Relatório Processamento Histológico

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA - FAVET
	
PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO VOLTADO
PARA A MICROSCOPIA ÓPTICA
Docente: Janaína Serra Azul Monteiro Evangelista
Discentes: Adnilson Lima Maia
Alessandra Oliveira Rego
Ana Ligia Parente do Vale
Lívia Batista Silva
Luana Cortez Passos
Maria Eduarda do Carmo Moura
Fortaleza/CE
2021
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO.................................................................................................. 2
	1.
	EUTANÁSIA............................................................................................
	4
	2.
	COLETA DE MATERIAL 
(RETIRADAO DOS ÓRGÃOS/TECIDOS)...............................................
	
8
	3.
	FIXAÇÃO.................................................................................................
	11
	4.
	CLIVAGEM..............................................................................................
	12
	5.
	DESIDRATAÇÃO....................................................................................
	12
	6.
	CLARIFICAÇÃO OU DIAFANIZAÇÃO...................................................
	13
	7.
	INCLUSÃO..............................................................................................
	14
	8.
	MICROTOMIA.........................................................................................
	15
	9.
	BANHO-MARIA.......................................................................................
	17
	10.
	COLORAÇÃO..........................................................................................
	18
	
	10.1 DESPARAFINIZAÇÃO....................................................................
	18
	
	10.2 HIDRATAÇÃO.................................................................................
	19
	
	10.3 COLORAÇÃO..................................................................................
	19
	
	10.4 DESIDRATAÇÃO............................................................................
	21
	
	10.5 CLARIFICAÇÃO..............................................................................
	21
	11.
	MONTAGEM DA LÂMINA.......................................................................
	21
	12.
	CONCLUSÃO..........................................................................................
	22
REFERÊNCIA.................................................................................................... 23
INTRODUÇÃO 
Histologia (do grego histos= tecido ou teia e lógos = tratado, estudo, teoria) é o estudo da formação, estrutura e função dos tecidos biológicos, bem como de sua organização na formação dos diferentes órgãos.
O termo “tecido” foi empregado pela primeira vez ainda no século XVIII pelo fisiologista e anatomista francês Marie François Xavier Bichat que, ao estudar cadáveres humanos, percebeu que determinadas estruturas (macroscópicas) apresentavam diferentes texturas entre si mas mantinham estreita semelhança com a trama dos fios de tecidos (panos), tendo catalogado, ao todo, 21 (vinte e um) tipos de tecidos biológicos. Posteriormente o termo foi largamente empregado pelo anatomista e fisiologista alemão August Franz Josef Karl Mayer, desta feita fazendo referência às estruturas microscópicas atualmente estudadas pela histologia.
Porém, foi com o médico e antropologista alemão Rudolf Ludwig Karl Virchow que a histologia passou a desempenhar papel de maior relevo nas ciências médicas e biológicas, particularmente na realização de diagnósticos. Foi Virchow quem primeiro observou que as estruturas teciduais são afetadas por quadros patológicos.
Os avanços da histologia estão intimamente ligados aos avanços na microscopia, tendo ambas se desenvolvido paralela e conjuntamente. Em que pese o inegável avanço tecnológico que culminou nos microscópios eletrônicos, o presente estudo tem por escopo o trato de seu antecessor: o microscópio óptico (também conhecido como microscópio de luz ou fotônico), amplamente utilizado até os dias de hoje.
