Histotecnologia II

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Histotecnologia II		Resumo
Histotecnologia II - Teórica
Índice
Coloração e Corantes	6
Corantes	6
Classificação geral dos corantes	6
Grupo Auxocromo:	6
Coloração	7
Classificação	7
Mecanismos de Coloração	7
Hematoxilina e Eosina	7
Geral	7
Protocolo (regressiva)	7
Resultados esperados:	8
Coloração automática	8
Montagem de Cortes histológicos	8
Objetivos	8
Processo de Montagem	9
Meios de Montagem	9
Tipos de meio de montagem	9
Índice de Refração	9
Índice de Meios de Montagem naturais	9
Meios de Montagem sintéticos	9
Critérios dos meios de montagem	9
Funções dos meios de montagem	10
Técnicas de montagem	10
Manual	10
Automático	11
Exames extemporâneos	11
História	11
Definição	11
Vantagens em realizar este exame:	12
Cadeia de pressão	12
Técnicas	13
Exame extemporâneo para:	13
Diagnóstico	13
Neoplasias da mama	13
Cirurgia Mamária oncológica	13
Exame extemporâneo do Gânglio linfático sentinela	14
Tireoide	15
Margens	15
O paciente	16
Manter a calma	16
Fatores que favorecem a acurácia do exame anatomopatológico intraoperatório	16
O PLUS que o técnico oferece	16
Avaliação de margens e limites cirúrgicos intraoperatórios	17
Exame extemporâneo para estadiamento	17
Neoplasias epiteliais do ovário	17
Adenocarcinoma do útero	17
Metástase cervical-primária oculto	18
Neoplasia da linha média	18
Contraindicações e limitações	18
Conclusões a retirar	18
Controlo de Qualidade	19
Criotomia	20
Métodos de Congelação:	20
Técnicas que aceleram a congelação do tecido:	20
Temperatura	21
Meio de Montagem – Gel	21
Corte em Criostato:	21
Técnica	22
Corte	22
Micrótomo de Congelação	22
Criostato	22
Criotomia	23
Coloração	23
Exame extemporâneo:	24
Macroscópico	24
Microscópico	24
Gânglio Sentinela	24
Cirurgia Micrográfica de Mohs	26
Banco de tecidos e tumores	26
Congelação de tecido muscular – Neuropatologia	26
Registo e Rastreamento de Amostras Biológicas	27
Identificação e Informação	27
Transporte:	28
Sacos de transporte	28
Amostras inadequadas	28
Ideal saber em que fase é que se encontra a amostra	28
Arquivo de blocos e lâmina	28
Critérios	29
Condições	29
DreamPath	29
Organização do Laboratório	29
Áreas de um laboratório	29
Histologia	30
WorkFlow	31
Lean Workflow	31
Gestão de um laboratório	31
Desafios da gestão	31
Acreditação	31
ISO 9001	32
Contaminação	32
Macroscopia	33
Inclusão	33
Microtomia	33
Coloração/ Montagem	33
Colheita	34
Resultados das contaminações	34
Extração de Ácidos Nucleicos em blocos de parafina	34
Etapas de Extração dos ácidos nucleicos:	34
Qualidade da amostra	35
Qualidade de extração	35
Qualidade de extração	35
Manipulação da amostra	35
Fixação tecidual	35
Qualidade de extração	36
Técnicas de obtenção de material	36
Miniprep Kit Zymo	36
Idylla	36
Fotografia ou Microfoto	37
Associado Macroscopia	37
Associado a processos de autópsia:	37
Vantagens dos sistemas fotográficos incorporados:	37
Fotografia na microscopia (microfotografia):	38
Telepatologia	38
Norma 004/2015 (é o que está no PowerPoint, mas convém ler o documento)	38
WSI – WholeSlide Imagine	39
Vantagens	39
Desvantagem	39
Controlo de qualidade	39
Preparação de peças anatómicas para exposição	40
Vantagens	40
Técnicas de fixação	40
Mais utilizados:	41
Menos utilizado	41
Formol	41
Glicerinação	41
Técnica de Laskowski	41
Plastinação	42
Cada peça requer abordagens diferentes:	42
Coloração e Corantes
Corantes
· Moléculas que contem dois grupos:
- Cromóforo – responsável pela cor do corante
- Cromogéneo – composto formado pelo grupo cromóforo
> Básico – ligação com os radicais ácidos dos tecidos (Hematoxilina)
> Ácido – ligação com os radicais básicos do tecido (Eosina)
· Auxocromo – Quando introduzido forma um corante
Classificação geral dos corantes
· Genéricos – visualização da arquitetura geral do tecido (diferenciar núcleo e citoplasma: HE)
· Específicos – Demonstração especifica de um elemento do tecido (diagnóstico diferencial: PAS, Perls, Van Gieson, etc)
· Impregnação por metais pesados – identificação da estrutura através da deposição de metais (diagnóstico diferencial: Gomori, PASM, etc)
Grupo Auxocromo:
· Básicos – com carga positiva e vão ser utilizados para corar estruturas ácidas (hematoxilina, fucsina básica, etc)
· Ácidos – com carga negativa e vão ser utilizados pata corar estruturas básicas (Eosina, fucsina ácida, etc)
· Neutros – coloração por causa da interação do corante básico com o corante ácido (Giemsa, etc)
· Indiferentes – insolúveis em água, mas são solúveis no álcool (RedOil, Sudan Black)
· Ortocromáticos – transmissão da própria cor ao tecido (verde luz, azul de anilina)
· Metacromáticos – produção de cor diferente da original (violeta de metilo, azul de toluidina)
Coloração
· Identificação especifica de estruturas celulares, pigmentos e microrganismos, através de substâncias que ao reagirem com estes componentes, dão origem a produtos corados. Obtém-se, portanto, um diagnóstico diferencial
Classificação
· Topográfica – visão global de uma estrutura, tecido ou lesão (HE)
· Citológica – visão pormenorizada das estruturas celulares, núcleos (Giemsa)
· Histoquímica – demonstra determinada estrutura química (Perls)
· Estrutural – evidencia componentes estruturais dos tecidos (Van Gieson)
Mecanismos de Coloração
· Diretas – afinidade dos tecidos para com o corante
· Indiretas – impregnação do tecido com um composto que possibilita a ligação do corante com o tecido (aumenta a afinidade)
· Mordente – agentes oxidantes (ácido crómico, oxálico, etc)
· Sais metálicos – alumino, ferro, chumbo
· Progressivas – para alcançar a coloração desejada segue uma sequência definida
· Regressivas – sobrecoloração do tecido/ de todas as estruturas sendo depois utilizado um diferenciador (provoca a descoloração)
· Diferenciador – remoção seletiva do excesso de corante no tecido
Hematoxilina e Eosina
Geral
· Método de coloração histológico combinada
