Biologia Molecular

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Indaial – 2020
Biologia Molecular
Prof.ª Letícia da Silva Pereira Fernandes
1a Edição
Copyright © UNIASSELVI 2020
Elaboração:
Prof.ª Letícia da Silva Pereira Fernandes
Revisão, Diagramação e Produção:
Centro Universitário Leonardo da Vinci – UNIASSELVI
Ficha catalográfica elaborada na fonte pela Biblioteca Dante Alighieri 
UNIASSELVI – Indaial.
Impresso por:
F363b
 Fernandes, Letícia da Silva Pereira
 Biologia molecular. / Letícia da Silva Pereira Fernandes. – Indaial: 
UNIASSELVI, 2020.
 180 p.; il.
 ISBN 978-65-5663-345-9
 ISBN Digital 978-65-5663-346-6
1. Biologia molecular. - Brasil. II. Centro Universitário Leonardo da Vinci.
CDD 575.173
apresentação
Olá, acadêmico! Seja bem-vindo ao Livro Didático Biologia Molecular! 
Este livro está dividido em três unidades, as quais apresentam o principal 
objetivo de apresentar conceitos básicos e um pouco da história por trás dos 
avanços nas técnicas de biologia molecular. 
Lembre-se que a biologia molecular é um campo que está 
constantemente inovando e em busca de soluções para os estudos que focam 
em DNA, RNA, proteínas e outras biomoléculas. A biologia molecular trata 
de componentes essenciais à vida e de muita importância para as áreas 
biológicas e da saúde, por isso a aplicação dessas técnicas está cada vez 
mais presente no dia a dia da medicina diagnóstica e da pesquisa básica, na 
busca por tratamento e cura para as mais diversas doenças e, portanto, no 
entendimento da complexidade da vida!
Na primeira unidade, nosso foco será voltado à origem e explanação 
de técnicas básicas de biologia molecular, como o isolamento, clonagem e 
sequenciamento de DNA e a reação em cadeia da polimerase (PCR), as quais 
serão de extrema importância para o entendimento das demais técnicas 
abordadas ao longo do livro. 
Na Unidade 2, avançaremos para uma área mais complexa da Biologia 
Molecular e aprenderemos sobre as chamadas ciências “ômicas”. Nessa 
unidade, trataremos de um dos maiores avanços científicos dos últimos anos, 
o Projeto Genoma Humano (PGH), e veremos como esse projeto contribuiu 
para avanços que culminaram na era “ômica”, com o desenvolvimento de 
técnicas avançadas de estudo do genoma, do proteoma, do mataboloma e de 
outros “omas”.
Por fim, com todo o conhecimento adquirido ao longo das duas 
primeiras unidades, na terceira unidade deste livro trataremos da aplicação 
prática das técnicas abordada. Você será apresentado a um dos campos de 
atuação do biomédico em que essas técnicas avançadas de biologia molecular 
podem ser aplicadas. Entre elas, estão os testes diagnósticos moleculares e 
a melhora da qualidade de vida de pacientes por meio das investigações 
voltadas ao desempenho esportivo e nutricional. 
De maneira geral, o conteúdo abordado neste livro é apresentado 
de maneira prática e direcionado para que você, futuro biomédico, esteja 
preparado para conhecer e atuar aplicando a biologia molecular ou 
desenvolvendo novas metodologias nesta fantástica área!
Bons estudos!
Dra. Letícia da Silva Pereira Fernandes
Você já me conhece das outras disciplinas? Não? É calouro? Enfim, tanto 
para você que está chegando agora à UNIASSELVI quanto para você que já é veterano, há 
novidades em nosso material.
Na Educação a Distância, o livro impresso, entregue a todos os acadêmicos desde 2005, é 
o material base da disciplina. A partir de 2017, nossos livros estão de visual novo, com um 
formato mais prático, que cabe na bolsa e facilita a leitura. 
O conteúdo continua na íntegra, mas a estrutura interna foi aperfeiçoada com nova 
diagramação no texto, aproveitando ao máximo o espaço da página, o que também 
contribui para diminuir a extração de árvores para produção de folhas de papel, por exemplo.
Assim, a UNIASSELVI, preocupando-se com o impacto de nossas ações sobre o ambiente, 
apresenta também este livro no formato digital. Assim, você, acadêmico, tem a possibilidade 
de estudá-lo com versatilidade nas telas do celular, tablet ou computador. 
 
Eu mesmo, UNI, ganhei um novo layout, você me verá frequentemente e surgirei para 
apresentar dicas de vídeos e outras fontes de conhecimento que complementam o assunto 
em questão. 
Todos esses ajustes foram pensados a partir de relatos que recebemos nas pesquisas 
institucionais sobre os materiais impressos, para que você, nossa maior prioridade, possa 
continuar seus estudos com um material de qualidade.
Aproveito o momento para convidá-lo para um bate-papo sobre o Exame Nacional de 
Desempenho de Estudantes – ENADE. 
 
Bons estudos!
NOTA
Olá, acadêmico! Iniciamos agora mais uma disciplina e com ela 
um novo conhecimento. 
Com o objetivo de enriquecer seu conhecimento, construímos, além do livro 
que está em suas mãos, uma rica trilha de aprendizagem, por meio dela você 
terá contato com o vídeo da disciplina, o objeto de aprendizagem, materiais complemen-
tares, entre outros, todos pensados e construídos na intenção de auxiliar seu crescimento.
Acesse o QR Code, que levará ao AVA, e veja as novidades que preparamos para seu estudo.
Conte conosco, estaremos juntos nesta caminhada!
LEMBRETE
suMário
UNIDADE 1 — O MATERIAL GENÉTICO E AS PRINCIPAIS TÉCNICAS DE 
 ISOLAMENTO E SEQUENCIAMENTO .............................................................. 1
TÓPICO 1 — ISOLAMENTO E CLONAGEM ................................................................................. 3
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................................... 3
2 ISOLAMENTO DE DNA OU RNA .................................................................................................. 5
2.1 ELETROFORESE EM GEL ............................................................................................................. 6
2.2 ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO ......................................................................................... 7
2.3 HIBRIDIZAÇÃO ............................................................................................................................. 9
3 CLONAGEM DE DNA ..................................................................................................................... 13
RESUMO DO TÓPICO 1..................................................................................................................... 16
AUTOATIVIDADE .............................................................................................................................. 17
TÓPICO 2 — REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) ............................................... 19
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................................. 19
2 PCR PASSO A PASSO ...................................................................................................................... 21
3 TRANSCRIÇÃO REVERSA ............................................................................................................ 23
4 PCR QUALITATIVO VS. PCR QUANTITATIVO ...................................................................... 25
RESUMO DO TÓPICO 2..................................................................................................................... 28
AUTOATIVIDADE .............................................................................................................................. 29
TÓPICO 3 — BIBLIOTECAS DE DNA E CDNA ........................................................................... 31
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................................. 31
2 BIBLIOTECA DE DNA OU GENÔMICA .................................................................................... 32
3 BIBLIOTECA DE CDNA ..................................................................................................................35
RESUMO DO TÓPICO 3..................................................................................................................... 37
AUTOATIVIDADE .............................................................................................................................. 38
TÓPICO 4 — SEQUENCIAMENTO DE DNA ............................................................................... 39
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................................. 39
2 MÉTODOS DE SANGER E SANGER AUTOMATIZADO ...................................................... 40
3 SEQUENCIAMENTO SHOTGUN .................................................................................................. 45
4 SEQUENCIAMENTO DE NOVA GERAÇÃO (NEXT GENERATION SEQUENCING - 
 NGS) .................................................................................................................................................... 46
5 SEQUENCIAMENTO DE TERCEIRA GERAÇÃO ..................................................................... 52
6 SEQUENCIAMENTO PORTÁTIL ................................................................................................. 53
LEITURA COMPLEMENTAR ............................................................................................................ 54
RESUMO DO TÓPICO 4..................................................................................................................... 57
AUTOATIVIDADE .............................................................................................................................. 58
REFERÊNCIAS ...................................................................................................................................... 59
UNIDADE 2 — GENÔMICA E AS DEMAIS “ÔMICAS” ........................................................... 61
TÓPICO 1 — GENÔMICA ................................................................................................................. 63
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................................. 63
2 GENÔMICA ESTRUTURAL ........................................................................................................... 64
3 MAPAS CROMOSSÔMICOS DE ALTA RESOLUÇÃO ........................................................... 67
4 MAPAS CROMOSSÔMICOS FÍSICOS ....................................................................................... 70
5 GENÔMICA FUNCIONAL ............................................................................................................. 72
6 POLIMORFISMO GENÉTICO ....................................................................................................... 81
RESUMO DO TÓPICO 1..................................................................................................................... 86
AUTOATIVIDADE .............................................................................................................................. 87
TÓPICO 2 — PROJETO GENOMA HUMANO ............................................................................. 89
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................................. 89
2 PGH ...................................................................................................................................................... 90
RESUMO DO TÓPICO 2..................................................................................................................... 95
AUTOATIVIDADE .............................................................................................................................. 96
TÓPICO 3 — AS DEMAIS “ÔMICAS” ............................................................................................ 97
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................................. 97
2 TRANSCRIPTÔMICA ...................................................................................................................... 98
3 PROTEÔMICA ................................................................................................................................. 103
