PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO

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Processamento histológico 
 
Histologia e embriologia geral veterinária 
Semestre 2020.1 
Docente: Janaina Serra Azul Monteiro Evangelista 
 
 
Autores: 
 
João Lucas Medeiros número: 1572260 
Julyanne Vasconcelos Lima número: 1567270 
Gabriel de Bessa e Teixeira Lima número: 1572312 
Ana Thereza Braz número: 1572285 
Rubens Araújo Sousa número: 1572320 
 
 
 
 
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Fortaleza-CE, 30 de novembro de 2020. 
SUMÁRIO 
 
 1. Introdução ................................................................................................ 2 
 2. Técnicas do processamento histológico....................................................3 
 2.1 Microscópios...........................................................................................3 
 3 Etapas do processamento histológico........................................................4 
 3.1 Coleta......................................................................................................4 
 3.1.1 Eutanásia..............................................................................................5 
 3.1.2 Retirada de órgãos...............................................................................5 
 3.2 Fixação...................................................................................................6 
 3.2.1 Fatores que influenciam na qualidade de fixação...............................6 
 3.3 Processamento........................................................................................7 
 3.3.1 Desidratação........................................................................................7 
 3.3.2 Clarificação.........................................................................................8 
 3.4 Inclusão ou impregnação.......................................................................9 
 3.5 Corte no micrótomo..............................................................................9 
 3.6 Banho-maria.........................................................................................10 
3.6.1 Procedimentos para microtomia e banho-maria................................10 
 3.7 Coloração.............................................................................................12 
 3.8 Materiais usados..................................................................................13 
 3.9 Reagentes usados.................................................................................13 
 3.9.1 Sobre os corantes..............................................................................13 
 4. Conclusão..............................................................................................15 
 5. Agradecimentos....................................................................................16 
 6. Referências bibliográficas....................................................................17 
 
 
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Fortaleza-CE, 30 de novembro de 2020. 
1. Introdução 
Importância do processamento histológico 
 
 Desde quando Rudolph Virchow concluiu que um organismo não fica doente, mas 
sim um determinado grupo de células, a técnica histológica se aprimorou cada vez mais, 
permitindo o preparo do tecido para análise ao microscópio e, consequentemente, a 
observação de suas estruturas celulares. Esse exame, geralmente, acontece por meio de 
uma luz transmitida, que atravessa o objeto o qual se deseja estudar. É justamente por 
esse motivo que as lâminas, prioritariamente, são finas e também transparentes. 
 Considerando a importância desse processamento histológico para o conhecimento 