· Tem várias variantes devido a diferentes tipos de hematoxilina e eosina que são empregues
· Fase inicial – coloração de núcleos (hematoxilina) – corante nuclear
· Fase posterior – contraste citoplasmático e componentes celulares – corante citoplasmático
· Boa coloração da arquitetura tecidular geral
Protocolo (regressiva)
1. Desparafinar (xilol)
2. Desidratar (tem de ser feita com diferentes concentrações porque pode alterar a Citoarquitectura e tem de retirar o máximo de água possível/ preparação do núcleo para receber hematoxilina que um corante numa solução aquosa) 
3. Hidratação (o próximo corante precisa de água) 
4. Hematoxilina
5. Água (retira o excesso de corante)
6. Diferenciador (HCL)
7. Água corrente (azular os núcleos)
8. Eosina (corante numa solução num meio aquoso e por isso é que se pelo álcool primeiro para preparar o citoplasma e algumas estruturas)
9. Álcool a 96º 
10. Álcool a 100º
11. Clarificação (xilol)
12. Montagem
Resultados esperados:
· Núcleo – Azul
· Citoplasma – Rosa (várias tonalidades)
· Fibras musculares – vermelho e rosa forte
· Eritrócitos – Vermelho e laranja
· Fibrina – Rosa forte
Coloração automática
Vantagens
· Tempo
· Contacto com reagentes é quase nulo
· Cora várias lâminas ao mesmo tempo
· Faz sozinho a desparafinação
· Faz vários protocolos em simultâneo
· Garante tempo standard (fica tudo no mesmo tempo)
Desvantagem – é uma máquina, preço e manutenção, 
Montagem de Cortes histológicos
Objetivos
· Proteção mecânica dos cortes (protege os cortes histológicos)
· Proteção química dos cortes (proteger as lâminas)
· Amostra com índica de refração homogéneo (permite a observação ideal sem alterações ao MO); tem de ser mantido neutro e homogéneo 
· Protege de impacto assim como possibilita o seu arquivo pelo que vai impedir que os cortes se deteriorem; mantem as cores (pode deteriorar ao longo de tempo)
Processo de Montagem
· Fixação – Através do meio apropriado
· Da lamela à lâmina
· Zona de corte
Meios de Montagem
· Naturais –Substâncias orgânicas secretadas pelo metabolismo vegetal e que é transparente (resina)
· Semi-sintéticos – Através de transformações químicas modifica-se o produto natural
· Sintéticos – Obtido por polimerização e é análogo às resinasnaturais
· Solúveis em água 
Tipos de meio de montagem
· Mais utilizados são à base de glicerina
· São os meios hidrossolúveis utilizados na imunofluorescência
· Não é necessário utilizar lâminas desidratadas e clarificadas
Índice de Refração
· Razão entre a velocidade da luz no vazio (mesma para todas as radiações) à medida que atravessa dois meios (vidro neste caso) – homogéneo por causa das várias lentes 
Índice de Meios de Montagem naturais
· Glicerina = 1,470
· Bálsamo do Canadá = 1,510
· Azeite de Cedro = 1,530
· Verifica-se ligeira alteração da tonalidade da cor dos núcleos logo não serve para arquivo pelo que caíram em desuso exceto para os casos de imunofluorescência
Meios de Montagem sintéticos
· DPX = 1,600
· Entellan = 1,650
· Clearmount = 1,515
· Lâminas de arquivo continuam bem coradas ao longo do tempo ao contrário das naturais
Critérios dos meios de montagem
· Índice de refração (mais próximo possível/ similar/ igual do vidro)
· Miscível no Xilol (estes meios de montagem para ter o índice necessário pelo que só se consegue isso quando solúveis em xilol/ fica turvo com a água por ser um hidrocarboneto aromático)
· Quimicamente estável (para não alteração da cor)
· Transparente e incolor (para manter índice)
· Inalterável com o tempo 
· Homogéneo
· Endurecer sem retrair o tecido
· Endurecer sem ganhar bolhas
· Não alterar cores da coloração
· Endurecer rapidamente (endurecer sem alterar o tecido)
· Líquido para permitir expulsão de bolhas
Funções dos meios de montagem
· Preserva/ conserva o material
· Facilita a visualização
· Facilita o arquivo
· Facilita o transporte
Técnicas de montagem
· Tipos de montagem:
- Manual: pouco comum nos laboratórios
- Automático: único, líquido para com o colorador
Manual
1- Desidratação: 
· Substituição da água da lâmina por etanol
· Lâminas em concentração crescente de álcool
· 95º-100º-100º
· Desidratação com meio de montagem hidrossolúvel
2- Diafanização
· Substituição do álcool da lâmina por xilol
· Lâminas em xilol durante 5 minutos
· Xilo é miscível com o etanol e meio de montagem
· Xilol é o meio intermédio mais utilizado
3- Aplicação do meio de montagem
· Colocar uma gota do meio de montagem sobre a amostra com uma vareta de vidro/ pipeta
4- Aplicação da lamela
· Espessura reduzida
· Índice de refração apropriado
· Superfície plana
· Formato adequado com o tamanho de corte
· Angulo de 45º entre lamela e lâmina
· Diminuir gradualmente o angulo até sobreposição
· Retirar o excesso de meio de montagem
5- Rotulação
Automático
· Tampas estão ali para impedir que os reagentes sequem
· Se utilizarmos corantes aquosos a lâmina tem de ser hidratada
· Cora -> monta
· Simula uma montagem parecida à que realizamos manualmente com o auxílio de uma pinça, conta-gotas e borrachas (agarra na lamela)
· Inconveniente – após a coloração no automático com a troca para a montagem automática o colaborador tem de mexer no cesto das lâminas
· Para combater o acima é possível montar uma unidade intermédia entre os dois equipamentos que serve ponte entre eles 
· Permite a montagem de lâminas de qualquer coloração (normalmente as de rotina)
Exames extemporâneos
História
· 1905 – Louis B. Wilson percebeu a necessidade de existir uma técnica para avaliação de tecidos aquando da sua retirada em operação. Para além do atrás descrito também percebeu que eram necessárias novas técnicas de coloração assim como de corte 
· 1959 – Lauren Vedder Ackerman declarava que a técnica de congelação era um aliado fundamental para a decisão terapêutica 
Definição
· Avaliação anátomo-patológica realizada durante cirurgia que consiste em fornecer um diagnóstico sobre determinada lesão neoplásica no decorrer do tempo intraoperatório.