4 METABOLÔMICA .......................................................................................................................... 113
LEITURA COMPLEMENTAR .......................................................................................................... 116
RESUMO DO TÓPICO 3................................................................................................................... 122
AUTOATIVIDADE ............................................................................................................................ 123
REFERÊNCIAS .................................................................................................................................... 124
UNIDADE 3 — DIAGNÓSTICO E OUTRAS APLICAÇÕES DAS DIVERSAS 
 TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR: POTENCIAIS ÁREAS 
 DE ATUAÇÃO DO BIOMÉDICO ...................................................................... 125
TÓPICO 1 — TESTES PRÉ-NATAIS, NEONATAIS E EM PRODUTOS DA 
 CONCEPÇÃO ............................................................................................................. 127
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................................ 127
2 TRIAGEM PRÉ-NATAL NÃO INVASIVA (NIPT) ................................................................... 128
3 TESTE DO PEZINHO (TRIAGEM NEONATAL) ...................................................................... 129
3.1 DOENÇA DA URINA DE XAROPE DE BORDO OU LEUCINOSE (MSUD) .................. 132
4 PERFIL METABÓLICO ASSOCIADO AOS ERROS INATOS DO METABOLISMO ...... 133
4.1 ÁCIDOS ORGÂNICOS URINÁRIOS ...................................................................................... 133
4.2 ACILCARNITINAS E AMINOÁCIDOS .................................................................................. 134
5 SURDEZ GENÉTICA OU SURDEZ HEREDITÁRIA .............................................................. 134
6 SEQUENCIAMENTO DE PRODUTO DE CONCEPÇÃO ...................................................... 135
RESUMO DO TÓPICO 1................................................................................................................... 137
AUTOATIVIDADE ............................................................................................................................ 138
TÓPICO 2 — TESTES ONCOLÓGICOS ....................................................................................... 139
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................................ 139
2 CÂNCER DE MAMA E DE OVÁRIO .......................................................................................... 140
3 POLIPOSE ADENOMATOSA FAMILIAR ................................................................................. 141
4 CÂNCER COLORRETAL ............................................................................................................... 142
5 PESQUISA DE CÂNCER HEREDITÁRIO ................................................................................. 142
6 BIÓPSIA LÍQUIDA ......................................................................................................................... 144
RESUMO DO TÓPICO 2................................................................................................................... 145
AUTOATIVIDADE ............................................................................................................................ 146
TÓPICO 3 — DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS E OUTROS TESTES...................................... 147
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................................ 147
2 DOENÇAS MITOCONDRIAIS .................................................................................................... 147
3 PERFIL GENÉTICO PARA DOENÇAS CARDIOVASCULARES ......................................... 148
4 ANÁLISE CROMOSSÔMICA POR MICROARRANJO ......................................................... 149
5 INTOLERÂNCIA À LACTOSE ..................................................................................................... 150
6 SEQUENCIAMENTO DO EXOMA ............................................................................................. 151
6.1 EXOMA DO RECÉM-NASCIDO .............................................................................................. 153
7 TESTE DE DNA OU TESTE DE PATERNIDADE ..................................................................... 153
8 SAÚDE ENDOMETRIAL – ENDOMETRITE CRÔNICA ...................................................... 156
8.1 ALICE – ANÁLISE DE ENDOMETRITE CRÔNICA INFECCIOSA................................... 157
8.2 EMMA – ANÁLISE METAGENÔMICA DO MICROBIOMA ENDOMETRIAL .............. 158
9 PLANEJAMENTO DE GRAVIDEZ – ACONSELHAMENTO GENÉTICO ......................... 160
10 ANCESTRALIDADE JUDAICA ASHKENAZI ....................................................................... 162
11 TRIMETILAMINÚRIA – TMAU1 .............................................................................................. 163
12 HIV E HEPATITES ......................................................................................................................... 164
13 INFECÇÕES RESPIRATÓRIAS .................................................................................................. 164
14 TROMBOFILIA .............................................................................................................................. 166
15 INFECÇÕES SEXUALMENTE TRANSMISSÍVEIS (IST) ..................................................... 166
15.1 PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) ................................................................................... 167
16 FARMACOGENÉTICA................................................................................................................. 167
17 AVALIAÇÃO DA MICROBIOTA INTESTINAL .................................................................... 169
18 NUTRIGENÉTICA ........................................................................................................................ 170
19 PERFIL GENÉTICO DESEMPENHO ESPORTIVO ............................................................... 170
20 SEQUENCIAMENTO COMPLETO DO GENOMA (WGS) ................................................. 171
LEITURA COMPLEMENTAR .......................................................................................................... 173
RESUMO DO TÓPICO 3................................................................................................................... 177
AUTOATIVIDADE ............................................................................................................................ 178
REFERÊNCIAS .................................................................................................................................... 179
1
UNIDADE 1 — 
O MATERIAL GENÉTICO E 
AS PRINCIPAIS TÉCNICAS DE 
ISOLAMENTO E SEQUENCIAMENTO
OBJETIVOS DE APRENDIZAGEM
PLANO DE ESTUDOS
A partir do estudo desta unidade, você deverá ser capaz de:
• investigar a origem do desenvolvimento de diversas técnicas de biologia 
molecular;
• identificar técnicas de isolamento e clonagem de fragmentos de DNA;
• ilustrar o funcionamento da técnica de PCR e suas principais aplicações;
• apontar como são formadas as bibliotecas de DNA e cDNA e seus 
diferentes objetivos;
• examinar as principais técnicas de sequenciamento de DNA.
Esta unidade está dividida em quatro tópicos. No decorrer da unidade, 
você encontrará autoatividades com o objetivo de reforçar o conteúdo 
apresentado.
TÓPICO 1 – ISOLAMENTO E CLONAGEM 
TÓPICO 2 – REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
TÓPICO 3 – BIBLIOTECAS DE DNA E CDNA
TÓPICO 4 – SEQUENCIAMENTO DE DNA
Preparado para ampliar seus conhecimentos? Respire e vamos 
em frente! Procure um ambiente que facilite a concentração, assim absorverá 
melhor as informações.
CHAMADA
2
3
TÓPICO 1 — 
UNIDADE 1
ISOLAMENTO E CLONAGEM
1 INTRODUÇÃO
Caros acadêmicos, antes de adentrarmos no universo das técnicas 
avançadas de biologia molecular, é preciso relembrar a origem e alguns conceitos 
básicos sobre a molécula de ácido desoxirribonucleico, o DNA, pois, a partir 
desses conhecimentos, que as técnicas conhecidas, atualmente, como técnicas de 
biologia molecular, foram desenvolvidas.
Embora, atualmente, seja comum o conhecimento de que o DNA é a 
molécula que possui as informações genéticas, até meados do século XX, sabia-se 
apenas da importância dessas informações – já denominadas de genes – para a 
manutenção da vida. No entanto, não havia clareza de qual molécula biológica 
poderia ser responsável por tão importante e complexa função. 
Com a descoberta, na década de 1950, por James Watson, Francis Crick, 
Maurice Wilkins e Rosalind Franklin, da estrutura de dupla hélice complementar 
do DNA (Figura 1), foi possível entender como a complexidade das informações 
contidas nos genes poderia ser replicada ou transmitida para outras células.
FIGURA 1 – ESTRUTURA EM DUPLA HÉLICE DO DNA - DR=DESOXIRRIBOSE; A=ADENINA; 
T=TIMINA; C=CITOSINA; G=GUANINA; P=FOSFATO
FONTE: Junqueira e Carneiro (2012, p. 57).
UNIDADE 1 — O MATERIAL GENÉTICO E AS PRINCIPAIS TÉCNICAS DE ISOLAMENTO E SEQUENCIAMENTO
4
Assim, após o conhecimento de que a estrutura de dupla hélice do DNA 
é formada por duas fitas lineares, compostas por uma sequência complementar 
formada por quatro nucleotídeos (adenina, citosina, guanina e timina ou A, C, 
G e T, respectivamente) (Figura 1), foi possível entender como a sequência de 
nucleotídeos de um determinado gene, presente no DNA, é responsável pela 
codificação da sequência complexa de aminoácidos que deverão ser sintetizados 
para formar uma determinada proteína.
Por fim, embora fosse conhecido que os genes presentes no DNA 
codificassem para a síntese de proteínas, observou-se que a síntese ocorria 
essencialmente onde o DNA não estava presente: no citosol. Dessa forma, veio 
à tona a descoberta do RNA, uma molécula semelhante ao DNA que também é 
formada por nucleotídeos, porém em uma única fita, na qual, em vez de timina, 
é encontrado o nucleotídeo uracila (Figura 2). Essa é molécula capaz de carregar 
as informações contidas no DNA para fora do núcleo (transcrição), servindo de 
molde para a síntese de proteínas (tradução) (Figura 3).
FIGURA 2 – ESTRUTURA DO RNA - C= CITOSINA; A= ADENINA; U=URACILA; G=GUANINA
FONTE: Adaptado de Alberts et al. (2008).
TÓPICO 1 — ISOLAMENTO E CLONAGEM
5
FIGURA 3 – ESQUEMA DNA → RNA → PROTEÍNA
FONTE: Adaptado de Alberts et al. (2008).
Em posse do conhecimento sobre estas importantes macromoléculas: o 
DNA, o RNA e as proteínas, e da sua íntima relação umas com as outras, iniciaram-
se os estudos relativos aos processos intracelulares de manutenção, reparo e 
síntese desses componentes e das demais moléculas envolvidas nestes processos. 
Esses estudos estão englobados em áreas conhecidas como genética molecular 
ou biologia molecular e incluem a aplicação de técnicas e modelos baseados 
no entendimento de como os processos intracelulares ocorrem. Tais técnicas 
incluem o isolamento de moléculas, como um gene, a clonagem, a amplificação e 
o sequenciamento de um fragmento de DNA, metodologias que serão abordadas 
com mais detalhes nesta unidade. 
2 ISOLAMENTO DE DNA OU RNA
Para que seja possível investigar uma molécula, um fragmento de DNA ou 
mesmo um gene específico, é preciso isolá-la dos demais componentescelulares 
e das demais moléculas de DNA ou dos demais genes, pois, mesmo que seja 
feita a extração do DNA de uma determinada amostra celular ou tecidual, todo o 
DNA presente na amostra será extraído em conjunto e, assim, será necessário que 
alguma técnica de isolamento seja aplicada para que apenas o fragmento de DNA 
de interesse seja isolado dos demais. 
