, L. M. C. V. DNA forense: Artigo de revisão. In : Saúde & Ambiente
em Revista, 2(2), p11-22, 2007.
NELSON, D. L. Princípios de bioquímica de Lehninger. Porto Alegre: Artmed, 2014.
NEW ENGLAND BIOLABS’ FEATURE ARTICLES. Polymerase Fidelity: What is it, and what
does it mean for your PCR? In : NEB. Consultado em meio eletrônico em: 18 out. 2020.
REAL-TIME PCR BASICS. TaqMan vs. SYBR Chemistry for Real-Time PCR. In :
ThermoFisher Scientific website. Consultado em meio eletrônico em: 18 out. 2020.
VANDESOMPELE, J. Q. PCR Guide por Eurogentec – plataforma GenEx. In : Gene
Quantification. Consultado em meio eletrônico em: 18 out. 2020.
ZHAO, M.; et al . Improved high sensitivity screen for Huntington disease using a one-
step tripletprimed PCR and melting curve assay. In : PLoS ONE. Consultado em meio
eletrônico em: 18 out. 2020.
EXPLORE+
Para aprofundar os seus conhecimentos no assunto deste tema:
Acesse o conteúdo de Biologia (DNA como o material genético: Replicação do DNA) no
portal da Khan Academy para maiores detalhes e vídeos sobre replicação do DNA.
Assista ao vídeo “4. Teste de Paternidade”, no canal do Youtube de Carlos Simeão, material
produzido pela USP-UNIVEST. Você aprenderá mais sobre a variabilidade genética
estudada em análises forenses e em testes de paternidade.
Assista ao vídeo “Técnicas de Biologia Molecular – PCR- Animação 3D”, no canal do
Youtube de Carlos Simeão, material produzido pela USP-UNIVEST. Você irá conhecer o
passo a passo da técnica de PCR.
Aprendemos a tão famosa técnica de PCR, para conhecer mais sobre a história do PCR
leia o texto O desenvolvimento da reação em cadeia pela polimerase (PCR).
Conhecemos algumas técnicas de PCR, para apreender um pouco mais sobre esse
assunto leia Outras aplicações da PCR e as suas variações.
CONTEUDISTA
Camila Freze Baez
 CURRÍCULO LATTES
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