· Com este diagnóstico o cirurgião vai poder alterar o procedimento da cirurgia a nível de tratamento, área de resseção e adequar a quantidade de material a retirar para posterior análise biopatológica
· Estes tipos de exames foram desenvolvidos ao ponto de poder ser realizado durante a cirurgia para tomar uma decisão mais concreta quanto à cirurgia - a conservação ou radical depende muito desta análise
· Realizar um método que permita em tempo útil conseguir a informação de como o cirurgião deve terminar a cirurgia o que vai poupar muito tempo
· Objetivos:
- Realizar diagnóstico intraoperatória
- Perceber o estadiamento do tumor
- Avaliar os limites cirúrgicos
Vantagens em realizar este exame:
· Diminuição da necessidade de uma segunda anestesia
· Redução do tempo de internamento do doente
· Doente é imediatamente notificado após acordar do que aconteceu durante a cirurgia e por isso fica reduzida a ansiedade quanto a certas dúvidas existentes
· com a redução do tempo de ‘’14h para 30 min’’, economizar custos, ajuda o cliente, é possível dar informação relevante ao cirurgião
· resolve-se numa única cirurgia, economia de custos, menos anestesia, reduz-se o tempo de internamento, não é necessária uma segunda cirurgia, níveis de ansiedade do doente são menos porque doente já tem informação do diagnóstico
* Se diagnóstico positivo o cirurgião pode logo proceder à reconstituição da área o que poupa tempo, reduz custos e ajuda o cliente
· um exame extemporâneo só é marcado quando o cirurgião não tem a certeza do que vai encontrar daí ser necessário realizar este tipo de exame; os mcdt's falharam a analisar
· amostra biológica passa por todas as etapas em 20 min (utilização do crióstato)
· permite cortes fines na ordem das 5 micras
· permite perceber a extensão das margens cirúrgicas e permite perceber se o tumor saiu todo ou não
· apenas se utiliza a coloração de HE
· corte por congelação sem passar pelo processamento de tecidos
Cadeia de pressão
· Cirurgião – porque paciente não pode estar muito tempo sobre anestesia 
· Anestesista – porque tem de manter a anestesia o tempo que for preciso sem prejudicar o paciente
· Patologista – porque tem de dar diagnósticos rápidos e precisos
· Técnico – quanto aos passos da técnica 
Técnicas
· Corte por congelação – peça cirúrgica quando removida sofre de imediato uma rápida congelação (por jato de CO2, A ou pela utilização de criostato) o que vai reduzir muito o tempo de fixação em comparação com outra técnicas
· Colocação num micrótomo que permite cortes finos transversais
· Tecido é congelado a -20ºC o que permite a não utilização de formol para fixação da peça
· Punção aspirativa por agulha fina – retirada de líquido/ colostro para análise de células isoladas
· Com esta técnica a imagem mantêm-se o mais perto da realidade por algum tempo
Exame extemporâneo para:
Diagnóstico
· Nos dias de hoje, por causa dos mcdt’s, é raro utilizar este tipo de técnica para o diagnóstico
· A maior parte das patologias/ lesões profundas em que é necessário utilizar esta técnica são patologias muito raras (por exemplo um nódulo do pulmão numa localização de difícil acesso para biópsia) em que não existe diagnóstico
· Mais comum em que se utiliza este exame são patologias da mama
Neoplasias da mama
· Situação mais frequente
· A mama é um órgão superficial pelo que se realizam vários tipos de exames só que, nalguns casos, durante a cirurgia o médico depara-se com situações anómalas e por isso precisa de recorrer a este tipo de exame
· O que faz um patologista nestes casos – O patologista para este tipo de situações (neoplasia maligna da mama) deve estar sempre na sala ou perto dela
· Avaliação de margens e limites cirúrgicos: 
- faz-se a medição dos limites cirúrgicos (a Tumorectomia mamária, que é a remoção do tumor com tecido normal, tem o aspeto de uma esfera porque a mama tem 6 margens
- O objetivo é que no final da excisão mamária se identifique a menor distância entre o limite da neoplasia e o limite da excisão seja superior a 1 cm
Cirurgia Mamária oncológica
· Remover o máximo possível de tumor 
· Diagnosticar se a doença se disseminou para os gânglios
· Reconstrução da forma da mama após cirurgia de remoção de neoplasia
· Avaliação de sintomas do cancro avançado
- Cirurgia Conservadora da mama
· Também pode ser designada de: Tumorectomia,Quadrantectomia, mastectomia parcial ou mastectomia segmentar
· A quantidade de mama retirada depende do tamanho e localização do tumor
· Objetivo: retirar o segmento em que se encontra o tumor com tecido normal adjacente
· O que se analisa – margens, localização da lesão e ter atenção à ordem em cado de mapeamento
· Sem retalho de pele – 06 margens
· Com retalho de pele – 05 margens
*As suturas podem destruir o parênquima tumoral
*Caso seja necessário mapear para parafinar o técnico tem de ter atenção ao método de armazenamento
- Mastectomia
· Excisão da mama na sua totalidade e por vezes, em conjunto, com alguns tecidos adjacentes
· Existe diferentes mastectomias (às vezes é solicitado a excisão das duas e assim chama-se mastectomia dupla)
- Lesões Infra Clínicas
· Nos dias de hoje a grande da patologia maligna mamária é diagnosticada através de rastreios e identificação de alterações radiográficas
· As alterações mamárias mais frequentes são alterações do parênquima mamário e a presença de microcalcificações (estas alterações condicionam uma série de procedimentos como biópsia e cirurgia)
· Lesões muito pequenas que são designadas de lesões infra clínicas uma vez que o doente está assintomático e as lesões não são possíveis de identificar por exame objetivo
Exame extemporâneo do Gânglio linfático sentinela
· Procedimento recente devido a estudos recentes que demonstram as vantagens de uma cirurgia com abordagem altamente conservativa
· Graças a este procedimento existe a possibilidade de realizar durante a mesma operação a reconstrução mamária (o que ajuda em termos psicológicos e estéticos)
· Gânglio sentinela- tentar perceber se efetivamente já foi invadido/ migrou para o primeiro gânglio e retirá-lo para perceber se estamos perante uma metástase
· Biópsia do gânglio sentinela - Remoção de alguns gânglios que contenham as células cancerígenas o que auxilia e reduz os efeitos colaterais da cirurgia 
· Gânglio linfático sentinela: 
- Aplicação de uma ‘tinta azul’, ou outros corantes, que auxilia na identificação dos gânglios linfáticos invadidos (podem ser axilares ou cadeia mamária interna.
- Excisão dos gânglios corados e analisados microscopicamente após a operação sendo que é melhor realizar o exame durante a operação porque senão mais tarde o doente teria de retirar esse gânglios (e esse gânglios podem ter metástases)
- Por vezes o gânglio pode apenas ter patologia microscópica e não se identifica macroscopicamente
Perante esta situação faz-se ou não um exame deste tipo?
· Cada instituição tem os seus próprios critérios, mas, caso o cirurgião ao analisar o gânglio achar que está alterado de alguma forma (mais duro, palpa um nódulo, etc) é necessário a presença do patologista para realizar a análise
· Ou se processa o gânglio na sua totalidade com um exame extemporâneo (demora entre 1h a 1h30) ou se realiza um protocolo de vários níveis que vai aumentar a probabilidade de se encontrar uma metástase
· Regra geral o cirurgião não toca nas peças para além de as retirar e colocar na mesa para análise posterior
Tireoide
· Para analisar este órgão muitas vezes não é necessário realizar a excisão e apenas basta o líquido folicular
· De maneira a evitar complicações futuras com a excisão total da tiroide (como hipoparatiroidismo ou lesão do nervo laríngeo) e a um uso permanente de fármacos para substituir as hormonas da tiroide e paratiroide (levotiroxina) caso o espécime retirado acuso malignidade no exame histopatológico e parafina utiliza-se este método
· Benigno vs. Maligno
· Calcificações
Margens 
Pulmão
· Com margens comprometidas existe um aumento da lobectomia em termos de área
· Também se pode analisar os linfonodos para estadiamento (maioria vai para parafina)
Fígado
· Margens comprometidas aumentam a área de segmentectomia
· Algumas cirurgias podem alterar o seu curso
Cirurgia Pancreática
· Margem principal de avaliação é a do colédoco
O paciente
· O tempo de anestesia é prejudicial para o paciente e por isso é importante reduzir ao máximo o tempo de exposição
Manter a calma
· É uma técnica difícil de utilizar e por isso é preciso redobrar a atenção
· Os fragmentos que se utiliza são únicos e importantes para o decorrer da cirurgia
· Não esquecer de estar atento às condições (faca, temperatura, orientação do corte, inclinação da faca, congelamento adequado, etc)
· Apesar de o fragmento estar ‘congelado’ este nunca é tão duro como quando se utiliza o processamento de tecidos
· Seguir à risca os tempos necessários de congelamento e de coloração
· Fragmento a fresco são potenciais riscos para a saúde (podem ter patogénicos, vírus, and so on)
· PowerPoint prof: estratégia, visão, cuidados, entender o tempo de cada passo (mesmo que o ambiente não facilita), biossegurança.