UNIDADE 1 — O MATERIAL GENÉTICO E AS PRINCIPAIS TÉCNICAS DE ISOLAMENTO E SEQUENCIAMENTO
6
2.1 ELETROFORESE EM GEL
A técnica mais simplificada de separação, aplicável a moléculas de DNA, 
RNA ou até mesmo a proteínas, é pelo tamanho da molécula e se dá por meio de 
uma eletroforese em gel, o qual pode ser composto por poliacrilamida ou agarose. 
Nessa técnica de isolamento, uma corrente elétrica é transmitida através do gel, 
o qual se encontra imerso em solução tampão, do polo negativo (cátodo) para o 
polo positivo (ânodo) e, por meio das cargas negativas presentes nas moléculas 
de DNA, elas são carreadas por afinidade para o polo positivo do gel (Figura 4). 
Esse carreamento acontece porque o gel utilizado na técnica possui a 
porosidade necessária para que as moléculas se movimentem por ele. Dessa 
forma, moléculas maiores tendem a apresentar maior dificuldade de migrar 
pelo gel, enquanto moléculas menores apresentam maior facilidade para essa 
movimentação. Assim, as moléculas são separadas em populações contendo 
moléculas de tamanho semelhante, o que posteriormente será visualizado em 
um formato que chamamos de bandas no gel, formando um gradiente, sendo as 
menores encontradas mais próximas ao polo positivo e as maiores permanecendo 
próximas ao polo negativo.
FIGURA 4 – ELETROFORESE EM GEL - A – APARATO PARA ELETROFORESE VERTICAL; B – APA-
RATO PARA ELETROFORESE HORIZONTAL
FONTE: A – Adaptado de Alberts et al. (2008); B – Adaptado de Watson et al. (2015).
Após a separação no gel, ele deve ser corado com corantes fluorescentes, 
que se ligam ao DNA, possibilitando a visualização das bandas formadas pelas 
populações da molécula. O corante fluorescente mais conhecido e aplicado em 
géis de eletroforese de DNA e RNA é o brometo de etídio, que, após a coloração, 
permite que as bandas sejam visualizadas sob luz ultravioleta (UV).
Amostra
cátodo
tampão
gel
tampão
ânodo
tampão gel de agarosefragmentos de DNA
cuba de eletroforese
os fragmentos de DNA 
menores deslocam-se mais 
rápido ao longo do gel do 
que os fragmentos maiores
eletrodo
(cátodo)
eletrodo
(cátodo)
eletrodo
(ânodo)
eletrodo
(ânodo)
TÓPICO 1 — ISOLAMENTO E CLONAGEM
7
Um detalhe dessa técnica é a escolha de agarose ou poliacrilamida como 
matriz do gel. Embora ambas sejam aplicáveis para o isolamento de moléculas 
de acordo com seu tamanho, é importante ressaltar que a escolha depende do 
tamanho da molécula a ser isolada e do objetivo do isolamento. 
A poliacrilamida forma um gel de maior resolução, ou seja, fragmentos 
de DNA com até mesmo uma única base nitrogenada de diferença podem ser 
separados. No entanto, uma menor faixa de tamanho das moléculas pode se 
movimentar nesse tipo de matriz. 
A agarose, por sua vez, apresenta menor resolução, o que significa que 
cada banda presente no gel representa um agrupamento de moléculas de tamanho 
semelhantes. No entanto, fragmentos maiores de DNA podem facilmente migrar 
por essa matriz. 
Assista a um esquema exemplificando uma eletroforese em gel de agarose 
em https://www.youtube.com/watch?v=B2KLuzD_suQ. Você também pode assistir a uma 
prática demonstrativa através do link https://www.youtube.com/watch?v=08wqFHbFMtg.
DICAS
Ainda assim, vale lembrar que uma única molécula de DNA íntegra pode 
conter milhares de genes e, portanto, apresentar centenas de milhares de pares 
de bases nitrogenadas, o que inviabiliza seu carreamento adequado em uma 
eletroforese, mesmo em um gel de matriz de agarose. Além disso, o maior interesse 
nos estudos relacionados ao DNA se dá por fragmentos ou genes específicos 
que possam ser facilmente manipulados e, por conta disso, ferramentas mais 
precisas, como as endonucleases de restrição, têm sido utilizadas com o objetivo 
de fragmentar e manipular o DNA e seus fragmentos para a aplicação em estudos 
específicos.
2.2 ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO
Diversas bactérias produzem, naturalmente, endonucleases como 
mecanismo de proteção contra infecções virais, já que essas enzimas quebram o 
DNA viral, impedindo o vírus de agredir a bactéria. Foi a partir da observação 
e estudo desse mecanismo de defesa que as endonucleases foram descobertas 
e, desde então, essas enzimas passaram a ser isoladas e purificadas a partir de 
colônias de diferentes bactérias, sendo aplicadas como enzimas de restrição na 
manipulação do DNA. São diversas as endonucleases isoladas, pois cada bactéria 
apresenta uma específica.
UNIDADE 1 — O MATERIAL GENÉTICO E AS PRINCIPAIS TÉCNICAS DE ISOLAMENTO E SEQUENCIAMENTO
8
De maneira simplificada, a utilização de endonucleases de restrição 
permite a manipulação do DNA para que ele seja fragmentado em regiões 
específicas, viabilizando que um determinado fragmento seja isolado dos demais 
fragmentos do DNA. Essas enzimas clivam a molécula de DNA em regiões 
predeterminadas, compostas por uma sequência específica de 4 a 8 nucleotídeos, 
chamados de sequência de reconhecimento. Um exemplo desse caso é a enzima 
de restrição chamada EcoRI, a qual é amplamente utilizada e cuja sequência de 
reconhecimento é composta por apenas quatro nucleotídeos (5’-AATT-3’) (Figura 
5). Cada endonuclease de restrição apresenta uma região de clivagem conhecida 
e específica, permitindo o controle dos sítios de clivagem e a previsão do tamanho 
dos fragmentos que serão originados. 
FIGURA 5 – EXEMPLO DE RESTRIÇÃO REALIZADO COM A ENDOCNUCLEASE DE RESTRIÇÃO 
ECORI E A SEPARAÇÃO, POR ELETROFORESE EM GEL, DOS FRAGMENTOS OBTIDOS
FONTE: Watson et al. (2015, p. 150).
Após o tratamento das amostras de DNA com uma ou mais endonucleases 
de restrição, é possível submeter a amostra a uma separação por eletroforese em 
gel, como previamente descrito, promovendo a identificação mais precisa pela 
quantidade de bases nitrogenadas, e o isolamento do fragmento de interesse a ser 
avaliado (Figura 5).
sítios de EcoRI
tamanho menor
TÓPICO 1 — ISOLAMENTO E CLONAGEM
9
2.3 HIBRIDIZAÇÃO
Antes de discutirmos sobre o que é a hibridização e como ela é aplicada no 
isolamento de fragmentos de DNA, é preciso que mais alguns conceitos básicos 
relativos a essa tão importante molécula sejam relembrados.
Como já discutimos anteriormente, o DNA é composto por duas fitas que, 
quando ligadas, formam uma estrutura em dupla hélice. Cada uma dessas fitas 
é complementar a outra e é formada por uma sequência composta pelos quatro 
nucleotídeos (A, T, C e G). O que ainda não discutimos neste livro é que essas duas 
fitas, embora sejam complementares e ligadas, formando a dupla hélice, podem 
ter suas ligações entre os nucleotídeos, também chamados de pares de bases, 
rompidas quando em condições adequadas de salinidade, temperatura e pH, 
disponibilizando duas fitas simples. Esse processo é chamado de desnaturação. 
No entanto, as bases nitrogenadas, mesmo após a desnaturação, tendem a se ligar 
novamente com suas bases complementares, ou seja, A se liga com T, e C se liga 
com G, em um processo chamado de anelamento, o qual promove a renaturação 
do DNA, restaurando a dupla fita.
Essa possibilidade de desnaturação e reanelamento dos pares de bases 
de um fragmento de DNA permitiu que algumas manipulações, em prol do 
isolamento e identificação desses fragmentos, fossem desenvolvidas. Assim, foi 
elaborada a técnica de hibridização, a qual se resume à promoção do anelamento 
entre duas fitas simples de origem distintas, sejam elas fitas de DNA ou RNA, 
inclusive podendo ser a hibridização entre uma fita de RNA com uma de DNA.
Mas, você pode se perguntar: “como o processo de hibridização poderia 
promover o isolamento e identificação de algum fragmento específico?”. Pois 
bem, para essepropósito são utilizadas as chamadas sondas, que são fitas de 
DNA com uma sequência de nucleotídeos complementar ao gene ou fragmento 
de interesse, mas que carregam em sua estrutura um marcador que pode ser 
radioativo ou químico. Desta forma, em condições adequadas, a sonda é capaz de 
detectar a região da fita desnaturada do DNA da amostra, que é complementar 
à sua sequência e, então, anelar-se a ela, permitindo que por meio do marcador 
seja visualizada a presença do fragmento de interesse (Figura 6). As principais 
aplicações da técnica de hibridização são chamadas de hibridização in situ, 
Northern e Southern-blotting. 
UNIDADE 1 — O MATERIAL GENÉTICO E AS PRINCIPAIS TÉCNICAS DE ISOLAMENTO E SEQUENCIAMENTO
10
FIGURA 6 – ESQUEMA DO PROCESSO DE LIGAÇÃO DA SONDA DE HIBRIDIZAÇÃO COM UMA 
FITA SIMPLES DE DNA
FONTE: Adaptado de Alberts et al. (2008)
Na hibridização in situ, as sondas de ácidos nucleicos, quimicamente 
marcadas, são aplicadas, como o próprio nome diz, no local em que a molécula 
de interesse deve ser encontrada. Assim, é possível determinar a presença de uma 
determinada sequência de DNA ainda nos cromossomos ou verificar a existência 
de um RNA específico dentro de uma célula, sem que, para isso, a amostra seja 
homogeneizada e o material de interesse extraído, evitando, assim, a perda ou 
degradação das fitas de nucleotídeos durante esses processos (Figura 7). Nesse 
caso específico, a amostra é submetida a uma elevação de pH que permite a 
separação da fita dupla de DNA e, consequentemente, o pareamento da sonda de 
ácidos nucleicos que foi aplicada. A hibridização in situ pode, ainda, ser aplicada 
para determinar a localização de um RNA específico em um tecido, célula ou até 
mesmo em pequenos organismos, ou seja, os padrões de expressão diferencial 
do gene. Para esse objetivo, no entanto, o tecido de interesse deve ser fixado de 
uma forma específica, que envolve, por exemplo, o tratamento com proteinases 
e detergentes para a quebra de estruturas celulares que possam impedir a 
penetração das sondas de hibridização.