No microscópio de luz a imagem se forma a partir dos raios luminoso de um feixe de luz que atravessou a estrutura nele colocada. Sua estrutura conta com três sistemas de lentes: o condensador (concentra a luz da lâmpada e projeta o feixe luminoso), as objetivas (recebem a luz que atravessou o espécime e projeta sua imagem aumentada para as oculares) e as oculares (ampliam novamente a imagem e a projetam na retina).
O microscópio fotônico tem poder/limite de resolução máximo de 0,2µm, esta resolução torna possível a obtenção de boas imagens com um aumento de 1000 até 1500 vezes. Esse limite é o fator determinante para a riqueza de detalhes da imagem e depende essencialmente das lentes objetivas. Esse conjunto de lentes, normalmente, possui 4 componentes, cada um com um poder de aumento diferente, são eles: 4x essa lente é marcada por uma faixa vermelha e permite uma vista panorâmica do tecido), 10x (essa lente é marcada por uma faixa amarela e permite visualizar as diferenças entre os tecidos), 40x (essa lente é marcada por uma faixa azul e permite a visão de diferentes células) e 100x (essa lente é marcada por uma faixa preta e permite a percepção dos detalhes celulares.
Mas, os avanços nos estudos dos tecidos não se deram meramente na estrutura física dos microscópios – tais como lentes, ajustes de foco e tipos e feixes de luz que possibilitam melhor visualização dos espécimes estudados. Antes, o tratamento dado aos materiais analisados (desde sua coleta até sua disponibilização em lâminas) também passou por avanços significativos – ainda que alguns métodos e substâncias tenham se mantido praticamente inalterados ao longo dos anos.
Tal preparação é necessária para que não ocorra um processo conhecido por autólise - a destruição dos tecidos pela ação de enzimas digestivas existentes nas próprias células ou em bactérias, bem como para permitir a visualização daquelas estruturas ao microscópio, posto que a densidade tecidual não permite a passagem de luz (princípio empregado na microscopia óptica) pelo tecido íntegro, o que obriga ao fatiamento do mesmo em seções demasiado delgadas, chamadas cortes histológicos – que variam entre 1 e 10 micrômetros de espessura.
As amostras coletadas – quer para fins de pesquisa, quer para fins de diagnóstico – devem ser submetidas a uma sequência de procedimentos antes de estarem prontas ao estudo, que pode se dar por anos.
Entre os procedimentos realizados estão: eutanásia ou biópsia; coleta do material (retirada dos órgãos); fixação; clivagem; desidratação; clarificação (ou diafanização); inclusão; microtomia; banho-maria; coloração (subdivida em etapas) e montagem da lâmina (ou selagem). A seguir, abordaremos cada uma delas isoladamente.
1. EUTANÁSIA
O primeiro passo a ser realizado é a coleta do material, que pode ser retirado de um animal vivo (por meio de uma biópsia ou durante uma cirurgia, por exemplo) ou morto (necropsia). No caso de animais criados para fins de pesquisa cuja morte seja indispensável, o pesquisador deve atentar para a necessidade de imposição do menor sofrimento ao animal, provocando sua morte da forma menos agonizante e indolor possível – processo conhecido como eutanásia.
Tal procedimento encontra-se disciplinado pelo CONCEA – Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal.
Em apertada síntese, o documento exige não apenas que se imponha o menor sofrimento possível aos animais, mas também aborda questões éticas e morais de forma que tal prática se dê da forma mais humanitária possível, com vistas à preservação da sanidade física e psíquica do executor do animal. Isto porque alguns métodos de eutanásia se caracterizam por enorme atividade motora (muscular) entre a inconsciência do animal e sua morte. Ainda que isso não acarrete qualquer sofrimento ao mesmo, apresenta um aspecto desagradável de ser presenciado, o que pode levar alguns indivíduos a desenvolverem mecanismos de defesa que tendem a reduzir sua empatia e respeito no manuseio dos animais ou, no outro extremo, experimentaremsentimentos de pesar e tristeza pela perda da vida. Não raro os executores contumazes desenvolvem maior agressividade, depressão, alienação e profunda insatisfação com o trabalho, dentre outros problemas.