Fatores que favorecem a acurácia do exame anatomopatológico intraoperatório
· Comunicação entre o técnico e patologista
· Sala de congelação dentro do centro cirúrgico (próximo da cirurgia)
· Uso coordenado dos 3 métodos de avaliação (avaliação macroscópica, esfregaços citológicos e cortes de tecido congelado)
· Estrutura técnica 
*é necessário ter atenção que a gordura vai dificultar a congelação do fragmento
*a presença de microcalcificações pode provocar danos no gume da faca o que não vai possibilitar um bom diagnóstico 
O PLUS que o técnico oferece
· Cuidados para a fixação total do material (benéfico para exames complementares)
· Separar áreas de interesse já observadas
· Anotações da peça a ‘fresco’ impedindo o viés após fixação
Avaliação de margens e limites cirúrgicos intraoperatórios
· Os limites cirúrgicos variam conforme a localização anatómica do local em que a lesão se encontra
· Em certas localizações não é possível obter os limites ideais (de 1,5 e 2 cm) sendo que provavelmente o paciente passa a ter de realizar radioterapia
· Locais com anatomia complexa – região da cabeça e pescoço, cavidade oral, laringe, etc
· É importante avaliar as margens com extremo cuidado e por isso é necessário o patologista estar presente neste tipo de exames
Exame extemporâneo para estadiamento
Neoplasias epiteliais do ovário
· As neoplasias podem ser benignas, Borderline ou malignas (duas últimas estadiamento obrigatório)
· Importante distinguir o tipo histológico de neoplasia do ovário porque todos os estadiamento são diferentes
· No estadiamento peritoneal realiza-se uma biópsia da cavidade peritoneal para perceber se existe infiltrações e remover o epiplon por razões associadas à radioterapia
· Caso as neoplasias são mucinosas vai ser necessário retirar o apêndice porque existe o risco que estas neoplasias mucinosa do ovário se desenvolve num pseudomixome peritoneal 
· pseudomixome peritoneal 
Adenocarcinoma do útero
· O estadiamento (critério de T0 para T4 – tumor limitado a nível médio ou se invade menos de metade da espessura do miométrio) é constituído por duas categorias especificas
· Classificação é realizada na operação em que o útero é seccionado e se avalia se à infiltração ou não da metade externa ou se só a metade interna foi comprometida
· Com a invasão da metade externa existe indicações para realizar o estadiamento com a remoção de gânglios inguinais e pélvicos
· Esta avaliação é importante porque pode mudar a cirurgia o que poderá ter um impacto importante no prognóstico da doença (com a avaliação da profundidade da invasão do miométrio pela neoplasia caso haja invasão da metade externa o prognóstico é diferente) 
Metástase cervical-primária oculto
· Caso exista metástase cervical-primário oculto, durante a cirurgia pede-se um extemporâneo do gânglio linfático com o intuito de descobrir qual o tipo de tumor e porque pode também dar indicações de onde se deve procurar o tumor primário (e se possível retirá-lo)
· Essa indicação vai levar à excisão do tumor +rimário no mesmo tempo operatório
Neoplasia da linha média
· Diagnóstico de neoplasia maligna indiferenciada
· Neoplasia maligna – que apesar de apresentar morfologia diferente do normal com várias células em mitose do que as que não estavam, mas era indiferenciadoporque nãos e percebe se epitelial, mesenquimatoso ou linfoide
· Neste caso – ou se aplica um tratamento extensivo ou então pede-se uma biópsia com exame extemporâneo
· O exame Extemporâneo – neste cado específico o exame tem objetivo apenas em congelar tecido em boas condições de maneira a ser analisado por microscopia eletrónica e citogenética convencional
· Verificou-se que – alteração genética devido a uma translocação dos cromossomas 15 e 19 (que indica ser uma carcinoma da linha média que normalmente aparece em doentes novos); normalmente é de evolução rápida e fatal e os doentes acabam por falecer em pouco tempo
Contraindicações e limitações
· Não se realiza se não alterar o tratamento do doente
· Problemas de amostragem (tamanho da amostra porque se o mesmo for inferior a 5 mm e não houver possibilidade de biópsia a análise deve ser feita no dia a seguir, com exceção dos tecidos calcificados porque a imagiologia identifica-os)
· Erros no manuseamento da amostra e equipamento inadequado
· Falhas na comunicação da informação e problemas na interpretação dos relatórios de anatomia patológica
· Disponibilidade de uma sala de exame extemporâneo no bloco operatório
Conclusões a retirar
· Requer um nível critico alto
· Auxilia de forma imensurável o patologista que tem oportunidades únicas de aprendizagem
· Ajuda a mudar vidas (questão de o diagnóstico demorar muito tempo)
Controlo de Qualidade
· É transversal a toda a componente técnica laboratorial
· Quanto à coloração
· Problemas que podem ocorrer a colorações que podem não permitir de um diagnóstico e um preço mais baixo possível
· Temos preocupações financeiras – para estabilidade laboratorial
· Reagentes com um grau de pureza muito elevado
· Na desidratação não conta
· Diafanização têm um grau de pureza superior a outras
· Parafina – tem vários constituintes
· Os reagentes e corantes têm substâncias que podem prejudicar os tecidos se não forem puros porque pode fazer reações cruzados (levam a depósitos de outros constituintes/ pode camuflar o que impede um diagnostico fidedigno)
· Diagnostico tem de ser rápido porque faz diferença nos tratamentos – certas neoplasias são devido a mutações que implicam uma terapêutica diferente e que tem de ser o mais rápido possível (Metastização rápido)
· Técnicas a preço de custo o mais rápido possível e obviamente fidedigno e correto porque pode inviabilizar o tratamento
· Para além disto serve também para alterar terapêuticas caras que já não servem
· Para além disto é preciso técnicas complementares por exemplo com anticorpos
· Diagnostico tem de ser correto – de maneira a dar a terapêutica mais rápido possível
· Na requisição convém que através de mcdt’s o médico indicar qual a patologia de que está a desconfiar de maneira a acelerar o processo
· Caso na Macroscopia algo foi colhido erradamente vai complicar a vida ao patologista assim como prejudicar o cliente (nova cirurgia ou terapêutica desnecessárias)
· Boa gestão dos reagentes (processadores de tecidos), corantes (deixam de estar tão puros), qualidade de técnicos de Microtomia, - qualidade do diagnostico 
· Cada tumor tem uma classificação (dimensões do tumor, agressividade, etc)
· Para alem do diagnostico é necessário juntar imagens exemplificativas do tumor para que possam ser transferidos para centros de referência 
· É importante ter uma boa plataforma digital de maneira a conseguir fazer chegar a informação
· Manual de boas práticas (procedimentos internos) para garantir a qualidade dos resultados e evitar erros 
· É necessário fazer auditorias internas (elaboração de manuais de boas práticas para que as regras nos garantam que não tenhamos problemas) e externas
· Regras – percetíveis, não tem problemas do diagnostico, 
· Fator de erro
Criotomia
Métodos de Congelação:
· Exames extemporâneos
· Técnicas de histoquímica
· Técnicas de Imunohistoquímica
· Técnicas de biologia molecular
· Técnicas de neuropatologia
· Avaliação da qualidade de amostras
· Banco de tecidos e tumores
· Outras técnicas
A técnica de congelação ideal deve permitir uma congelação o mais rápida possível e com o mínimo de artefactos
Artefactos – cristais de gelo que se formam com a congelação. O problema destes artefactos é que quando descongelam fazem ‘buracos’ nos tecidos. O aparecimento destes é um processo normal pelo que é necessário ter atenção à quantidade que é criada. 