TÓPICO 1 — ISOLAMENTO E CLONAGEM
11
FIGURA 7 – HIBRIDIZAÇÃO IN SITU REALIZADA EM UM CROMOSSOMO
FONTE: Alberts et al. (2008, p. 537).
Para a aplicação da técnica de hibridização northern-blotting, assim como 
para a southern-blotting, um fracionamento prévio por meio de eletroforese em gel 
deve ser aplicado para a separação, em bandas, dos RNAs - no caso da northern; 
ou dos fragmentos de DNA, para a aplicação da southern. Na northern-blotting, 
a população de RNA mensageiros (mRNAs) extraída da amostra de interesse 
é submetida à eletroforese em gel e, na sequência, as bandas formadas são 
transferidas para uma membrana, normalmente de nitrocelulose, permitindo 
que o padrão de bandas formado no gel gere uma impressão na membrana e 
disponibilizando as moléculas de mRNA para a ligação com as sondas de 
hibridização. Esse processo de “impressão” é chamado de blotting. Assim, após 
o blotting na membrana, ela é incubada com a sonda de DNA marcada, formada 
pela sequência molde do gene de interesse a ser avaliado, promovendo, assim, 
a hibridização. Nesse processo, após incubação, se a sequência complementar à 
sonda aplicada estiver presente na amostra, ela será marcada e sua presença será 
identificada por meios químicos ou de autorradiografia (dependendo da marcação 
presente na sonda utilizada) (Figura 8). Além disso, é possível determinar o 
tamanho da sequência, uma vez que, durante o processo, podem ser aplicadas no 
gel e transferidas para a membrana amostras que contenham RNAs de tamanhos 
conhecidos, os chamados padrões de RNA. Essa técnica normalmente é aplicada 
quando se busca comparar situações distintas, por exemplo, utilizando amostras 
controle que sirvam como padrão para a expressão do gene de interesse. Assim, 
após o processo de hibridização, pode ser avaliado, por exemplo, se o gene de 
interesse se encontra expresso em ambas as amostras, bem como se a quantidade 
e o tamanho das moléculas de mRNA são diferentes entre elas, elucidando, por 
vezes, a participação de tal gene em uma determinada condição patológica.
UNIDADE 1 — O MATERIAL GENÉTICO E AS PRINCIPAIS TÉCNICAS DE ISOLAMENTO E SEQUENCIAMENTO
12
FIGURA 8 – REPRESENTAÇÃO DA IDENTIFICAÇÃO DE UM FRAGMENTO DE DNA ALVO POR 
MEIO DE HIBRIDIZAÇÃO EM MEMBRANA (BLOTTING)
Fonte: Watson et al. (2015, p. 152). 
Similarmente ao northern-blotting, o southern-blotting utiliza sondas de 
DNA molde, as quais são marcadas quimicamente ou com radiação. No entanto, 
nessa técnica são avaliados os padrões das sequências de nucleotídeos de genes 
no DNA, ou seja, ela identifica o tamanho do fragmento de um gene, e não o seu 
padrão de expressão, como no northern-blotting. Como dito anteriormente, o DNA 
é uma fita dupla, polinucleotídica e bastante extensa, que contém a informação 
dos genes. Assim, para que seja possível a sua movimentação em gel por meio 
da eletroforese, ela deve ser clivada em fragmentos menores, portanto, as 
endonucleases de restrição são as ferramentas mais adequadas a serem utilizadas. 
Após a clivagem, o DNA é submetido à eletroforese em gel e, assim, os fragmentos 
obtidos serão fracionados de acordo com seu tamanho. Antes do processo de 
transferência para a membrana ou blotting, os fragmentos de DNA presentes no 
gel devem ser submetidos ao processo de desnaturação, o qual se dá normalmente 
pela imersão do gel em solução alcalina. Dessa forma, os fragmentos de DNA 
estarão prontos para a transferência para a membrana de nitrocelulose, onde serão 
incubados com as sondas de hibridização e posteriormente identificados quanto 
à sua presença e tamanho, como previamente descrito para o northern-blotting. 
Com a aplicação da técnica southern-blotting, é possível caracterizar a estrutura de 
um gene por meio da comparação dos fragmentos obtidos e marcados na amostra 
de interesse com mapas de restrição previamente determinados para o mesmo 
gene, ou seja, é possível identificar a ocorrência de alguns tipos de alterações na 
sequência do gene dos organismos que estão sendo testados, como, por exemplo, 
a inserção ou deleção de pequenas sequências de nucleotídeos, as quais podem 
estar associadas a condições deletérias ou doenças.
gel membrana de
transferência 
(blot)
TÓPICO 1 — ISOLAMENTO E CLONAGEM
13
3 CLONAGEM DE DNA
Como já observamos, as técnicas de biologia molecular permitem a 
manipulação e a investigação das moléculas de DNA, dos genes, da expressão 
desses genes, entre outras tantas aplicações. No entanto, o isolamento de 
fragmentos de DNA de interesse presentes em uma amostra fornece apenas 
pequenas quantidades – muitas vezes ínfimas, quando se trata de amostras 
raras – de material para as manipulações subsequentes. Nesse sentido, o 
desenvolvimento de técnicas de clonagem permitiu que, rapidamente, fossem 
obtidas cópias idênticas do fragmento de interesse, fornecendo a quantidade de 
material adequado para a aplicação em outras análises.
Conceitualmente, a clonagem de DNA se refere à produção, dentro de 
uma célula, de diversas cópias de uma sequência específica de um fragmento de 
DNA. A clonagem de DNA depende da utilização de um vetor, do fragmento 
de DNA e, posteriormente, de um organismo hospedeiro. Para iniciar o 
processo de clonagem, o fragmento de DNA de interesse deve ser inserido em 
uma molécula de DNA genômico com capacidade de autorreplicação, ou seja, 
o DNA do vetor. A nova molécula de DNA, formada pela junção do fragmento 
de interesse com o DNA do vetor, é chamada de DNA recombinante. Para a 
formação do DNA recombinante, é necessária a atuação de enzimas de restrição 
e de enzimas de ligação.
A partir da clivagem de uma molécula de DNA por uma enzima de 
restrição, cuja sequência de clivagem é conhecida, formam-se os fragmentos de 
DNA que podem ser selecionados e ligados ao DNA do vetor, em que, pela ação 
da enzima DNA ligase, ficarão inseridos e formarão o DNA recombinante.
Os vetores mais comumente utilizadossão os vetores plasmidiais, 
pequenas moléculas de DNA circular capazes de se autorreplicar que contêm 
sítios conhecidos de ligação a determinadas enzimas de restrição, o que permite 
manipulações específicas na fita de DNA. Esses pequenos DNA circulares, 
atualmente utilizados como vetores, foram desenvolvidos a partir de moléculas 
maiores de DNA circular, que podem estar naturalmente presentes em bactérias, 
inclusive conferindo a elas a resistência a antibióticos, além de apresentarem 
capacidade de replicação de forma independente da replicação da bactéria, 
estando muitas vezes presentes em várias cópias dentro de uma única bactéria. 
Outro tipo de vetor, por vezes também utilizado para a clonagem de DNA, são 
os fagos ou vírus bacterianos que, devido à sua capacidade de infectar bactérias, 
inserindo seu material genético nelas, foram manipulados, modificados e 
adaptados para a aplicação na biologia molecular.
Para a inserção do fragmento de interesse do DNA clivado por uma 
enzima de restrição em um vetor, o DNA circular do vetor deve ser clivado, com 
a mesma enzima de restrição, formando uma fita linear em que o fragmento de 
interesse possa se ligar às extremidades. Dessa forma, por meio da atividade 
da enzima DNA ligase, o DNA vetorial e o fragmento inserido são ligados 
UNIDADE 1 — O MATERIAL GENÉTICO E AS PRINCIPAIS TÉCNICAS DE ISOLAMENTO E SEQUENCIAMENTO
14
covalentemente, formando novamente uma molécula de DNA circular, mas, 
desta vez, recombinante. No entanto, como já falamos, a clonagem deve acontecer 
dentro de uma célula, ou seja, em um organismo hospedeiro.
O processo de inserção do vetor no organismo hospedeiro é chamado 
de transformação e ocorre naturalmente em diversas bactérias que apresentam 
competência genética, ou seja, que apresentam a capacidade de incorporar 
fragmentos ou moléculas de DNA presentes no meio externo, chamadas de 
bactérias competentes. No entanto, o organismo hospedeiro mais comumente 
utilizado no processo de clonagem é a bactéria Escherichia coli, a qual, diferentemente 
da maioria das outras bactérias, não apresenta essa capacidade, ou seja, não 
é uma bactéria naturalmente competente. Porém, mesmo não apresentando 
naturalmente a habilidade de internalização de material genético externo, a E. 
coli pode ser manipulada para que o vetor plasmidial seja internalizado por ela.
Após a transformação, devido à capacidade de autorreplicação do vetor, 
associada às elevadas taxas de replicação bacteriana, o fragmento de DNA inserido 
no vetor será rapidamente multiplicado durante o processo de crescimento 
bacteriano em meio de cultivo, produzindo, assim, os clones do fragmento de 
DNA (Figura 9).