Para evitar isso, o responsável pela eutanásia deverá não apenas dominar as técnicas empregadas, mas entender o motivo pelo qual o animal está sendo morto e ser informado sobre a finalidade a que se destinará o cadáver, sendo salutar o revezamento dos executores, bem como que os mesmos não atuem sob pressão ou sejam obrigados a realizar o procedimento.
 Os animais devem ser acalmados para a realização da eutanásia: um ambiente limpo, sem a presença de outros animais, com baixa luminosidade e livre de estímulos estressores, quer visuais, quer sonoros, é sempre recomendado, bem como a limpesa do ambiente e dos objetos utilizados antes da entrada do próximo animal. Preferencialmente, aliás, os animais devem ser eutanasiados no ambiente em que vivem.
A eutanásia de animais selvagens, a seu turno, constitui um desafio à parte, sendo recomendado o auxílio (ou a orientação) de profissionais experientes no manuseio da espécie objeto do procedimento. Por vezes será forçoso o emprego de sedativos, analgésicos e/ou anestésicos injetados por meio de dardos ou de armas de captura (a injeção de tais substâncias também deve causar o menor estresse possível). Pode-se, ainda, fazer uso de fármacos por via oral (misturados ao alimento ou à água).
O que determinará, em grande parte, a escolha do método a ser empregado será sua confiabilidade, irreversibilidade e compatibilidade com a espécie, sua idade e estado de saúde.
Havendo a necessidade de eutanasiar um grande número de animais simultaneamente (como no caso de roedores), é possível fazer uso de sistemas automatizados que fornecem agentes inalatórios.
Quando a eutanásia houver de ser realizada em fetos e formas larvais, devemos considerar cada espécie isoladamente, levando em conta o tempo de gestação. De forma geral a morte da mãe culmina na morte dos fetos. Contudo, sua extração não deverá ser feita imediatamente, uma vez que sua maior resistência à hipóxia (baixa concentração de oxigênio) poderá lhe fornecer um tempo maior de sobrevida. Uma vez retirados os fetos, caso ainda estejam vivos, sua morte deverá se dar o mais rápido possível – por exemplo, por deslocamento cervical, no caso dos camundongos.
Se os fetos, porém, já tiverem ultrapassado mais de dois terços da gestação, sua morte induzida deverá se dar da mesma forma que seus congêneres (animais de mesma espécie) de idade adulta.
Os métodos de eutanásia atuam em três frentes: 
a) hipóxia direta ou indireta
Neste mecanismo os agentes devem causar inconsciência antes da perda da atividade motora.
b) depressão neuronal
Os agentes causadores de depressão dos neurônios cerebrais causam inconsciência seguida de depressão respiratória e parada cardíaca por hipoxemia.
c) interrupção da atividade cerebral e destruição de neurônios vitais
A interrupção da atividade cerebral e destruição de neurônios vitais podem ser alcançadas por trauma craniano (concussão), destruição direta do cérebro ou despolarização elétrica dos neurônios, o que induz à inconsciência de forma rápida. A morte ocorre por destruição dos centros que controlam as atividades respiratória e cardíaca ou pelo uso de métodos adicionais ou complementares para completar a eutanásia, como a exsanguinação, por exemplo.
Em regra, portanto, a eutanásia (quer por métodos físicos, quer por métodos químicos) deverá seguir a seguinte sequência: inconsciência, parada cardiorrespiratória e perda da função cerebral.
Inúmeros são os métodos de eutanásia, variando desde barbitúricos a compressão torácica, passando por decapitação, tiro com arma de fogo, atordoamento por eletonarcose, deslocamento cervical, eletrocussão etc.
Fonte:https://www.google.com/search?q=eutan%C3%A1sia+animal&rlz=1C1GCEU_pt-BRBR940BR940&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=2ahUKEwji_euKsL3wAhUnGbkGHTeICX0Q_AUoA3oECAIQBQ&biw=1920&bih=969#imgrc=c0wJKy-m0iCG4M
Neste ponto é importante frisar que um método aceito para determinado grupo taxonômico não necessariamente é aceito para outro. Tomemos por exemplo, o deslocamento cervical. Este é aceito com restrições para aves (que apresentem peso inferior ou igual a 3kg) e pequenos roedores (camundongos), mas é inaceitável para peixes ósseos e cartilaginosos.
Assim, o método a ser aplicado – considerando-se as espécies, de per si, seu peso e condições de saúde – está disciplinado naquela Diretriz da Prática de Eutanásia do CONCEA, referida anteriormente.