adequado e do funcionamento das células, dos tecidos e órgãos, é válido lembrar que 
esses tecidos selecionados para serem estudados devem ser preparados de tal jeito que 
preserve a sua estrutura original ao máximo. Contudo, apesar dessa necessidade de 
precisão, é inevitável que essas lâminas celulares apresentem artefatos, que são as 
modificações ocasionadas a partir as técnicas que foram utilizadas. 
 Assim, a técnica histológica de processamento é um método básico, primário e 
essencial no que tange a caracterização, diagnóstico e, consequentemente, tratamento de 
patologias. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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2. Técnicas do processamento histológico 
 Para realizar o estudo do processamento histológico é necessário obter uma amostra 
do material biológico, obtido através de organismos mortos, por biópsias ou peças 
cirúrgicas e as amostras serão processadas para confecção em lâminas. Em razão da 
histologia ser o estudo das células e dos tecidos do corpo, e essas estruturas se 
organizarem em pequenas dimensões de células, o estudo somente é realizado com 
auxílio de microscópios, dentre os quais, o microscópio de luz, é o mais utilizado. A 
técnica histológica de rotina consiste em uma série de etapas de preparação do tecido 
para o estudo, seja por interesse de pesquisa científica ou de diagnósticos patológicos. 
 Vale a pena ressaltar a importância do planejamento para a execução de qualquer 
procedimento que envolva a técnica histológica, pois tal planejamento facilita e evita 
acontecimentos indesejados durante a realização de qualquer etapa desse processo. De 
forma geral, a organização é um dos principais fatores para se criar um ambiente seguro 
para o desempenho do trabalho. Um laboratório limpo e organizado é fundamental para 
se desenvolver um bom estudo. A técnica utilizada e o meio de auxílio, como a escolha 
do microscópio, também é ressaltado na importância para a execução de qualquer 
procedimento histológico. Quando se fala sobre microscópios, uma variedade de tipos e 
modelos disponíveis pode nos vir à cabeça. Contudo, cada um exerce uma determinada 
função e os mais utilizados são: 
 2.1 Microscópio óptico ou de luz - As preparações coradas são examinadas por 
uma iluminação que atravessa o espécime. É o tipo mais utilizado e prático para 
as técnicas histológicas, utiliza-se de energia elétrica e lâmpadas. Em 
contrapartida, seus limites de resolução máxima é de aproximadamente 0,2 
micrômeros, o que pode impossibilitar estudos em maior grau de especificidade. 
 2.1 Microscópio eletrônico - As microscopias eletrônicas podem ser de 
transmissão e de varredura, e se baseiam na interação entre elétrons e 
componentes dos tecidos, n. Utilizam cortes mais delgados que os de 
microscopia de luz. O eletrônico obtém visão de estruturas muito pequenas, 
com imagens de resolução em nanômetros. O tipo de varredura, fornece imagens 
mais superficiais das superfícies de células, tecidos e órgãos. E ao contrário do 
microscópio de transmissão, os elétrons não atravessam o espécime. 
https://www.lojaroster.com.br/microscopios
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Fortaleza-CE, 30 de novembro de 2020. 
 2.1 Microscópio confocal – O microscópio confocal foi desenvolvido para 
possibilitar um foco em um plano muito delgado do espécime, o que nos outros 
tipos, não havia possibilidade e muitas vezes, havia superposição de vários 
planos. São microscópios que dependem de grande capacidade de computação, e 
utilizam-se de feixes de luz muito estreitos, focando em uma só imagem e 
bloqueando as imagens de planos anteriores e posteriores. 
 