FIGURA 9 – PROCEDIMENTO PARA CLONAGEM DE UM FRAGMENTO DE DNA
FONTE: Adaptado de Alberts et al. (2008)
TÓPICO 1 — ISOLAMENTO E CLONAGEM
15
Embora a taxa de clonagem e multiplicação celular seja elevada, o processo 
de transformação, no entanto, não apresenta elevada eficiência, portanto, apenas 
algumas das células bacterianas internalizarão o vetor plasmidial. Dessa forma, 
após a multiplicação celular inicial, é necessário que seja feito um processo de 
seleção das bactérias que contêm o vetor plasmidial. Para tanto, as bactérias são 
transferidas para um meio de cultivo na presença de antibiótico e, neste caso, 
aquelas que internalizaram o vetor apresentarão resistência ao antibiótico e 
permanecerão se multiplicando, enquanto aquelas que não internalizaram o 
vetor não se propagarão.
Outros detalhes da técnica de clonagem podem ser encontrados em https://
kasvi.com.br/clonagem-molecular-dna-recombinante/.
DICAS
Uma importante aplicação da clonagem de DNA é a formação das 
bibliotecas de DNA, as quais serão discutidas com mais detalhes ainda nesta 
unidade. Além das bibliotecas de DNA, a clonagem precede diversas análises 
de biologia molecular, pois, após a execução de todas as etapas descritas 
anteriormente, as moléculas de DNA recombinante podem ser extraídas. Esse 
processo fornece grande quantidade de material, do qual os clones do fragmento 
de DNA de interesse podem ser isolados e, na sequência, aplicados em outras 
análises, como, por exemplo, a caracterização do fragmento inserido por meio do 
sequenciamento dos nucleotídeos presentes nele. 
16
Neste tópico, você aprendeu que:
• A partir dos estudos sobre a molécula de DNA, sua estrutura em dupla hélice 
e dos mecanismos celulares envolvidos nos processos de replicação do DNA e 
expressão gênica, as técnicas avançadas de biologia molecular começaram a ser 
desenvolvidas.
• Para o estudo do DNA, devido à complexidade, diversas manipulações podem 
ser empregadas, como o isolamento, a clonagem e o sequenciamento. 
• O isolamento de fragmentos de DNA pode ser realizado por eletroforese em 
gel de agarose ou poliacrilamida. Ainda, podem ser usadas técnicas mais 
complexas, como a hibridização para a identificação de um fragmento ou gene 
específico.
• A clonagem de DNA envolve a utilização de enzimas de restrição, vetores e um 
organismo hospedeiro, como a bactéria Escherichia coli. Através dessa técnica, 
rapidamente, podem ser obtidas muitas cópias ou clones de um mesmo 
fragmento de DNA.
RESUMO DO TÓPICO 1
17
1 Quais são os princípios físicos que permitem que a eletroforese em gel seja 
aplicada no isolamento de fragmentos de DNA?
a) ( ) Cargas negativas dos fragmentos de DNA, corrente elétrica e 
polaridade do gel. 
b) ( ) Cargas positivas dos fragmentos de DNA, corrente elétrica e 
porosidade da matriz do gel.
c) ( ) Cargas negativas dos fragmentos de DNA, corrente elétrica e 
porosidade da matriz do gel.
d) ( ) Cargas negativas do gel, elevação de temperatura e corrente elétrica.
2 Com relação à clonagem, explique como é formado o DNA recombinante e 
descreva as principais etapas do processo de formação dos clones.
 
3 Descreva, brevemente, as principais diferenças das técnicas de hibridização 
in situ, southern e northern-blotting.
4 Quais as principais características que um vetor e uma célula hospedeira 
devem conter para que possam ser utilizadas no processo de clonagem?
AUTOATIVIDADE
18
19
TÓPICO 2 — 
UNIDADE 1
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
1 INTRODUÇÃO
Para entendermos com clareza como a técnica de reação em cadeia da 
polimerase – a chamada PCR – acontece, é preciso antes relembrar como a fita 
de DNA se replica in vivo, pois foi a partir desse entendimento que enzimas e 
moléculas foram manipuladas permitindo que um processo bastante similar de 
replicação fosse realizado dentro de um tubo de ensaio (in vitro).
O primeiro conceito a ser relembrado é que a replicação do DNA é 
semiconservativa, ou seja, cada nova cadeia dupla de DNA é formada por uma fita 
da cadeia original, a fita conservada, e uma fita nova, que foi sintetizada utilizando 
a fita conservada como molde (Figura 10). Esse processo é relativamente simples 
de entender, no entanto, existem diversas outras moléculas, além dos nucleotídeos, 
que são importantes e requisitados para que a replicação do DNA ocorra.
FIGURA 10 – DUPLICAÇÃO SEMICONSERVATIVA DA FITA DUPLA DE DNA
FONTE: Junqueira e Carneiro (2012, p. 182).
DNA
dupla hélice original
MoldeNovaNovaMolde
Moléculas-filhas
20
UNIDADE 1 — O MATERIAL GENÉTICO E AS PRINCIPAIS TÉCNICAS DE ISOLAMENTO E SEQUENCIAMENTO
A principal molécula envolvida no processo de replicação do DNA é 
uma enzima chamada DNA polimerase, que, como o próprio nome indica, é 
responsável pela polimerização da nova fita de DNA, sendo a enzima que alinha 
os novos nucleotídeos de acordo com a sequência obtida a partir da fita molde, 
formando, assim, uma nova fita de DNA. Aqui, vale ressaltar que o sentido de 
síntese da fita de DNA se dá sempre de 5’ para 3’, ou seja, o novo nucleotídeo 
sempre será inserido na terminação 3’ da fita que está sendo moldada por meio 
da ligação covalente promovida por moléculas de fosfato entre o carbono 3’ 
da desoxirribose que já está na fita e o carbono 5’ da desoxirribose do próximonucleotídeo a ser inserido na fita.
Outra informação importante é que a DNA polimerase necessita de uma 
extremidade 3’ disponível para a inserção do novo nucleotídeo, o que nos leva 
ao conceito de primer, ou iniciador. No processo de replicação realizado in vivo, 
existem enzimas que são capazes de formar pequenas sequências de nucleotídeos, 
conhecidas como sequências iniciadoras, utilizando a fita molde de DNA sem 
a necessidade de uma extremidade 3’ para isso. Essas enzimas, denominadas 
primases, são de extrema importância no processo de replicação, pois são 
responsáveis por fornecer um sítio de ação para a DNA polimerase iniciar o 
processo de replicação do restante da fita. Entendido esse conceito, as técnicas de 
biologia molecular lançaram mão de primers artificialmente sintetizados, também 
chamados de oligonucleotídeos sintéticos, que podem ser facilmente sintetizados 
e utilizados como iniciadores no processo de amplificação in vitro.
 
Além dos componentes citados (fita molde de DNA, desoxirribonucleotídeos, 
enzimas sintetizadoras de primers e DNA polimerase), o processo de replicação 
ainda depende de outras enzimas e cofatores, como, por exemplo, as enzimas 
que farão a abertura da cadeia dupla e o desenrolamento da dupla hélice, como a 
DNA helicase e a topoisomerase. 
Com o entendimento de que o processo de replicação do DNA acontecia 
naturalmente e o conhecimento da estrutura química da molécula de DNA, foi 
possível aplicar os mesmos conceitos utilizando, por exemplo, DNA polimerases 
isoladas de bactérias, primers sintetizados e manipulações de pH, salinidade e 
temperatura para promover a replicação do DNA em ciclos sucessivos, com 
uma ou poucas moléculas de DNA sendo utilizadas como molde, dando origem, 
assim, ao que hoje conhecemos como a técnica de PCR. 
PCR é uma sigla que vem do inglês Polymerase Chain Reaction, que significa 
reação em cadeia da polimerase. O termo se refere à técnica base para a rápida 
replicação, também chamada de amplificação, de um fragmento de DNA. Essa 
técnica permitiu que fragmentos específicos de uma molécula de DNA fossem 
amplificados com grande eficácia e rapidez dentro de um tubo de ensaio em 
poucas horas. Um processo similar apenas era possível com a utilização da 
técnica de clonagem, no entanto, embora a clonagem seja eficiente, ela requer no 
mínimo um vetor e um organismo hospedeiro para a replicação, além de alguns 
dias para que o crescimento do hospedeiro produza quantidade suficiente de 
material replicado.
TÓPICO 2 — REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
21
Com a utilização da PCR, em apenas alguns minutos é possível multiplicar 
de maneira expressiva a quantidade do fragmento de DNA que se deseja estudar, 
tornando a amostra repleta desse fragmento e possibilitando uma série de 
análises subsequentes, como, por exemplo, a quantificação da expressão de um 
gene em diferentes indivíduos ou tecidos, o sequenciamento dos nucleotídeos 
que compõem a molécula de interesse ou a comparação entre a expressão de um 
determinado gene em amostras provenientes de diferentes condições.
2 PCR PASSO A PASSO
Para que seja realizada uma PCR de um fragmento específico de DNA, 
por exemplo um gene, o primeiro passo é conhecer a sequência de nucleotídeos 
desse gene ou parte da sequência, pois, como dito anteriormente, para que o 
processo de replicação aconteça, é necessário que seja utilizado um primer ou 
oligonucleotídeo sintético. Esse primer deve ser uma sequência curta, com cerca 
de 18 a 22 nucleotídeos, que seja complementar ao gene de interesse. Para a 
aplicação em PCR, é utilizado um par de primers, cada um para uma das duas 
fitas de DNA, sempre em sentido 5’-3’. Obter um par de primers específico para 
o gene de interesse assegura que, nas etapas seguintes do processo, o material 
correto seja amplificado, promovendo uma purificação da amostra para a 
fragmento de interesse. 
Após a síntese dos primers e a extração do material genético da amostra 
de interesse, é iniciada a PCR em si. Nessa reação, são adicionados os primers, um 
coquetel contendo os quatro desoxinucleotídeos (dNTPs; A, T, G e C), a enzima 
DNA polimerase, cofatores enzimáticos (como o magnésio – Mg), e o material 
extraído, dando início ao processo de amplificação.