Técnicas que aceleram a congelação do tecido:
· Nitrogénio líquido:
- Com a aplicação desta substância existe a formação de bolhas de vapor à volta do tecido que vai impedir a congelação rápida e uniforme do tecido o que pode criar artefactos
· Isopentano arrefecido com nitrogénio líquido:
- Método de eleição
- O molde é submerso nesta substância 
- Com a alta condutividade térmica é possível utilizar temperaturas muito baixas (cerca de -190º)
· Gelo Seco (CO2 no estado sólido):
- Um bloco é encostado ao suporte do bloco o que vai baixar a temperatura e provoca a congelação do fragmento
· Gás de CO2 (estado gasoso):
- Mais utilizado no crióstato
- Funciona através da ligação de um tubo à zona do porta blocos o que provoca a congelação do fragmento
· Spray de gelo:
- São prontos a usar 
- São mais indicados para a congelação de fragmentos pequenos
- Para além de acelerar o processo de congelação também mantém o tecido homogéneo a nível da temperatura
· Placa de congelação rápida do criostato:
- Certos criostatos têm um Peltier (placa de congelação rápida). Este sistema permite uma congelação direta do fragmento
- Muito usado em exames extemporâneos
Temperatura
· O congelamento do tecido depende da arquitetura tecidular assim como a quantidade de água presente em cada tecido, e com o facto que cada tecido tem a sua própria temperatura ideal
· Facto crucial: para podermos cortar o tecido vai ser necessário utilizar temperaturas baixas 
· Tecidos a fresco têm uma temperatura média de: -15º a -23º
· Tecidos que se encontrem já fixados devem ser seccionados a temperaturas mais baixas
· As temperaturas ajustam-se/ adaptam-se de acordo com o tecido
Meio de Montagem – Gel
· De eleição:
- Solúvel em água
- Ser possível remover durante o processo de coloração
- Possível remoção caso a amostra tenha de ser enviada para processamento de rotina
*Antes de se cortar/ seccionar faz uma primeira avaliação macroscópica
*Após seccionar é possível passar de imediato para a água sem ser necessário desparafinar e faz-se logo a HE 
Corte em Criostato:
· O mais usual é ter um micrótomo de Minot no seu interior
· Este tipo de equipamento é constituído por:
- Uma câmara fria
- Micrótomo incorporado 
- Pode ser de chão ou portátil
· Permite realizar cortes de material histológico congelado
· Placa de congelação - zona que consiste em organizar e congelar fragmentos.
· Peltier – zona que atinge temperaturas mais baixas mais rapidamente o que faz com que o fragmento congele mais rápido
· Suportes – Pequenas peças de metal (tem um padrão mais elevado no fundo) e tem como função ‘agarrar’ o fragmento o que permite estabilizar no porta blocos
· Micrótomo – Permite ajustar a espessura de corte (estes ajustes são feitos normalmente num painel digital fora da câmara fria), orientar o bloco, orientar a faca, entre outros. Dentro do mecanismo é onde se faz o ajuste no bloco/ faca
· Placa anti-rol – Placa de vidro ou acrílico que está encostada à zona de corte (estabelece um espeço entre ela e o suporte da faca, onde o corte se deposita sem enrolar)
Técnica
· Receção e registo do material
· Macroscopia (seleção do material a cortar)
· Colocar o meio de montagem num molde
· Colocar em cima do meio de montagem (fazer orientação caso seja necessário)
· ‘Preencher’ o molde com o meio de montagem (apenas o suficiente para criar uma zona de suporte para cortar o tecido)
· Colocar o molde na placa fria do criostato
· Aguardar até congelamento
· Colocar o molde no porta blocos
· Inserir a lâmina no porta lâminas (necessário refrigeração prévia)
· Desbastar e cortar (6 micras +/-)
· Apanhar o corte apenas por contacto direto com a lâmina quese encontra a temperatura ambiente 
· Corar
· Montar
Corte
Micrótomo de Congelação
· Semelhante a um micrótomo convencional, mas não tem a câmara fria
· Com um tubo o suporte de bloco é refrigerado através da passagem de uma substância refrigeradora (gás CO2)
· A técnica de corte neste equipamento é semelhante ao convencional
Criostato
· Vantagens:
- Permite uma avaliação rápida o que possibilita um diagnóstico mais rápido
- Permite a realização sem ser necessário o uso de parafina
· Desvantagens:
- Morfologia em pior estado 
* O gelo atrasa o processo de autólise, mas vão existir alterações a nível enzimático, mas dependendo da temperatura utilizada é possível impedir que isso aconteça
- Artefactos relacionados com a congelação
· Artefactos:
- Cristais de gelo
- Provocados pela faca (semelhante ao convencional)
- Temperaturas demasiado baixas
· Controlo de qualidade:
- Apenas se deve cortar um fragmento/ bloco
- Não realizar vários exames ao mesmo tempo (atenção ao tempo em que se realiza a técnica)
- Identificar todas as lâminas para evitar trocas
- Evitar possíveis contaminações com limpeza frequente do aparelho (limpar, descongelar e desinfetar)
Criotomia
 
Coloração
· Após corte é necessário verificar microscopicamente as margens da lesão pelo que é necessário evidenciar as estruturas do tecido através do processo de coloração (rotina aplica-se normalmente a HE)
· Normalmente técnica efetuada manualmente
· Não é necessário desparafinar e hidratar
· Tempos de corantes mais curtos
· Os tecidos com esta técnica têm mais tendência a descolar da lâmina 
· Os meios de montagem mais utilizados são os sintéticos uma vez que os aquosos (solúveis em água) após guardados têm tendência a perder o azul dos núcleos
· Utiliza-se água amoniacal porque esta funciona como uma acelerador para azular os cortes
Exame extemporâneo:
Macroscópico
· Fragmentos enviados à anatomia patológica sofrem apenas uma análise macroscópica
· Quando macroscopicamente visível que não se trata de neoplasia (alguns hamartomas do pulmão)
· Para avaliar as margens (verificar a distância do tumor às diferentes margens cirúrgicas) e assim determinar se existe necessidade de retirar uma maior quantidade de tecido normal
Microscópico
· Quando os enviados para a anatomia patológica o fragmento vai ser submetido a técnicas de congelação e subsequente cortes pata análise microscópica
· Vai permitir fazer um diagnóstico provisório (positivo vs negativo)
· Permite avaliar microscopicamente as margens 
· Desvantagem:
- Modificação da morfologia do tecido
- Menor detalhe celular
- Coloração é inferior
· Vantagem: Diagnóstico preliminar rápido
Gânglio Sentinela
· Definição – primeiro gânglio para onde é mais provável o tumor metastizar
· Fator mais importante em relação ao prognóstico do cancro e está diretamente relacionado com a taxa de sobrevida
· Esta técnica foi desenvolvida para ser possível melhor avaliação do estadiamento do tumor o que por sua vez diminui a morbilidade associada ao esvaziamento ganglionar
· Enviado para o laboratório para pesquisa de metástases (se Gânglio positivo é necessário esvaziamento ganglionar)
· Não existe uma técnica precisa para pesquisa do gânglio ganglionar pelo que cada laboratório usa a técnica que prefere:
- Cortes de congelação – gânglio seccionado e são efetuados cortes de congelação para uso de técnica HE (tem como desvantagem a utilização do gânglio todo pelo que não é possível realizar outros métodos)
- Cortes de congelação e técnica Imunohistoquímica – Igual ao acima, mas para além de colorir com HE também se realiza uma técnica de Imunohistoquímica (marcação com citoqueratina como AE1/AE3 ou cK19)
Alta taxa de correspondência com a técnica de parafina
Método mais demorado e pode implicar vários cortes de congelação
Com o desbaste do gânglio existe perda de material (pode ter uma metástase nessa zona)
Pode no fim não existir tecido suficiente para análise de parafina
- Citologia (imprint ou esfregaço)
Imprint – Após seccionado o gânglio vai ser pressionado numa lâmina o que acaba por transferir as células para a mesma (mais rápido e barato)