 
 
 
 
 
Microscópio óptico ou de luz trinocular– Laboratório de Histologia e embriologia 
geral veterinária da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará. 
3. Etapas do processamento histológico 
 Os procedimentos utilizados para se obterem amostras de tecido ou preparados 
histológicos retirados de um organismo para exame microscópico incluem: coleta do 
material, fixação, processamento, inclusão, microtomia (corte) , banho-maria e 
coloração. 
3.1 Coleta 
 Para que uma amostra de tecido seja analisada microscopicamente, é preciso, antes 
de tudo, que seja retirada do organismo. O manuseio das peças deve ser feito com 
delicadeza, devido à fragilidadedos tecidos. Uma pressão exagerada ou mesmo o uso de 
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instrumentos inadequados, além de dificultar o exame histológico, pode alterar o tecido 
de tal maneira que possa simular uma lesão. 
3.1.1 Eutanásia: 
 Consiste na melhor forma em que o animal irá vir a óbito para não prejudicar os 
órgãos e tecidos para a fabricação das lâminas. Para que isso ocorra corretamente e não 
traga sofrimento ao animal, são necessárias algumas considerações, como: 
 A compatibilidade com os fins desejado. 
 Ser seguro para quem executa. 
 Comprovar sempre a morte do animal. 
 Respeito ao animal. 
 Ausência ou redução máxima de desconforto e dor. 
 Ausência ou redução máxima do medo e da ansiedade. 
Com isso, é recomendável a execução por métodos físicos. Decapitação ou 
deslocamento cervical, por exemplo. 
3.1.2 Retirada de órgãos: 
 Consiste na coleta e dissecação do órgão ou tecido escolhido para a laminação. Deve-
se ter atenção ao tamanho do órgão, pois se for muito grande deve-se fazer a 
macrotomia deste antes. Após a retirada, realizar a lavagem do órgão em água. 
 Após a realização da eutanásia, para material proveniente de pesquisas experimentais, 
um registro deve ser feito, em livro próprio. No livro de registro experimental devem 
constar a identificação do laboratório, a data da eutanásia, os órgãos colhidos, o tipo de 
procedimento realizado com o animal experimental, o título do projeto e as observações 
necessárias para avaliação do pesquisador ou tecnologista. Atualmente, deve-se realizar 
também o registro no comitê de Ética da instituição, que aprovará a realização da 
pesquisa, fornecendo o número de protocolo. Esse número é importante, pois deve ser 
informado ao se elaborar um trabalho científico. Tratando-se de animal experimental 
nativo, originário diretamente do meio ambiente, o pesquisador deve submeter o seu 
projeto ao Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis 
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(Ibama) a fim de obter uma autorização para coleta, sem a qual poderá estar sujeito a 
sanções da legislação vigente. 
3.2 Fixação: 
 Ao se remover qualquer material (orgão ou tecido) de um organismo após a sua 
morte, esse material inicia um processo de apoptose, ou seja, por não receber o 
suprimento necessário de oxigênio e de substâncias essenciais ao seu funcionamento, 
iniciará o acúmulo de dióxido de carbono nos tecidos e, em suas células, inicia-se o 
processo autodestruição. Assim, ao se analisar as estruturas teciduais de um 
determinado orgão ao microscópio, necessita-se preservar os tecidos, sendo 
imprescindível a realização do processo de fixação. 
 A fixação é uma das etapas mais importantes da técnica histológica, pois visa “fixar o 
metabolismo”, interromper o metabolismo celular, estabilizando as estruturas e os 
componentes bioquímicos, preservando e conservando os elementos teciduais, além de 
permitir a penetração de outras substâncias subsequentes. E pode ser realizada por 
métodos químicos ou, menos frequentemente, por métodos físicos. 
 Método químico- Os tecidos são imersos em soluções fixadoras de agentes 
desnaturantes ou de agentes que estabilizam as moléculas ao formar pontes com 
moléculas adjacentes. 
Observações: Um grande fragmento deverá ser cortado com bisturi em outros menores 
antes de ser imerso no fixador, pois como demora algum tempo para que o fixador se 
difunda de maneira rápida e completa pelo interior de fragmentos, o tamanho deverá ser 
reduzido e assim tornando-se mais fácil a penetração do fixador. Um dos fixadores mais 
utilizados para microscopia de luz é uma solução de formaldeído a 4% (ou a 10%). O 
tempo de fixação pode variar entre 12 e 48 horas, dependendo do material a ser 
processado, e o seu tamanho. 
3.2.1 Fatores que influenciam na qualidade da fixação: 
A boa fixação de um tecido depende dos seguintes fatores: temperatura, 
espessura do tecido, penetração, tempo de fixação, escolha do fixador, relação 
do volume fixador/tamanho do espécime, estocagem apropriada, pH do fixador, 
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osmolaridade da solução fixadora, adição de sais na mistura e concentração dos 
fixadores. 
 O tempo de fixação de cada agente fixador depende da temperatura, que, quando 
elevada, faz com que a penetração do fixador no tecido seja mais rápida. Todavia, uma 
penetração muito rápida pode retrair bruscamente o tecido, gerando artefatos 
posteriores, além de poder comprometer a qualidade das colorações. Assim como a falta 
de fixação, o excesso de tempo destinado à fixação pode ser prejudicial à observação do 
tecido, podendo produzir artefatos como retração nuclear e perda de definição de 
detalhes celulares. 
 
 
 
 
 
3.3 Processamento: 
 O processamento técnico propriamente dito consiste em uma preparação para que as 
peças sejam, posteriormente, emblocadas em parafina (ou produtos similares) e cortadas 
em fatias muito finas, a fim de que possam ser observadas. Esse processamento é 
dividido em duas etapas; sendo elas a desidratação e a clarificação e se torna muito 
importante, a identificação dos frascos e seus devidos órgãos. 
 