Devido à afinidade entre os nucleotídeos A e T, e C e G, os primers tendem 
a se ligar à sua sequência complementar no fragmento de DNA. No entanto, 
para que isso ocorra, é necessário que haja a abertura da dupla fita, liberando os 
nucleotídeos de cada uma das fitas simples que serão originadas a se ligarem aos 
seus primers correspondentes. Para que esse processo ocorra, o DNA é desnaturado 
sendo submetido, por um curto período, a uma alta temperatura, o que permite 
a separação das fitas e a ligação dos primers em suas sequências complementares 
em cada uma das fitas, processo chamado de anelamento de primers.
Após a ligação dos primers a cada uma das fitas simples de DNA, é formada 
uma pequena região de fita dupla composta pela fita molde do DNA desnaturado 
e do pequeno fragmento do primer. Assim, uma extremidade 3’ do primer fica 
disponível para que a DNA polimerase possa iniciar o processo de inserção dos 
dNTPs correspondentes à fita molde ou, como comumente chamado, o processo 
de extensão, formando uma nova fita dupla ao fim, composta pela fita molde e 
uma nova fita recém polimerizada e complementar ao molde.
22
UNIDADE 1 — O MATERIAL GENÉTICO E AS PRINCIPAIS TÉCNICAS DE ISOLAMENTO E SEQUENCIAMENTO
Esse simples processo de desnaturação, anelamento e extensão, em apenas 
alguns minutos, duplica a quantidade de DNA disponível na amostra, pois, de 
acordo com o princípio semiconservativo, cada uma das duas fitas formadoras 
da cadeia dupla do DNA, após o processo de replicação, dará origem a uma nova 
fita dupla, composta pela fita conservada e uma nova fita. Ou seja, a cada ciclo da 
PCR, a amplificação duplica o material disponibilizado pelo ciclo anterior, sendo 
normalmente necessário cerca de 20 a 40 ciclos de amplificação para a obtenção 
de uma grande quantidade de cópias provenientes de apenas um fragmento de 
DNA. Fazendo um simples cálculo, partindo de um único fragmento, ao final do 
primeiro ciclo de amplificação seriam obtidos dois fragmentos idênticos, após 
o segundo ciclo seriam obtidos quatro fragmentos, no terceiro ciclo estariam 
disponíveis oito fragmentos e assim sucessivamente (Figura 11).
FIGURA 11 – ESQUEMA DA RÁPIDA AMPLIFICAÇÃO DE UMA FRAGMENTO DE DNA DURANTE A PCR
FONTE: Watson et al. (2015, p. 159).
Desnaturação
por aquecimento
Anelamento dos
iniciadores
DNA-polimerase
faz o alongamento
Aquecimento e repetição
Aquecimento e repetição
Anelamento de
iniciadores e 
alongamento
TÓPICO 2 — REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
23
Um detalhe interessante é que, como falamos, o método de desnaturação 
do DNA se dá por meio da elevação da temperatura, chegando a cerca de 
95 ºC. Por vezes, esse processo pode inviabilizar a ação de enzimas como a 
DNA polimerase, sendo necessária a utilização de uma DNA polimerase que 
seja termoestável e termoresistente. Nesse sentido, os avanços na biologia e 
biotecnologia proporcionaram, já nos anos 80, a obtenção da DNA polimerase 
presente na bactéria Thermus aquaticus, um organismo que vive em temperaturas 
elevadas e com sua DNA polimerase adaptada para resistir a essas temperaturas. 
A DNA polimerase obtida desse organismo é a chamada Taq polimerase e é 
uma das DNA polimerases mais utilizadas nas reações de PCR.
Outra informação interessante é que, embora a PCR pareça um processo 
simples e rápido, em sua origem ela era executada por meio de mudanças de 
temperatura promovidas em banho-maria, sendo necessário que o pesquisador 
cronometrasse o tempo de elevação e retomada de temperatura em cada 
ciclo e mudasse os tubos de ensaio entre os banho-maria com as diferentes 
temperaturas necessárias, por volta de 95 ºC para desnaturação, 60-65 ºC para 
anelamento e 72 ºC para extensão. Porém, atualmente,todo esse processo foi 
automatizado e é realizado em um equipamento chamado termociclador, que, 
como o próprio nome indica, é um equipamento capaz de mudar rapidamente 
de temperatura, elevando ou diminuindo a temperatura em segundos, além 
de apresentar opções de programação para que os ciclos sejam repetidos pela 
quantidade de vezes necessária.
Então, resumidamente, o conceito básico da técnica de PCR é baseado 
na desnaturação do fragmento de DNA, seguido do anelamento dos primers nas 
fitas desnaturadas e da extensão da nova fita pela DNA polimerase, sendo todo o 
processo realizado em ciclos repetidos (uma reação em cadeia) que proporcionam 
a amplificação da quantidade de fragmentos iguais ao fragmento de interesse 
para o estudo (Figura 11). 
Diante disso, você pode se perguntar: “como essa quantidade de material 
genético amplificado pode ser analisada?”, “em quais aplicações a técnica de PCR 
pode ser aplicada?”, “que tipo de informações a amplificação de um fragmento 
de DNA pode fornecer?”, entre outras tantas questões que tentaremos discutir ao 
longo deste tópico.
3 TRANSCRIÇÃO REVERSA
Uma das técnicas de biologia molecular bastante utilizada na pesquisa de 
expressão diferencial de genes é uma adaptação da PCR chamada de RT-PCR, 
que, na verdade, é simplesmente uma reação de transcrição reversa seguida de 
uma PCR. 
24
UNIDADE 1 — O MATERIAL GENÉTICO E AS PRINCIPAIS TÉCNICAS DE ISOLAMENTO E SEQUENCIAMENTO
Ainda não falamos sobre a transcrição reversa, mas não vai ser tão difícil 
entender como ela funciona se lembrarmos que, para que um gene seja expresso, 
ele deve ser transcrito em mRNA, o qual, por sua vez, carregará a informação 
contida no gene para que seja traduzida no citoplasma, proporcionado a síntese 
proteica. Esta é a chave da questão: se desejamos avaliar a expressão diferencial 
de um gene, por exemplo, em diferentes tecidos de um mesmo organismo, é 
preciso que se avalie o mRNA contido nesse tecido (pois é ele que será traduzido 
em proteínas) – e não o DNA genômico, já que o DNA genômico carrega a 
informação de todos os genes de um organismo e em todas as suas células, não 
sendo representativo da expressão de algum gene específico.
Para a avaliação da expressão diferencial, é preciso avaliar o mRNA. Pode-
se pensar que basta proceder com a extração do mRNA de interesse e prosseguir 
com sua amplificação na PCR, mas precisamos entender e relembrar que a DNA 
polimerase utilizada na PCR não consegue atuar em uma molécula de fita simples, 
como a de um RNA, para executar a extensão. Sendo assim, para que ocorra a 
síntese de uma fita dupla que possa servir de molde para a DNA polimerase, 
deve ser executada a reação de transcrição reversa. Portanto, a transcrição reversa 
é um passo essencial quando se objetiva amplificar na PCR um fragmento de 
polinucleotídeos oriundo de uma fita simples de RNA.
A transcrição reversa é uma reação que ocorre pela ação da enzima 
transcriptase reversa ou RT. Essa enzima é uma DNA polimerase dependente de 
RNA, ou seja, ela é capaz de sintetizar uma fita de DNA utilizando como molde a 
fita simples de RNA. Sua descoberta se deu a partir da observação de que, quando 
os retrovírus, cujo material genético é um RNA, infectam um hospedeiro, o RNA 
viral é convertido em DNA. 
A reação de transcrição reversa é bastante similar àquela descrita na PCR, 
sendo necessário, para tanto, a adição de oligonucleotídeos sintéticos, da enzima 
transcriptase reversa, do coquetel contendo os quatro dNTPs, da amostra de 
RNA e de cofatores enzimáticos. 
Para a reação de RT (Figura 12), todo o conteúdo de RNA deve ser 
extraído da amostra de interesse. Para que o gene de interesse seja estudado, todo 
o conteúdo de RNAs deve ser retrotranscrito em DNA, formando o chamado 
DNA complementar ou cDNA. Ou seja, toda a população de RNAs expressa 
naquela amostra, naquele momento, será convertida em cDNA. Para tanto, os 
oligonucleotídeos adicionados, ou primers, devem apresentar a capacidade de se 
anelar à maior parte das moléculas de RNA disponíveis na amostra, permitindo, 
assim, que a transcriptase reversa forme a dupla fita baseada no molde desses 
RNAs. Um exemplo desses oligonucleotídeos são os chamados oligodT, que são 
fitas polinucleotídicas curtas, formadas pelo nucleotídeo T, capazes de se anelar à 
cauda poli A presente na maioria dos mRNAs. A transcrição reversa, assim como a 
PCR, depende da submissão das amostras à temperatura ideal para o anelamento 
dos primers e extensão das fitas. No entanto, ela não é realizada em ciclos, pois 
é necessário que apenas uma fita de cDNA correspondente a cada mRNA seja 
TÓPICO 2 — REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
25
polimerizada. Assim, a partir do momento em que o RNA está convertido em 
cDNA, ele já pode ser utilizado na PCR e, nessa etapa, com a utilização dos primers 
específicos para o gene de interesse, apenas o cDNA formado a partir do mRNA 
desse gene será amplificado.
FIGURA 12 – TRANSCRIÇÃO REVERSA
FONTE: Adaptado de Alberts et al. (2008).
4 PCR QUALITATIVO VS. PCR QUANTITATIVO
Agora que você já sabe que a técnica de PCR produz uma série de cópias 
de um determinado fragmento de DNA ou cDNA de uma maneira bastante 
rápida e eficiente, vamos discutir um pouco sobre como essa reação pode fornecer 
dados que serão avaliados em uma pesquisa. Nesse sentido, a primeira pergunta 
a se fazer é: qual o objetivo da pesquisa. Por exemplo, se você estiver estudando 
a expressão de um gene, é importante saber se ele apenas está sendo expresso em 
determinado tecido ou tipo celular, ou se é necessário que se obtenha a informação 
do quanto esse gene está expresso diferente nessas amostras? Respondendo a 
essa pergunta, é possível definir se a PCR que melhor se aplica ao seu objetivo é 
qualitativa ou quantitativa.