Esfregaço – Raspa-se a superfície do gânglio e faz-se um esfregaço com o material retirado
Técnicas rápidas e de baixo custo
Amostragem mais pequena
Sensibilidade mais baixa
Não permitem distinguir entre micrometástase e macrometástase
- OSNA (One Step Acid Amplification)
> Aparelho que realiza a leitura do gânglio sentinela através da análise de RNAm o que possibilita determinar o grau de expressão do gene que codifica a proteína ck19
> Homogeneização do gânglio pelo que não sobra material para técnica de histológica 
Realiza uma análise quantitativa através do estudo do RNAm (relatório) e faculta a informação da presença de micrometástase assim como avalia se é característica de carcinoma
Maior amostragem porque utiliza o gânglio na sua totalidade
Não há material para ser processado pela histologia
Não é possível corresponder com a técnica de parafina
Não é possível reverter o processo
Técnica mais dispendiosa
Cirurgia Micrográfica de Mohs
· Criada na década de 30 por Frederic Mohs
· Técnica utilizada para remover tumores de pele que se caracteriza por a cirurgia ser controlada por exame microscópico (lesão retirada>análise de margens com a técnica de congelação)
· Visa criar o menor impacto possível de alterações da fisiologia do doente
· A lesão retira-se por fase até que o tumor residual deixe de existir (em todas as fases as margens são analisadas)
· Margens – analisadas para perceber se se retira mais ou não
· Indicações principais:
- Tumor recidivo (reaparece após cura)
- Utilizado quando não existe possibilidade de manter uma margem de segurança das estruturas anatómicas (Ex: próximo da borda da asa nasal)
- Difícil delimitação dos bordos tumorais
- Certos tumores como por exemplo carcinoma basocelular infiltrativo
Banco de tecidos e tumores
· ‘’é um repositório organizado de amostras de tumores (neoplasias), podendo compreender tecidos não-neoplásicos. As amostras arquivadas no BT podem ser constituídas por fragmentos, células e/ou líquidos ou seus derivados (DNA, RNA, proteínas), independentemente do tipo de preservação das amostras biológicas (fixação, inclusão em parafina, congelação).’’ – DGS
· O objetivo é constituir e manter uma coleção de amostras tumorais e de tecidos normais para que possam ser utilizados em investigação biomédica. Deve conter: 
- Tumores mais frequentes
- Tumores mais raros
- Coleção de tumor de maior interesse para utilizadores/ colaboradores
Congelação de tecido muscular – Neuropatologia
· Biópsias musculares é apenas um dos tipos de material em que especializa este laboratório uma vez que o mesmo também faz estudos acerca do SNC, o periférico e neuromuscular pelo que as equipas deste departamento são altamente especializadas neste tipo de patologias
· Esta análise visa evidencia a arquitetura do músculo esquelético pelo que assim vai ser possível estudar a evolução e perceber das desordens neuromusculares:
- Inflamatórias (miosite)
- Metabólicas (glicogenoses, lipidoses)
- Distrofias musculares
- Miopatias tóxicas
- Neurogénicas
* Para este tipo de patologias é necessário realizar esta técnica com o tecido congelado pelo que é mais utilizada a técnica de congelação.
· Vantagens:
- Melhor visualização da estrutura do musculo e da patologia
- Permite uma resposta mais rápida
- Permite realizar técnicas de histoquímica convencional e enzimática (miosina ATPase, NADH-TR, COX, Fosfatase alcalina e ácida, Gomori modificado, PAS- preciso ter atenção-, Oil-Red)
· Preservação – congelamento o mais rápido possível pelo que existe menos artefactos de cristais de gelo (Isopentano arrefecido por nitrogénio líquido)
· Técnica:
1- Biópsia recebida a fresco
2- Seccionar a biópsia e de seguida libertar o Clamp
3- Incluir a biópsia de pé (usar lamela como auxílio)
4- Arrefecer o Isopentano líquido em nitrogénio líquido (até formar precipitado branco nas paredes que indica que a substância atingiu -150ºC)
5- Submergir o fragmento6- Colocação no criostato e remover a lamela
7- Embrulhar em alumínio e armazenar a -80ºC
8- Fazer cortes de congelação quando necessário
9- Armazenar novamente no frio
Registo e Rastreamento de Amostras Biológicas
Identificação e Informação
· Para que serve a identificação das amostras bem como a informação anexa a estas? 
Serve para dar uma resposta mais célere e um diagnóstico preciso. A requisição deve conter o máximo de informação possível acerca do doente (situação atual do doente auxilia o patologista a perceber quais as alterações que podem constar no tecido de acordo com a patologia que o doente tem, tanto a nível macroscópico como microscópico).
Informações que devem estar presentes na requisição:
· Identificação do utente (nome, idade, morada, etc)
· Quem solicitou o exame, entidade e médico, de forma legível
· Natureza da amostra (que peça é e de onde vem)
· Tipo de exame pretendido (exames moleculares, coloração especifica, etc)
· Informações clínicas relevantes relacionadas com a situação atual
· Doenças prévias
· Cédula do médico
- É fundamental que o laboratório tenho um livro de procedimentos de como proceder.
Transporte:
· O acondicionamento das amostras biológicas é fulcral
Sacos de transporte
· Maior segurança
· Maior resistência
· Informações atualizadas do IMP Diagnostics
Amostras inadequadas
· Não identificadas
· Informação discrepante entre amostra e requisição
· Sem requisição
· Sem pagamento
· Sem informação relevante na requisição (nome da pessoa, and so on)
Ideal saber em que fase é que se encontra a amostra
· Se já está pronto
· Se ainda está a ser analisada
· Se ainda está na coloração
· Etc
· Importante ter forma de poder rastrear as biópsias e dar essa informação a quem tem direito
Arquivo de blocos e lâmina
· Material que não é perecível devido aos processos
· O armazenamento é importante porque
- Permite consultar novamente as lâminas (outro patologista/ ensino)
- Revisão das lâminas
- Comparação com nova amostra
- Envio para outro laboratório
- Envio de blocos para realizar mais exames
- Entrega dos blocos ao utente
· Laboratório – arquivo transitório onde estão casos mais recentes 
· Blocoteca – armazenamento de blocos mais antigos que normalmente é uma sala separada
Critérios
· Organização – má identificação dificulta tudo
· Existência de ficheiro informático associado ao arquivo onde deve constar
- Material em movimento
- O que é recebido
- Pessoa responsável pelo processo de entrada/ saída de material
· Inspecionar a passagem de recente para definitivo de maneira a detetarem-se erros e para se verificar o estado de blocos em falta 
· Blocos de parafina – 10 anos de armazenamento (mínimo)
· Laminas histológicas – 10 anos para casos de oncologia e 5 anos noutras situações
Condições
· Bem identificadas 
· Armazenadas corretamente
· Muitas destas laminas são únicas (citologia, extemporâneos, material de bloco)
DreamPath
· Sistema de arquivo digital de laminas (sistema crystal) e blocos (sistema fina) e fornece aos laboratórios uma maneira simples de arquivo
· Minimiza erros, aumenta a produtividade, manter o foco dos recursos de laboratório noutras coisas mais importantes, ou seja, resultados positivos para os pacientes
Organização do Laboratório
Áreas de um laboratório
· Secretaria 
· Laboratório
- Citologia
- Histologia
- Imunohistoquímica/ histoquímica
- Biologia molecular
- Microscopia eletrónica
· Arquivo de bloco e lâminas
· Área gabinetes médicos
· Sala de reuniões
· Morgue/ sala de autópsias
Histologia
· Sala de receção 
- Confirmação do material enviado com requisição
- Registo e identificação das amostras com número interno
- Distribuição de trabalho (quem vai fazer o quê; por exemplo: qual o melhor patologista para aquela biópsia)