As tabelas que instruem a referida diretriz tomaram por escopo se o método empregado causa pouco ou nenhum sofrimento ao animal, provocando a morte de forma humanitária (recebendo a denominação de “método recomendado”); se o método não pode ser substituído por outro sem prejuízo dos resultados experimentais (“método aceito com restrição”), devendo o executor ter comprovada habilidade e qualificação para o emprego do método; ou se o método não se enquadra nos critérios ideais, não é humanitário ou apresenta outros problemas significativos associados ao seu uso (hipótese em que é tido como “método inaceitável”).
2. A COLETA DE MATERIAL (RETIRADA DOS ÓRGÃOS/TECIDOS)
A retirada e o manuseio dos tecidos e órgãos são procedimentos que exigem equipamentos, técnicas e cuidados apropriados a fim de evitar lesões que dificultem ou inviabilizem o exame histopatológico ou que possam induzir a erro o pesquisador por infração de lesões até então inexistentes.
A coleta de material, assim como todo e qualquer procedimento que envolva técnica histológica (ou mesmo qualquer outra que ocorra em âmbito laboratorial), requer planejamento e organização.
A bem dizer, a organização é um dos principais fatores para se criar um ambiente seguro voltado à realização de um trabalho, evitando a ocorrência de acontecimentos indesejados durante a realização de qualquer etapa do mesmo, tais como óbices à locomoção de pessoas no ambiente ou falta de espaço para a realização dos procedimentos.
Até mesmo a finalidade da coleta deve ser devidamente considerada. Assim, caso a mesma se preste à realização de diagnóstico de determinada enfermidade, deverá ser previamente submetida a análise por um patologista para verificação e anotações afetas aos aspectos macroscópicos da peça (cor, tamanho e aparência).
Após a coleta, é essencial que o material seja catalogado em livro próprio, para fins de registro (o material será identificado por um número que o acompanhará em todas as fases do procedimento). Também é recomendável que se registre o requisitante da análise histopatológica, a identificação do órgão, as datas de fixação do material, a data de entrada do material no laboratório, a identificação do paciente (e no caso de animais, dos tutores ou responsáveis), data e tipo do procedimento que culminou na obtenção do órgão ou tecido; descrição da biópsia, morte ou necropsia e tudo o mais que puder auxiliar o histopatologista na análise do material e na formulação de um diagnóstico.
Caso a amostra provenha de trabalhos experimentais com animais em instituições de pesquisa credenciadas, observados os protocolos e a legislação atinentes (no Brasil, por exemplo, em se tratando de animais experimentais originários diretamente do meio ambiente, é necessário apresentar o projeto ao órgão ambiental federal -IBAMA – com vistas à obtenção de autorização para a coleta do material), o material coletado deverá ser registrado em livro próprio logo após a eutanásia do animal. Neste livro deverá constar a identificação do laboratório, a data da eutanásia, os órgãos colhidos, o tipo de procedimento realizado com o animal experimental (infecção, por exemplo), o título do projeto e as observações necessárias para a avaliação do pesquisador ou tecnologista.
Presentemente é necessário que tal registro seja também realizado perante o comitê de ética da instituição, quer fornecerá um número de protocolo a ser informado no trabalho científicoa ser elaborado.
A desatenção a tais protocolos e exigências, inclusive legais, pode não apenas impossibilitar a realização da manipulação do material coletado por parte dos laboratórios, mas também sujeitar o responsável pela coleta a processos judiciais.
A coleta do material que será submetido a análise laminar pode se dar das seguintes formas:
- Biópsia cirúrgica. Aqui, o material é coletado mediante incisão cirúrgica;
- Biópsia endoscópica: utilizada para órgãos ocos – como o estômago e os intestinos -, através de procedimento endoscópico;
- Biópsia por agulha, na qual a amostra é obtida por punção do órgão sem a necessidade de abertura da cavidade natural;