Uma PCR qualitativa é aquela que vai indicar a presença de um fragmento 
específico de DNA ou cDNA em uma amostra, sem fornecer dados numéricos 
relativos ao quanto o gene estava expresso. Essa técnica é bastante simples e 
basicamente se resume à execução dos ciclos de desnaturação, anelamento e 
extensão, já descritos em maiores detalhes, e, posteriormente, a visualização 
do produto resultante da amplificação. Para a visualização das cópias obtidas, 
mRNA
Anelamento com
primers (p.ex.: OliodT)
Transcriptase reversa sintetiza 
a fita de DNA complementarmRNA
cDNA
3'
3'
3'
3'
3'
5'
5'
5'
5'
5'
26
UNIDADE 1 — O MATERIAL GENÉTICO E AS PRINCIPAIS TÉCNICAS DE ISOLAMENTO E SEQUENCIAMENTO
é necessário submeter as amostras a uma eletroforese em gel e corá-las para a 
visualização, por exemplo, utilizando o brometo de etídio. Dessa forma, é possível 
observar se as amostras em estudo apresentam o gene que se buscou amplificar. 
Ainda, de maneira indireta, é possível, de certa forma, comparar a expressão 
de um gene em diferentes condições ou amostras por meio da visualização das 
bandas no gel. Existem programas computacionais capazes de mensurar a área que 
cada uma das amostras ocupa no gel e, assim, compará-las, indicando possíveis 
aumentos ou diminuições na expressão do gene. No entanto, para uma avaliação 
mais confiável da diferença nos níveis de expressão de um gene, utilizamos uma 
técnica mais eficiente e tão simples quanto a PCR qualitativa, a PCR quantitativa, 
também conhecida como PCR em tempo real, cuja sigla correta é qPCR.
A qPCR é similar à PCR qualitativa. No entanto, ela fornece informações 
precisas relativas à quantidade de expressão da um gene, permitindo 
comparações entre amostras provenientes de diferentes condições, como, por 
exemplo, associadas a doenças, podendo até mesmo fornecer informações quanto 
ao número exato de cópias de um determinado fragmento de DNA ou cDNA 
que foram replicadas. No entanto, embora a reação da PCR seja igual àquela 
previamente descrita, o equipamento necessário para a qPCR é um termociclador 
associado a um detector capaz de quantificar a amplificação dos fragmentos de 
DNA ao final de cada ciclo, ou seja,em tempo real, justificando, assim, o motivo 
dessa técnica ser conhecida como PCR em tempo real.
Para que o equipamento detecte o produto da amplificação, são 
adicionados corantes fluorescentes ou sondas específicas, capazes de emitir 
fluorescência quando se encontram ligados ou intercalados à fita de DNA no 
meio de reação da PCR. Dessa forma, a cada nova fita formada, a fluorescência 
emitida pela amostra é detectada, sendo proporcional à quantidade de material 
disponível para iniciar a amplificação. Assim, após a detecção ao longo de 
sucessivos ciclos, é possível visualizar, por meio das curvas de amplificação, e 
numericamente comparar a expressão do gene de interesse, por meio dos Cts 
(do inglês cycle threshold). Após a estabilização da reação, o equipamento é capaz 
de determinar em que momento a fluorescência detectada é apenas proveniente 
das amostras que estão sendo amplificadas (ignorando o ruído, chamado de 
background) e, assim, determinar a linha de corte ou threshold. Assim, quando 
(em qual ciclo de amplificação) a fluorescência emitida por uma amostra alcança 
a fluorescência determinada pela linha de corte, demonstrando o momento em 
que a fluorescência apresentada está livre de ruídos, sendo essencialmente 
a representação da amplificação da amostra teste, é determinado o Ct desta 
amostra. Dessa forma, observando as curvas de amplificação, é possível 
determinar em qual ciclo de amplificação cada uma das amostras atingiu o 
threshold. De maneira simplificada, quanto menor o Ct de uma amostra, maior 
a quantidade de material estava disponível para iniciar a amplificação do 
fragmento de interesse (Figura 13).
TÓPICO 2 — REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
27
Você sabia que um dos primeiros testes diagnósticos para a detecção do 
coronavírus (COVID-19) é uma PCR, mais especificamente uma RT-qPCR? Saiba mais 
consultando https://www.youtube.com/watch?v=8ki-tVdVO1E&t=16s e https://www.uol.
com.br/vivabem/noticias/redacao/2020/03/17/saiba-como-funciona-o-pcr-o-exame-que-
detecta-o-novo-coronavirus.htm.
DICAS
FIGURA 13 – CURVA DE AMPLIFICAÇÃO DA PCR QUANTITATIVA (QPCR) - CT = CYCLE 
THRESHOLD
FONTE: A autora.
Mais detalhes sobre as técnicas da PCR e qPCR podem ser facilmente 
encontrados em artigos científicos, como: Bustin et al., 2009; Moreira, 2015; Pabinger et 
al., 2014; e Pfaffl, 2004.
DICAS
28
RESUMO DO TÓPICO 2
Neste tópico, você aprendeu que:
• O princípio que norteou o desenvolvimento da técnica da PCR foi a observação 
de como o processo de replicação ocorre in vivo, sendo considerado o princípio 
da replicação semiconservativa do DNA, e a ação de diversas enzimas, como a 
DNA polimerase.
• Para que ocorra a PCR, é necessário que a fita dupla de DNA seja desnaturada, 
que os primers se anelem às fitas simples e que a DNA polimerase faça a 
extensão da nova fita por meio da inclusão dos dNTPs complementares à fita 
molde.
• A transcrição reversa é uma reação de formação de uma fita dupla de DNA 
a partir do molde uma fita simples de RNA. o DNA formado é chamado de 
DNA complementar ou cDNA e a DNA polimerase responsável pela reação é 
a Transcriptase reversa.
• Existem diferentes tipos de PCR, a qualitativa ou convencional e a quantitativa 
ou qPCR. Na qualitativa, o material amplificado pode ser observado apenas 
ao final da reação por meio de eletroforese em gel, enquanto na quantitativa, 
a amplificação é detectada em tempo real por meio de fluorescência e fornece 
dados numéricos relativos à quantidade de material que está sendo amplificado 
na reação.
29
1 Explique como ocorre cada uma das etapas da PCR e sua função para a 
reação como um todo.
2 Quais componentes são indispensáveis para a PCR?
a) ( ) Fita molde de DNA, oligodT, Transcriptase reversa e dNTPs.
b) ( ) Fita molde de RNA, oligodT, Transcriptase reversa e dNTPs.
c) ( ) Fita molde de RNA, primers, DNA polimerase e dNTPs.
d) ( ) Fita molde de DNA, primers, DNA polimerase e dNTPs.
3 Por que a reação de transcrição reversa é importante para estudos de 
expressão de um gene?
4 Explique como acontece a qPCR e qual sua principal diferença em relação à 
PCR qualitativa.
AUTOATIVIDADE
30
31
TÓPICO 3 — 
UNIDADE 1
BIBLIOTECAS DE DNA E CDNA
1 INTRODUÇÃO
Como você deve se lembrar, discutimos no Tópico 1 sobre o isolamento 
de DNA. É relativamente simples isolar um determinado fragmento de DNA que 
contenha o gene de interesse, simplesmente utilizando algumas das ferramentas 
e técnicas já abordadas, como a clivagem do DNA genômico com enzimas de 
restrição e posteriormente isolando e purificando o fragmento de interesse dos 
demais fragmentos por meio de uma eletroforese em gel. Realmente, esse processo 
é simples quando se trata do isolamento de um gene pertencente a um organismo 
com o DNA genômico pequeno, composto por alguns milhares de nucleotídeos, 
pois, nesse caso, a aplicação de enzimas de restrição produziria poucos fragmentos 
facilmente separáveis. No entanto, quando se trata de organismos com o genoma 
mais complexo, compostos por centenas de milhares de nucleotídeos, com 
sequências codificantes para uma infinidade de diferentes genes, a fragmentação 
desses DNAs genômicos com enzimas de restrição produz uma quantidade tão 
grande de fragmentos que, mesmo em um gel bastante extenso, torna-se inviável 
o isolamento e a purificação de apenas um gene específico.
Você já deve estar ciente de que, atualmente, diversos organismos, 
incluindo os seres humanos, têm seus genes estudados por diversos grupos 
de pesquisa, o que inclusive tem trazido avanços significativos, por exemplo, 
para as áreas da biologia e da medicina, elucidando mecanismos e causas de 
diversas síndromes e doenças. Nesse sentido, fica fácil imaginar que o problema 
da fragmentação e isolamento de genes provenientes de um DNA genômico 
complexo foi resolvido. 
Isso foi possível com o advento das chamadas bibliotecas de DNA, pois, 
com essa técnica, houve a simplificação do processo de isolamento e purificação de 
um gene presente em uma população de fragmentos de DNA. O termo biblioteca 
se aplica perfeitamente ao processo, pois, com essa técnica, é produzida uma 
coleção de fragmentos facilmente identificáveis, nos quais pode-se fazer uma 
busca por um gene específico e prosseguir com a amplificação e outros estudos 
com uma amostra purificada para tal gene. Assim, pode-se dizer que a construção 
de uma biblioteca de DNA pode ser o primeiro passo para o isolamento de um 
gene específico.
32
UNIDADE 1 — O MATERIAL GENÉTICO E AS PRINCIPAIS TÉCNICAS DE ISOLAMENTO E SEQUENCIAMENTO
2 BIBLIOTECA DE DNA OU GENÔMICA
Para a construção de uma biblioteca de DNA, são aplicadas as técnicas 
de clivagem com enzimas de restrição e clonagem em vetor, as quais já foram 
discutidas no Tópico 1, no entanto, com uma abordagem um pouco diferenciada, 
como iremos descobrir.