- Deve estar próxima da etapa seguinte (devido ao fato de estarmos a mexer em amostras fiadas em formol)
· Sala de macroscopia (colheita de fragmento e descrição)
- Fisicamente separada da sala de receção (vapores do formol)
- Macroscopia (peças e biópsias)
- Exame extemporâneo (ou no bloco operatório que é o mais indicado)
- Associada ao processamento do material
· Área de inclusão e corte
- inclusão e distribuição de trabalho na microtomia 
- Espaço de corte – onde está o material da microtomia (micrótomo, banhos-maria, placas frias, etc)
- Arquivo temporário dos blocos recentes (devido à possibilidade de necessidade de mais cortes pelo patologista)
· Coloração e entrega de laminas (controlo de qualidade)
- Aparelho de coloração automático
- Hote para montagem manual e auxílio da coloração (caso seja manual e assim extrai os vapores)
- Distribuição e organização das lâminas para posterior entrega
- MO para controlo de qualidade (existência de pregas, coloração ótima, existência de colorações diferentes)
- Computador para tarefas burocráticas (indicação de lâminas, assim como protocolos)
WorkFlow
· Objetivo - Manter a organização e a não condicionar o funcionamento do workflow
Lean Workflow
· Sistema de organização de uma empresa que pretende:
- Melhoria de tempos de procedimento
- Pessoas certas para funções certas (capacidade de cada colaborador)
- Tecnologia que permite melhores resultados mais rápidos
Gestão de um laboratório
· Gestão de pessoal
- Técnico
- Auxiliar
- Gestão das escalas de serviço e organização do trabalho (diária, semanal, mensal)
- Gestão de conflitos (relação entre colegas dos mesmo laboratório)
- Gestão de interesses 
· Gestão de Stock
- Material recebido 
- Material gasto (garantir sempre um stock mínimo)
· Gestão burocrática
- Aparelhos (manutenção e em caso de avaria reparação rápida)
- Qualidade
- Todo o funcionamento (para obtenção de resultados satisfatórios)
Desafios da gestão
· Objetivo principal – Melhor serviço prestado no menor tempo possível
- Tempos baixos de resposta (TAT – turnaround time)
- Qualidade de resultados
- Qualidade de métodos
- Qualidade em termos de segurança individual e coletiva
Acreditação
· Objetivo – medir a qualidade do serviço prestado e garantia da qualidade dos serviços prestados
· Processo voluntário
· Realizado – entidades independentes que especialização nas normas aplicadas a determinado setor
· Exemplos de entidades:
- IPAC
- CHKS
- JCI
- SGS
· Manuel de procedimento – todos os procedimentos utilizados no hospital/ clínica que integram um respetivo serviço; importante quando com estagiários pois é de melhor compreensão de técnicas e procedimentos
- Explicação passo a passo de procedimentos
- Comtempla todas a áreas
- Apoia o trabalhador
- Integração de pessoal novo quanto aos procedimentos do lab
ISO 9001 
· Oito princípios:
- Foco no cliente
- Liderança
- Envolvimento de pessoas
- Abordagem de processos
- Contexto organizacional
- Melhoria contínua
- Tomada de decisão baseadas em factos
- Raciocínio baseado na gestão de riscos
Objetivo – para garantir qualidade das políticas existem estes oito sistemas 
- Auditoria – avaliação que é feita a uma certa empresa para verificar se a mesma está a cumprir os objetivos a que se propôs quando começou a trabalhar e se os métodos que estão a aplicar vão de encontro a esses objetivos
- Externa – avaliação é efetuada por uma empresa externa à empresa que vai ter acesso a todos os documentos e procedimentos; vai também determinar a certificação 
- Interna – avaliação realizada pela própria entidade ou até elo próprio serviço para verificar se está tudo a trabalhar conforme as regras estabelecidas 
- Produto final – emissão de um relatório que vai identificar problemas e/ ou oportunidades de melhoria
Contaminação
· Contaminante – agente introduzido num meio em que não é suposto estar
· Em histologia -um contaminante é uma substância externa que não pertence ao tecido/ fragmento que se pretende observar
· A presença deste contaminante influência as etapas de processamento e pode levar a falsos positivos o que, no caso mais grave, leva à retirada do órgão/ tecido são
· Tipos de contaminação (é importante identificar qual de maneira a lidar com ele):
- Processo de colheita
- Processo de macroscopia
- Processo de inclusão
-Processo de corte
- Processo de coloração/ montagem
Macroscopia
· Biópsia – transferência de material precedente que pode induzir em erro a microscopia (limpeza deficiente)
· Peças cirúrgicas – bancada suja uma vez que a macroscopia liberta muito tipo de material (natureza do material, mecanismo de limpeza do material entre peças)
· Em ambos os casos pode ocorrer transferência de material ara outras peças ou então até dentro do mesmo bloco de amostra
· Minimizar – mecanismos ara diminuir a sua ocorrência (limpeza adequada do material e bancada, não realizar macroscopia de duas peças ao mesmo tempo), criar sistema de controlo de qualidade que as identifique (ver lâminas HE no final do processo)
Inclusão
· Neste caso as pinças utilizadas (para orientar, calcar e colocar a peça no molde) podem ter restos/ depósitos de fragmentos nas pontas das pinças/ sulcos do aparelho de inclusão
· Associado à falta de limpeza dos moldes (a seco)
Microtomia
· Contaminações mais comuns – restos de cortes na água que contaminam/ são transferidos para as lâminas seguintes
· Células epiteliais – provenientes das mãos do utilizador/ técnico quando realiza a técnica sem luvas
Coloração/ Montagem
· Mãos do técnico sem luvas
· Pó das luvas que se deposita nas lâminas/ lamelas e assim nos tecidos
· Contaminação do ar devido a secagens de lâminas por montar e/ ou corar (fibras, poeiras, fungos, etc)
· Falta de manutenção dos aparelhos (mudança dos corantes)
Colheita
· Processo de obtenção da amostra
· Como é um resultado incontornável do processo de colheita não são contaminações verdadeiras
· A inexperiência pode dar conclusões erradas 
Resultados das contaminações
· Podem não ter qualquer impacto no diagnóstico
· Grave/ causa de impacto – pode representar um diagnóstico errado que pode resultar numa cirurgia com consequências graves para o doente 
Extração de Ácidos Nucleicos em blocos de parafina
· Os tecidos normalmente fixadas em formol e processados e/ ou embebidos em parafina o que traz vantagens para o corte e coloração uma vez que a integridade do tecido está preservada
· Os arquivos de blocos representam uma grande fonte de material o que possibilita a classificação, mas o problema deste material é que são normalmente processados com formol a 10% e esta fixação em formol não garante a integridade de algumas moléculas - podem sofrer algumas modificações uma vez que este fixador vai adicionar um grupo de metanol aos ácidos nucleicos e modifica-os pelo que ficam com problemas a nível da estabilidade
· A congelação permite a realização de exames extemporâneos assim como outros exames, mas, não tem a mesma qualidade dos cortes fixados
· Objetivo de um extemporâneo: estrinçar se é maligno ou benigno, ou seja, catalogar qual o tipo de neoplasia e idealmente identificar o tumor primário e este exame traz também vantagens a nível dos ácidos nucleicos uma vez que é possível manter a integridade das moléculas de ADN/ RNA
Etapas de Extração dos ácidos nucleicos:
· Lise celular - SDS, Trizol, Mercaptoetanol, Guanidinatiocianato
· Separação dos componentes celulares – Trizol, fenol, guanidina tiocianato, clorofórmio, álcool isoamilico
· Precipitação de DNA/ RNA – Isopropanol e etanol
· Lavagem do DNA/ RNA – etanol 75%
· Ressuspensão – ddH2O-DEPC/ TE
Com o auxílio dos kits de extração de ácidos nucleicos é possível simplificar esta técnica e assim obter resultados mais rápido.