- Cirurgias amplas: quando a amostra corresponde a um órgão – como no caso das mamas ou do útero, por exemplo – ou a peças grandes - como no caso de tumores; 
- Necropsia: quando a retirada ocorre em animais mortos.
Fonte: https://pt.slideshare.net/gustavofarias562114/atlas-de-anatomiadorato
Por fim, vale recordar que todo material biológico coletado para análise é potencialmente infectante, devendo-se adotar todo o cuidado na coleta e manipulação dos espécimes, não apenas evitando-se a contaminação do material submetido à análise, como também do próprio manipulador - o que impõe a utilização dos equipamentos de proteção individual (EPI´s), tais como luvas, máscaras, óculos de proteção, e jaleco – dentre outros que se fizerem necessários – e do meio ambiente, evitando-se o descarte de material biológico ou seus derivados em lixo comum.
 Fonte: https://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0101-20612003000200028
3. FIXAÇÃO
Após a retirada é fundamental que o material coletado seja imediatamente imerso em uma substância fixadora a fim de manter as estruturas biológicas o mais intactas possível. A fixação pode se dar de forma física (frio e calor), química ou por uma combinação de ambas. Na fixação química diversas substâncias podem ser empregadas, tais como glutaraldeído, ácido pícrico, cloreto de mercúrio, trióxido de crômio, álcool, sais de zinco, tetróxido de ósmio ou, o mais utilizado, formol (também conhecido como formalina: um aldeído na forma líquida com propriedades conservantes, que impedem o crescimento de microrganismos).
Esta etapa é importante não apenas porque interrompe o metabolismo da célula mas também porque estabiliza as estruturas bioquímicas intra e extra celular, permite a penetração de outros reagentes necessários no decorrer do processamento histológico, impede a colonização de microrganismos e promove o enrijecimento da amostra.
A fixação, no entanto, não é um processo instantâneo e para que produza os efeitos desejados é necessário, por vezes, que a amostra seja cortada em porções menores ou, alternativamente, que se proceda à injeção direta do fixador na mesma – procedimento conhecido como perfusão intravascular – propiciando que o interior dos tecidos seja rapidamente alcançado através dos vasos sanguíneos.
Após a fixação os tecidos conservam uma grande concentração de água (algo em torno de 85%). Esta água deverá ser retirada da amostra para que se possa, em uma próxima fase, incrustar o tecido em um bloco de parafina.
4. CLIVAGEM
Após o processo de fixação, a clivagem é essencial para facilitar a penetração da substância fixadora em menor tempo, evitando, assim, o processo de autólise. A clivagem é feita por meio da redução do tamanho das peças, seguindo a padronização dos fragmentos teciduais os quais devem ter cerca de 3 mm de espessura, mas em alguns casos o fragmento pode chegar a 5 mm. Ademais, cabe ressaltar a importância da orientação do corte das peças, visto que determina como os tecidos serão incluídos no bloco para o corte e, posteriormente, terão influência na análise microscópica de acordo com suas incidências longitudinal, transversal e oblíqua. Por último, deve-se lembrar de não pressionar o material fixado com pinça ou qualquer outro instrumental utilizado, para que não cause distorção da estrutura tecidual.
Fonte: Histologando (página do facebook criada pelas estudantes de Ciências Biológicas Elivânia Gomes e Carolina Alves da Universidade Federal do Ceará)
5. DESIDRATAÇÃO
Antes que um material de inclusão, como a parafina, possa penetrar no tecido, seu conteúdo em água deve ser removido, uma vez que a parafina não se combina homogeneamente com a água e sem ela o tecido não ganharia a rigidez necessária para o corte no micrótomo. Existem vários agentes desidratantes, porém o mais usual é o álcool etílico, em razão, principalmente, dos bons resultados e do baixo custo. Assim, a desidratação é levada a efeito, imergindo o bloco de tecido em concentrações crescentes de álcool etílico, ou seja, é realizada com sucessivas lavagens em álcool em concentrações crescentes. Inicialmente em álcool 70% durante o período de 24h, seguido de álcool 80% durante 1h, álcool 90% durante 1h, e então duas lavagens em álcool absoluto durante 1h cada.
 