3.3.1 Desidratação: 
 O material biológico, mesmo após a fixação, ainda retém cerca de 85% de água em 
seu interior e, como se sabe, a parafina é um produto derivado do petróleo, portanto, 
insolúvel em água. Desta forma, para que ela consiga penetrar no tecido processado, é 
necessário que a água presente seja retirada. Diversas substâncias desidratantes são 
eficazes, variando apenas o tempo de desidratação. 
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 Entre elas, pode-se citar os álcoois isopropílico e metílico, a acetona pura, e o éter. 
Porém, rotineiramente, é o álcool etílico o produto mais utilizado para esse fim. 
Aconselha-se que a desidratação do tecido seja feita de forma progressiva quanto à 
graduação alcoólica, e não diretamente com o álcool absoluto. Isto porque uma 
desidratação muito rápida provoca maior retração do tecido, podendo ocasionar 
artefatos posteriores. O material é mergulhado em frascos contendo álcool de 
concentrações crescentes de álcool a 70%; 95%. O álcool absoluto corresponde a 100% 
de pureza. 
 
 
 
 
 
3.3.2 Clarificação: 
 Como dito anteriormente, a parafina é insolúvel em água, e muito pouco em álcool. 
Desta maneira, faz-se necessário que o álcool presente nas peças após o processo de 
desidratação seja substituído por um produto com o qual a parafina tenha afinidade. 
Dentre os produtos conhecidos estão o xilol e nos processos de rotina, é o mais 
utilizado. O xilol é um solvente orgânico derivado do petróleo, trata-se de um líquido 
incolor, volátil e conforme vai penetrando na peça, em substituição ao álcool, a peça vai 
se tornando mais pura, sem muitas impurezas e se tornando mais clara, motivo pelo qual 
a etapa pode ser chamada de clarificação. 
 
 
 
 
 
 
 
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3.4 Inclusão ou Impregnação: 
 Nessa etapa, as peças são infiltradas por alguma substância de consistência firme 
para que adquiram rigidez suficiente e seja possível a realização de cortes finos. São 
vários os materiais utilizados para esse fim, como parafina ou resina. Para que os 
tecidos sejam infiltrados pela parafina, é preciso que se atinja seu ponto de fusão 
(aproximadamente 60°C) em estufa histológica, pois ela se mantém sólida à temperatura 
ambiente e após isso, serem mergulhados os cassetes histológicos na parafina, assim 
ganhando forma. Fatores que influenciam na qualidade da impregnação: 1) 
Temperaturas muito elevadas podem causar danos ao tecido, tornando as peças muito 
retraídas e com rigidez exagerada, dificultando sua seção. 2) Por outro lado, se a 
temperatura estiver abaixo do ponto de fusão da parafina, não se tornapossível a 
impregnação da peça. Após isso, colocar na geladeira para que o bloco fique duro. 
 
Figura 1 – Estufa histológica; Figura 2 – Recipiente inclusor de parafina para 
espessar os blocos; Figura 3 –Estufa histológica. 
3.5 Corte no micrótomo: 
 Após a formação dos blocos de parafina, as peças necessitam ser cortadas. As 
secções na lâmina são feitas através de uma máquina específica, o micrótomo, no qual 
contém uma navalha finíssima capaz de fazer cortes de 1 a 10 micrômetros. Assim, 
coloca-se a lâmina no micrótomo e faz o corte escolhido (longitudinal, transversal). 
Fatores que influenciam a qualidade da microtomia: O surgimento de artefatos no 
corte pode ser devido ao estado inadequado da navalha ou a problemas ocorridos 
durante etapas anteriores, no processamento. Por exemplo, fitas de cortes curvas ou 
irregulares podem surgir quando a navalha e o bloco não estão paralelos, ou porque a 
borda de corte da navalha estava irregular, ou porque na impregnação a parafina estava 
impura ou não misturada homogeneamente. 
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Figura 1 – Micrótomo; Figura 2 – Amostra histológica emblocada em parafina. 
3.6 Banho-maria: 
 Após serem seccionados, os cortes são colocados para flutuar sobre uma 
superfície de água aquecida (50- 60C graus), para que o corte se distenda pela água 
e depois, realizar uma “pesca” com lâminas de vidro e uma substância de bálsamo 
do Canadá, onde conseguem aderir e serão, em seguida, levadas para uma estufa e 
coradas para observação. 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1 – Equipamento para banho-maria. 
 