O primeiro passo para formar uma biblioteca de DNA é extrair e isolar 
o DNA genômico de uma célula, tecido ou até mesmo de um organismo. Em 
seguida, o DNA extraído é clivado com uma enzima de restrição, formando 
centenas a milhares de fragmentos de DNA, os quais, por sua vez, são inseridos 
em vetores idênticos, que foram clivados com a mesma enzima, permitindo, 
assim, que as extremidades complementares dos fragmentos de DNA e dos 
vetores sejam unidas por meio da ação da enzima DNA ligase.
Nessa etapa do processo, espera-se que cada fragmento formado pela 
clivagem se ligue a um vetor, formando uma grande população de vetores, 
cada um contendo um diferente fragmento originado do DNA genômico 
isolado. Após a ligação com o vetor, a biblioteca em si é formada por meio 
da transformação, ou seja, da inserção desses vetores em células hospedeiras, 
como em células da bactéria E. coli, procedendo com a clonagem dos diferentes 
fragmentos (Figura 14).
TÓPICO 3 — BIBLIOTECAS DE DNA E CDNA
33
FIGURA 14 – ESQUEMA DA FORMAÇÃO DE UMA BIBLIOTECA DE DNA
FONTE: Adaptado de Alberts et al. (2008)
Sabe-se que, em geral,cada bactéria internaliza apenas um vetor. Assim, 
após a diluição das bactérias e sua aplicação em placas de cultivo, cada colônia 
formada terá apenas células contendo um dos fragmentos de DNA. Desse modo, 
por meio do rápido processo de multiplicação celular da E. coli, em poucas 
horas serão formados diversos clones dos fragmentos inseridos, sendo cada um 
encontrado em uma diferente colônia de crescimento.
34
UNIDADE 1 — O MATERIAL GENÉTICO E AS PRINCIPAIS TÉCNICAS DE ISOLAMENTO E SEQUENCIAMENTO
FIGURA 15 – HIBRIDIZAÇÃO EM COLÔNIA
Com a formação das diversas colônias bacterianas, cada uma contendo 
um dos diferentes fragmentos de DNA, a biblioteca estará formada e nela poderão 
ser buscados fragmentos específicos de DNA, utilizando, por exemplo, a técnica 
de hibridização.
A identificação de uma colônia de bactérias que contenha um fragmento 
específico de DNA por meio da hibridização, aqui chamada de hibridização em 
colônia, é bastante semelhante às técnicas previamente descritas do Southern e 
Northern-blot. Basicamente, após o crescimento das colônias bacterianas em placas 
de cultivo contendo meio sólido, uma membrana é utilizada para coletar uma 
pequena porção das células presentes em cada uma das colônias. Nessa etapa, a 
membrana é colocada em contato com as colônias na placa, sendo que algumas das 
células presentes em cada uma dessas colônias se aderem à membrana, formando 
uma espécie de impressão das colônias presentes na placa. Essas células aderidas 
à membrana sofrem um processo de lise celular para que o DNA seja liberado, 
porém permaneça ainda aderido à membrana em posição relativa àquela da sua 
colônia de origem na placa. Após a exposição do DNA, a membrana é incubada 
com sondas de hibridização marcadas, complementares à uma porção do gene de 
interesse, as quais permitirão a visualização da posição dos clones que contenham 
o fragmento de interesse na membrana e, consequentemente, a posição da colônia 
que contenha esse gene na biblioteca de DNA (Figura 15).
FONTE: Adaptado de Watson et al. (2015).
TÓPICO 3 — BIBLIOTECAS DE DNA E CDNA
35
Com o uso da biblioteca de DNA, fragmentos de um mesmo DNA 
genômico podem ser mantidos por tempo indefinido, clonados, identificados e 
isolados para diversas aplicações, como, por exemplo, o sequenciamento de todo 
o genoma. No entanto, quando o objetivo do estudo é a avaliação das sequências 
codificantes de um DNA, ou seja, dos genes, uma biblioteca de DNA pode 
apenas ser adequada para estudos em organismos cujo DNA apresente pequenas 
porções de DNA não codificante, pois, caso contrário, muitos dos fragmentos 
contidos na biblioteca não conterão sequências codificantes. Isso acontece, pois, 
com a clivagem do DNA genômico, são formados fragmentos de forma aleatória 
e, portanto, muitos deles apenas serão formados por sequências não codificantes, 
dificultando a identificação do gene de interesse. Assim, para que se obtenha uma 
biblioteca rica em fragmentos codificantes, ela deverá ser formada por cDNAs.
3 BIBLIOTECA DE CDNA
A principal vantagem da utilização de bibliotecas de cDNA é justamente 
o fato de ela ser uma grande coleção de clones formados por genes, ou seja, todas 
as colônias de bactérias apresentam vetores com fragmentos codificantes.
FIGURA 16 – PRINCIPAIS DIFERENÇAS ENTRE UMA BIBLIOTECA DE DNA E UMA BIBLIOTECA 
DE CDNA
FONTE: Adaptado de Alberts et al. (2008).
36
UNIDADE 1 — O MATERIAL GENÉTICO E AS PRINCIPAIS TÉCNICAS DE ISOLAMENTO E SEQUENCIAMENTO
A montagem de uma biblioteca de cDNA é bastante semelhante à 
montagem da biblioteca de DNA. No entanto, em vez de iniciar o processo com o 
DNA genômico, neste caso, o material a ser clonado é o mRNA. Assim, o primeiro 
passo para a formação da biblioteca de cDNA é a extração dos mRNAs, sendo 
expressos em determinado tipo celular, tecido ou organismo. Posteriormente, 
essa população de mRNAs deve ser retrotranscrita em cDNA, como já vimos no 
item 3 do Tópico 2. Após a formação do cDNA, a amostra está pronta para seguir 
com o processo de inserção no vetor com a posterior transformação em bactéria 
E. coli, formando os clones de cDNA. Novamente, assim como nas bibliotecas de 
DNA, cada bactéria formará uma colônia de clones de um determinado cDNA, 
os quais podem ser também identificados e isolados.
 
Uma grande diferença da biblioteca de cDNA em relação à de DNA é 
que a biblioteca de DNA é formada por fragmentos aleatórios do DNA de um 
organismo, tecido ou célula, sendo que, via de regra, independentemente da célula 
ou tecido de um organismo, o DNA a ser fragmentado será idêntico. Por outro 
lado, como a biblioteca de cDNA é formada por mRNAs, cada tecido ou célula 
pode formar uma biblioteca diferente, pois cada um pode expressar diferentes 
genes de acordo com sua função. Assim, bibliotecas de cDNA originadas de 
células especializadas na produção de uma determinada proteína possivelmente 
apresentarão muitas colônias formadas pelo gene que codifica para ela. Por 
exemplo, uma biblioteca de cDNA produzida a partir de eritrócitos humanos 
será composta por muitas colônias de E. coli contendo vetores com o gene da 
hemoglobina. Essa abundância de determinado gene em uma biblioteca de 
cDNA, inclusive, torna-se uma vantagem no processo de identificação da colônia 
que contenha o cDNA que codifica para o gene de interesse.
 
Outra característica importante das bibliotecas de cDNA é que, como já 
mencionado, os clones formados por ela apenas contêm regiões codificantes do 
DNA, ou seja, apenas são formados pelas sequências nucleotídicas dos éxons 
dos genes que estão sendo expressos (Figura 16). Essa característica é bastante 
explorada e utilizada para estudos que buscam a dedução das sequências de 
aminoácidos das proteínas codificadas por esses genes. Além disso, os clones 
formados em uma biblioteca de cDNA podem fornecer material para a síntese de 
grandes quantidades de uma determinada proteína por meio da manipulação de 
bactérias ou leveduras com a capacidade de expressar o gene de interesse.
37
RESUMO DO TÓPICO 3
Neste tópico, você aprendeu que:
• Bibliotecas de DNA ou cDNA são grandes coleções de material genético 
mantidas em colônias de bactérias, nas quais um fragmento específico de DNA 
ou um gene podem ser procurados.
• Uma biblioteca de DNA é formada por fragmentos originados a partir de um 
DNA genômico.
• Uma biblioteca de cDNA é formada por sequências codificantes dos genes que 
estavam expressos na forma de mRNA em uma determinada amostra.
• A formação das bibliotecas de DNA e cDNA permite que fragmentos clonados 
sejam mantidos e replicados por tempo indeterminado.
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1 Explique como o termo biblioteca se adéqua às técnicas de biblioteca de 
DNA e de cDNA.
2 Qual a principal diferença entre as bibliotecas de DNA e de cDNA?
3 Assim como no processo de clonagem descrito no Tópico 1, quais 
componentes são essenciais para a formação das bibliotecas de DNA?
a) ( ) DNA, enzimas de restrição, DNA ligase, vetores e células hospedeiras.
b) ( ) mRNA, enzimas de restrição, transcriptase reversa, termocicladores e 
células hospedeiras.
c) ( ) DNA, enzimas de restrição, DNA polimerase, vetores e primers.
d) ( ) mRNA, enzimas de restrição, DNA polimerase, vetores e células 
hospedeiras.
4 Como as técnicas de clonagem e de bibliotecas de DNA ou cDNA podem 
ser diferenciadas? Você consegue imaginar alguma diferença entre elas e 
entre suas aplicações?
AUTOATIVIDADE
39
TÓPICO 4 — 
UNIDADE 1
SEQUENCIAMENTO DE DNA
1 INTRODUÇÃO
A definição de sequenciamento de DNA está bastante explicita no próprio 
nome, ou seja, esse é o processo em que é determinado qual nucleotídeo ocupa 
cada posição na fita de uma molécula ou de um fragmento de DNA. De maneira 
mais simples, é o método que determina a sequência dos nucleotídeos presentes 
em uma fita de DNA.
As primeiras técnicas de sequenciamento de DNA começaram a ser 
aplicadas ainda na década de 70, com o advento da técnica proposta por Sanger,