 
Fonte: https://edisciplinas.usp.br/mod/resource/view.php?id=2850681
6. CLARIFICAÇÃO OU DIAFANIZAÇÃO
Nesse passo do processamento, para que o espécime seja preparado para a etapa seguinte, é necessário que o álcool usado na desidratação seja totalmente removido, pois é imiscível em parafina. Tal processo é feito com o uso do xilol, a quantidade utilizada deve ser de 10 a 20 vezes o volume da peça, e a duração da clarificação varia de acordo com as dimensões e a constituição do material, além da temperatura ambiente.
O xilol é, muitas vezes, chamado de agente clarificador, pois, conforme penetra no tecido e substitui o álcool, torna o tecido semitranslúcido, quase transparente. Essa também é a razão dessa etapa ser denominada de clarificação.
Fonte: Histologando (página do facebook criada pelas estudantes de Ciências Biológicas Elivânia Gomes e Carolina Alves da Universidade Federal do Ceará)
7. INCLUSÃO
Nessa etapa ocorre a preparação do material para os cortes, removendo o clarificante e fornecendo a sustentação necessária para que sejam realizados os cortes no micrótomo. Ela é extremamente importante pois, mesmo após passar por todos esses processos, as amostras de tecido ainda são extremamente frágeis.
Esse preparo ocorro por meio da impregnação do tecido com uma substância firme, normalmente é utilizada a parafina. Nele, o tecido é passado em duas trocas de parafina para assegurar a substituição de todo o agente clarificador, ocorre a uma temperatura de 56 a 60 ºC (parafina fundida), a temperatura alta também possibilita que o solvente utilizado na diafanização evapore. O bloco de tecido permanecerá imerso na parafina fundida durante o tempo necessário para a completa impregnação, posteriormente será retirado da estufa e deixado à temperatura ambiente até que endureça, para ser levado ao micrótomo onde será seccionado.
Fonte: Histologando (página do facebook criada pelas estudantes de Ciências Biológicas Elivânia Gomes e Carolina Alves da Universidade Federal do Ceará)
8. MICROTOMIA
Para que seja possível analisar um tecido em um microscópio óptico, é necessário que esteja disposta uma seção bem delgada de tecido na lâmina, na espessura de micrometros, já que o microscópio só consegue visualizar espécimes com essas dimensões. Ele é constituído de quatro peças principais: o corpo, o porta-bloco, o porta-objeto e a navalha.
Atualmente no mercado, há uma grande variedade de micrótomos, não limitando-se apenas a microscopia ótica, mas também a eletrônica. Vale a pena ressaltar alguns deles, como:
Criostato/micrótomo de congelamento: é utilizado para confeccionar cortes de tecidos que foram congelados. Ele é muito utilizado em hospitais no intuito de se adquirir uma rápida analise a respeito de determinado tecido.
Ultra micrótomo: é utilizado no microscópio eletrônico, possuindo uma navalha de vidro para realizar cortes extremamente delgados, na espessura dos nanômetros. 
 