 3.6.1 Procedimento para microtomia e banho-maria: 
1- Fixar o bloco no micrótomo. 
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2- Acertar o bloco para que a sua superfície fique paralela à navalha. 
3- - Efetuar a microtomia propriamente dita, obtendo os cortes com o auxílio 
de uma pinça, a qual auxilia na manipulação da fita formada. 
4 - Retirar a fita do micrótomo, com o auxílio da pinça, e transportá-la para o 
banho-maria, para realizar a distensão dos cortes. A temperatura do banho-maria 
deve estar em torno de 40oC para que os cortes se distendam sobre a superfície 
da água. Pode-se, também, após a execução dos cortes, colocá-los em banho-
maria em temperatura ambiente e distendi-los em placa aquecedora com a 
temperatura em torno de 40 oC a 45 oC. 
5 - Coletar o corte com uma lâmina limpa e adesivada, o que denominados de 
pesca. 
6 - Transferir a lâmina com o corte para uma placa aquecedora. 
7 - Levar a lâmina para estufa aquecida a 60 oC para retirar o excesso de 
parafina e melhorar a adesão do corte à lâmina. 
 
 
 
 
 
 
 
Observação: 
Após a desparafinização na estufa por 40 min, ou seja, remoção do excesso de 
parafina do corte e favorecer a aderência, necessita-se realizar outra etapa: A 
hidratação, pois como os corantes são formados a base de água, é necessário que o 
tecido esteja hidratado para que seja corado de forma correta. 
 
 
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3.7 Coloração: 
 Para ser observada e estudada ao microscópio, os cortes histológicos devem ser 
corados, pois os tecidos são incolores. Com essa finalidade, foram desenvolvidos 
métodos de coloração. Os corantes mais comumente usados são a hematoxilina, que é 
um corante azul/ roxo de natureza básica, e a eosina, que é um corante rosa/vermelho de 
natureza ácida. Ou seja, cada um desses corantes irá demarcar determinadas células, 
sejam elas básicas ou ácidas. 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1 - Corantes Hematoxilina e Eosina, respectivamente. 
 
E após todas as etapas descritas acima, a observação histológica ao microscópio se 
inicia: 
 
 
 
 
 
 
 
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3.8 Materiais usados: 
- Instrumentos cirúrgicos para retirada de órgãos. 
- Estufa para aumentar a temperatura da parafina. 
- Recipiente para manter a parafina. 
- Cassete histológico. 
- Placa aquecedora. 
- Geladeira. 
- Micrótomo. 
- Equipamento para o banho-maria. 
- Lâminas. 
- Microscópio óptico ou de luz. 
3.9 Reagentes usados: 
- Formaldeído a 10%. 
- Soluções crescentes de álcool, que podem variar de 70% até 100%. 
- Xilol. 
- Parafina ou resina. 
- Corantes. 
3.9.1 Sobre os corantes: 
 A etapa de coloração ocorre por meio de diferenças de pH e de relações eletrostáticas 
entre os corantes e regiões do tecido observado. Os corantes têm uma certa seletividade 
para corar algumas regiões do tecido, isso porque corantes ácidos reagem com áreas 
alcalinas do tecido, já corantes básicos interagem com áreas acidas do tecido. A 
combinação de corantes mais usada se dá por meio da hematoxilina e eosina (HE). A 
hematoxilina cora em violeta as partes ácidas da célula (como núcleo, ribossomos e 
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outras partes do citoplasma ricas em RNA), já a eosina cora em cor-de-rosa partes 
básicas da célula (como citoplasma e fibras de colágeno). 
 Apesar dessa combinação ser a mais usada, existem outras combinações de corantes 
disponíveis para uso em laboratórios. Alguns outros exemplos de corantes básicos são o 
azul de metileno e azul de toluidina, que assim como a hematoxilina, coram áreas 
basófilas da célula. Os corantes que interagem com áreas acidófilas assim como a eosina 
são, Orange G e fuscina ácida. 
 