 
 corte de fragmentos incluídos emparafina 
 
Fonte: manual de técnicas histológicas do instituto biomar
Figura 1, 2 e 3: Micrótomo manual rotativo em ilustração do processo de microtomia.
 
Fonte: website vidrarias de laboratório
 9. BANHO-MARIA
Após a realização do corte pelo micrótomo, as fitas produzidas devem ser retiradas com o auxílio de uma pinça e encaminhadas, delicadamente, ao banho-maria. No qual a uma temperatura de aproximadamente 40°C deve deixa-las na água no intuito delas se distenderem sobre a água, evitando a formação de dobras. Após esse processo, deve-se “pescar” esses cortes para que possam aderir as lâminas, que serão encaminhadas para o processo de coloração.
Material necessário para a realização de cortes de parafina: A- micrótomo B -banho frio C- banho quente 
 
Fonte: manual de técnicas histológicas do instituto biomar
 Banho-Maria 
 
Fonte: manual de técnicas histológicas do instituto biomar
10. COLORAÇÃO
Para que seja possível a observação dos cortes histológicos no microscópio óptico, após os procedimentos realizados, é fundamental a coloração destes devido à sua ausência de cor, uma vez que os cortes histológicos se encontram transparentes ou translúcidos. De acordo com isso, a utilização de corantes, seja por meio de reações químicas especiais (histoquímica), seja por meio de deposições metálicas, é de extrema importância para a visualização dos tecidos e das células constituídas, além de fazer distinção entre as diferenças das estruturas presentes nos cortes histológicos. Geralmente, é usado a combinação hematoxilina e eosina. Antes do uso de corantes, é necessária uma preparação prévia do tecido, visto que o fragmento histológico pode sofrer prejuízo pela falta de uma preparação, desse modo é feito algumas etapas antes da coloração, como a desparafinização e a hidratação.
 
Fonte: Histologando (página do facebook criada pelas estudantes de Ciências Biológicas Elivânia Gomes e Carolina Alves da Universidade Federal do Ceará)
10.1. DESPARAFINIZAÇÃO
Após a microtomia, cortes dos tecidos nas lâminas estão envoltos em parafina, a qual não é solúvel em água, diferentemente da maioria dos corantes que são solúveis em água, por isso ela precisa ser removida para que os corantes possam penetrar e se combinar com os elementos teciduais. Desse modo, o xilol é a substância usualmente empregada no processo de desparafinzação.
10.2. HIDRATAÇÃO
Após as lâminas serem desparafinadas, estas são submetidas à hidratação em álcool em sequência decrescente de graduação, ou seja, álcool 100%, 95%, 80%, 70% até a forma de água destilada, com o intuito do meio ser habilitado para receber os corantes solúveis em água e, logo, ficam prontas para serem expostas ao corante. Além disso, vale ressaltar que grande parte dos corantes se encontram diluídos em água, devendo o último banho ser com água. Entretanto, quando se utiliza um corante alcoólico, deve-se interromper hidratação em álcool 70%.
 
Fonte: (SHIKIRIAMA,2021)
10.3. COLORAÇÃO
Finalmente, ocorrerá a coloração da lâmina, na qual ocorre a imersão propriamente dita dos cortes no corante, sendo possível, posteriormente, visualizar a suas estruturas em um microscópio óptico. Os corantes coram os componentes teciduais (célula e matriz extracelular) de forma seletiva. Eles são compostos orgânicos aromáticos, ionizáveis e, a princípio, incolores, e para que haja cor, é preciso que seja adicionado um cromóforo, formando um complexo chamado cromógeno. Para que esse cromógeno se ligue seletivamente aos componentes tissulares, é necessário à sua ligação ao auxocromo, que determina o caráter ácido ou básico do corante. Ademais, os corantes também podem ser classificados de acordo com sua ação, tempo e cromatização. 
Existem dois tipos de corantes os vitais e os não vitais, aqueles coram células em cultura e em organismos vivos, entre eles azul trypan, azul de metileno e vermelho neutro e, estes coram tecidos previamente fixados, como a hematoxilina e a eosina (HE) - combinação bicrômica considerada coloração universal em histologia e histopatologia. 
De acordo com o emprego da coloração universal (HE) nos tecidos, a Hematoxilina é a primeira substância a ser usada, esta por si só não é um corante, tornando-se um quando oxidada em hemateína e para ter afinidade com os tecidos precisa da utilização de um mordente, normalmente alumínio ou ferro. Dessa forma, ao se tornar um corante de fonte vegetal e de natureza basófila, a Hematoxilina tem como função corar substâncias ácidas de roxo-azulado, o núcleo da célula, por exemplo, é corado por essa substância em razão da presença de ácidos nucléicos, logo, o núcleo é um basófilo. Já a Eosina é um corante ácido a qual tem a função de corar substâncias básicas de rosa-alaranjado, como o citoplasma da célula, sendo assim um acidófilo.
A lâmina é mergulhada na hematoxilina durante 3 minutos, o tempo de coloração para esse corante é maior devido á necessidade de mais tempo para corar as regiões ácidas das células. Enquanto, a lâmina mergulhada na Eosina dura, apenas, 30 segundos.
 Corador de lâminas - CITOCOLOR
 
Fonte: Acervo próprio dos autores (2020).
10.4 DESIDRATAÇÃO
Dando continuidade ao processo, faz-se necessário desidratar o tecido novamente, uma vez que a água não é miscível com os meios de selagem que são necessários para manter o material conservado. O procedimento é realizado utilizando concentrações alcoólicas crescentes: álcool 70%, 80%, 95% e 100%.
10.5 CLARIFICAÇÃO
Após a desidratação, o corte é banhado novamente no xilol, pois este atua como liquido intermediário entre o álcool e o meio de selagem. 
11. MONTAGEM DA LÂMINA (SELAGEM)
Na última etapa do processamento histológico, é feito a montagem da lâmina, esse processo consiste em cobrir o tecido com uma lamínula de vidro. Podendo ser utilizado para fixar a lâmina e a lamínula, resina natural (Balsamo do Canadá) ou sintética (Entelan), tomando cuidado para que não haja formação de bolhas de ar entre as duas. Após todos esses processos, o tecido já pode ser observado através de um microscópio óptico. 
Adição de resina sobre a lamina para montagem. 
 
Fonte: (HISTOLOGIA VET,2007) 
 
 
Fonte: (SHIKIRIAMA, 2021)
12. CONCLUSÃO
O processamento histológico, é um conjunto de etapas técnicas sequenciais, portanto, um pouco complexo. É fundamental que todas as etapas sejam executadas de forma correta, para obter um material de qualidade que posteriormente será objeto de estudo. Tendo isso em vista, é necessário que o profissional designado a realizar esses procedimentos tenha total atenção no manuseio dos equipamentos e produtos utilizados, possibilitando assim, um corte histológico de excelente qualidade, uma vez que o mesmo poderá ser utilizado em pesquisas acadêmicas, laboratoriais e/ou em diagnósticos clínicos.
REFERÊNCIAS
Nunes CS, Cinsa LA. Princípios do processamento histológico de rotina. Revista Interdisciplinar de Estudos Experimentais, v. 8, n. único, p. 31-40, 2016. Disponível em: https://docs.bvsalud.org/biblioref/2018/11/964830/2884-8890-1-sm.pdf 
JUNQUEIRA, Luiz Carlos Uchôa; Carneiro, José. Histologia básica, 2013
ISHIKIRIAMA, Bella Luna Colombini. Histologia e Seus Métodos de Estudo. Disponível em: 
https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/5243764/mod_resource/content/1/Aula%202%20-%20histologia%20e%20seus%20m%C3%A9todos%20de%20estudo.pdf. Acesso em: 25, abr. 2021.
Preparação de lâmina histológica: Inclusão ou embebição. Portal Educação. Disponível em: 
<https://siteantigo.portaleducacao.com.br/conteudo/artigos/biologia/preparacao-de-lamina-histologica-inclusao-ou-embebicao/31099#>.Acesso em: 28, abr. 2021;
Técnicas histopatológicas: Preparação de tecidos. Kasvi, 2017. Disponível em: <https://kasvi.com.br/histopatologica-tecnica-tecido-celular/>. Acesso em: 28, abr. 2021;
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