 
Figura 1 – Desenho da lâmina histológica tecidual do Fígado. 
Estruturas coradas por hematoxilina e eosina. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2 – Lâmina histológica tecidual do fígado. 
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4. Conclusão 
Opinião sobre o aprendizado desta técnica para a microscopia óptica: 
 Ao estudarmos os processamentos histológicos, conseguimos compreender que para 
haver a possibilidade do estudo dos tecidos da melhor forma possível é, 
imprescindivelmente, ser realizado as técnicas de maneira correta. Ou seja, apenas o 
aprendizado efetivo dos métodos de preparação de lâminas irá possibilitar a realização 
de muitos estudos e trabalhos que venham a ser realizados. 
Podemos averiguar essa premissa em cada etapa do processamento histológico, 
visto que há riscos em qualquer procedimento, dependendo da forma que realizarmos as 
técnicas, haver algum prejuízo na qualidade no tecido que seria nosso objeto de estudo. 
Um exemplo disso seria o modo de eutanásia do animal, uma vez que o uso de 
substâncias, como Cloreto de Potássio ou algum anestésico não compatível, irão reagir 
com os tecidos e gerar alterações que não possibilitarão uma amostra de tecido 
saudável, isso nos aponta que o conhecimento das técnicas são fundamentais para 
produzir uma excelente lâmina ao utilizar a microscopia óptica. 
Com isso, fica evidente que o aprendizado das técnicas de processamento 
histológico são indispensáveis para a devida construção de lâminas e, 
consequentemente, fundamentar um bom estudo sobre os tecidos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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5. Agradecimentos: 
 
 
 O desenvolvimento desta pesquisa, somente tornou-se possível, com o empenho e 
ajuda de toda a equipe, e principalmente, a partir do conhecimento obtido durante as 
aulas ministradas por tal grandiosíssima pessoa: 
 
 Professora Janaina Serra Azul Monteiro Evangelista, Docente na disciplina de 
histologia e embriologia geral veterinária do curso de Medicina Veterinária da 
Universidade Estadual do Ceará. 
 
 Agradecemos à professora, por sempre estar disposta a ajudar e contribuir para um 
melhor aprendizado de seus alunos e por toda atenção dada até aqui. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Alunos: Julyanne Vasconcelos, João Lucas Medeiros, Gabriel de Bessa, Rubens Araújo, 
Thereza Braz. 
 
Obrigado! 
 
 
 
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6. Referências Bibliográficas: 
 
 
Junqueira LC, Carneiro J, Abrahamsohn P. Histologia básica. 12ª ed. Rio de 
Janeiro: Guanabara Koogan; 2017. Capítulo 1, Métodos de estudo em Histologia; p. 1-
20. 
HISTOLOGIAVET. Citologia, histologia e embriologia veterinária, 2017. Revista. 
Disponível em: http://histologiavet.blogspot.com/ 
NUNES, Clarissa de Souza. CINSA, Letícia Alves. Princípios do processamento 
histológico de rotina. Revista Interdisciplinar de Estudos Experimentais, 2016. 
Disponível em: https://docs.bvsalud.org/biblioref/2018/11/964830/2884-8890-1-sm.pdf 
CIÊNCIA EM AÇÃO. Curiosidades química formol, 2018. Formol. Disponível em: 
https://cienciaemacao.com.br/formol/ 
MINISTÉRIO DA CIÊNCIA, TECNOLOGIA E INOVAÇÃO. CONSELHO 
NACIONAL DE CONTROLE DE EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL-CONCEA. 
Diretrizes da pratica de eutanásia do CONCEA, 2013. Disponível em: 
http://www.imt.usp.br/wp-content/uploads/cpq/diretrizes-eutanasia.pdf 
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS UFMG. Técnicas histológicas, s.d. 
Disponível em: http://depto.icb.ufmg.br/dmor/pad-morf/histologicabasica.htm 
INSTITUTO POLITÉCNICO DE LISBOA. Controle de Qualidade do Processamento 
Histológico em Histotecnologia 2015. Disponível em: 
https://repositorio.ipl.pt/bitstream/10400.21/5659/1/Controlo%20de%20qualidade%20d
o%20processamento%20hitológico%20em%20histotecnologia.pdf