Existem certas etapas que têm como objetivo contornar as alterações provocadas pelos fixadores (formol) na molécula de ADN/ RNA
Qualidade da amostra
Qualidade de extração
· Objetivo – obter ácidos nucleicos/ proteínas viáveis para examinar
· Critérios de avaliação:
- Tipo de amostras (qualidade de amostra)
- Manipulação da amostra
- Fixação tecidual
- Parafinização
- Coloração
- Tempo de armazenamento
Qualidade de extração
· Rapidez de fixação do tecido para evitar autólise (que se instala logo)
· Salvar a função fisiológica de cada tecido especialmente em questões de estrutura e composição celular
· Cada lesão tem diferentes expressões proteicas – o mesmo tipo de tumor pode ter diferentes tipos de proteínas
- Diferentes expressões genica, expressão proteica, padrões de mutações
Manipulação da amostra
· Registo do tempo cirúrgico e tempo de fixação pós cirurgia 
· 1 hora de fixação – 1mm
Fixação tecidual
· Ácidos nucleicos ficam comprometidos se os tempos forem excedidos
· Convém utilizar solução de formol tamponado neutra
· Fatores:
- Espessura da amostras – máximo de fixação, 5mm de espessura devido á degradação em amostras com tamanho superior a 1cm
- Volume da solução de formalina - 
- Duração do processo de fixação – máximo de 24h para evitar o excesso (diminui a quantidade de expressão proteica)
Qualidade de extração 
Parafinação
· Usar reagentes novos e com qualidade não diluídos em água assim como otimizar a duração e temperatura para permitir a desidratação completa
· Diferentes parafinas têm temperaturas de fusão diferentes, mas para RNA/ DNA parafina com baixo ponto de fusão
Coloração
· Evitar Imunohistoquímica, elevado pH e metais pesados
Tempo de armazenamento
· Temperaturas muito baixas degradam DNA/ RNA
Técnicas de obtenção de material
· Punch – 3x3 mm, 10mg/ amostra e 25 mg/ amostra
· Slides - 10-20 µm, 4x10µm / amostra, 2x20 µm/ amostra
· Espessura garante a presença de células tumorais
· utilização de sequenciação de próxima geração (NGS); esta análise ajuda a desenvolver uma terapêutica especifica para aquele individuo/ aspetos específicos; duas pessoas podem responder de maneira diferente - medicina personalizada
· a diferença deste exame porque com esta análise NGS dá não só a informação sobre a patologia/ lesão também dá todas as mutações genéticas que o individuo tem; mapeia tudo
· Risco - utilização desta informação para impedir acessos à saúde por parte de seguradoras (por exemplo); muito caro
Miniprep Kit Zymo
Processamento fácil – solução de desparafinação incluída na remoção simples de parafina sendo que o xilol é dispensado
Recuperação melhorada – uso de proteinase K (digestão) e de calor que garantem uma recuperação máxima
Alta qualidade – ácidos nucleicos estão prontos para qualquer técnica implementada (PCR, NGS, etc)
Idylla
· Sandwish – várias ténias coladas e depois punch/ pellet
· Kits acima referidos são realizados de forma automática
· consoante o tipo de análise dos kits este equipamento realize todos os procedimentos acima falados para garantir que não há erros e informa se há mutação ou não 
· necessário garantir que um determinado número de células tumorais (20%) está representado nos cortes (entre 10-20 micras) após análise pelo patologista na microscopia
· Em Histotecnologia podemos estar a realizar uma técnica altamente avançada, mas se o processamento de tecidos (impregnação de parafina, a fixação) não estiver bem feito vai inviabilizar
Fotografia ou Microfoto
Associado Macroscopia 
· Mesa de macroscopia tem uma câmara que pode auxiliar o patologista a perceber como era a peça)
· Como a pessoa que faz a macroscopia normalmente não é quem observa ao microscópio (vê o acima)
· Documenta os achados encontrados
· Orienta a microscopia
· Retira dúvidas quanto à descrição da peça
· Utilização posterior para ensino, projetos de investigação, etc
Associado a processos de autópsia:
· Como forma de prova
· Como forma de documentação para suportar o relatório
· Foca-se mais nos achados encontrados que podem ajudar a clarificar a causa de morte
· Só são realizadas quando existe autorização para tal (anatomo-clínicas)
Vantagens dos sistemas fotográficos incorporados:
· Permite várias fotografias durante o decorrer da etapa da macroscopia
· Permite uma grande variedade de registos nas fotografias desde as medidas, áreas, mapeamento, etc
· Partilha de informação ‘livre’ com outros profissionais de saúde em qualquer parte (se o software o permitir) – Ex: alguns aparelhos de inclusão têm um ecrã que auxilia a perceber qual a melhor face a incluir
· Equipamentos mais dispendiosos com esses apetrechos todos
· Necessidade de umponto fixo na mesa por motivos de calibração
· Os relatórios têm interesse a nível de ensino assim como de diagnóstico a nível da histologia
Fotografia na microscopia (microfotografia):
· Mais realizado em técnicas perecíveis (como a imunofluorescência) por não ser possível o armazenamento a longo prazo
· Interesse científico
· Ensino, investigação e apresentação de projetos científicos 
· Comunicação inter países e no próprio no envio de fotografias para ser analisada por médicos mais qualificados para aquele caso para rapidez no diagnóstico
· Realizada através de um microscopio com uma camara acoplada e associada a um computador (mais recente esta parte)
Telepatologia
· Fruto de carência de profissionais qualificados em certas regiões do país/ certos hospitais
· Forma rápida e mais segura de pedir uma segunda opinião a colegas/ especialistas que muitas vezes estão noutros países/ continentes
· Exemplo: Hospital da Cova da Beira foi o primeiro a adotar este sistema em Portugal (em 2012). A necessidade surgiu da pela falta de patologistas e pela dificuldade em fixar profissionais no interior; com este primeiro passo e com a experiência/ ajuda destes colaboradores (cova da beira) foi possível à DGS desenvolver uma norma de orientações clínicas sobre o assunto (004/2015) 
Norma 004/2015 (é o que está no PowerPoint, mas convém ler o documento)
6. O sistema de Telepatologia/patologia digital em macroscopia compreende:
a. Câmara de vídeo com ligação em tempo real de acordo com as seguintes características
i. todas as amostras com exame macroscópico feito à distância são fotografadas nas
diferentes fases do exame macroscópico (incluindo a observação da peça íntegra,
observação das superfícies de secção e observação dos fragmentos dentro das
cassetes); e
ii. que esta documentação fotográfica está disponível em tempo útil no ficheiro do
doente, onde poderá ser consultada e utilizada para apoiar a realização do relatório do
exame microscópico.
b. sistema de tecnologias de informação (IT) capaz de fazer a captação da imagem e som emitidos durante o procedimento macroscópico, permitir a interação digital entre operadores. c. realização de documentação fotográfica do exame a ser anexa ao ficheiro do doente (onde conste a sua identificação, informação clínica relativa ao episódio presente e episódios passados); e, d. integração da informação com o processo clínico eletrónico do utente. 7. O sistema de Telepatologia/patologia digital em microscopia obedece ao seguinte: a. digitalizador de lâminas e/ou microscópio robotizado de acordo com o definido na alínea b) do ponto de norma n.º 8; e, b. o sistema de tecnologias de informação (IT) deve ser capaz de transformar a digitalização integral da lâmina e acoplar no processo clínico eletrónico do utente, de acordo com o ponto de norma n.º 9
WSI – WholeSlide Imagine
· Possibilita a criação criar imagens digitais de lâminas completas de histologia e citologia com detalhes suficientes para serem visualizadas com diferentes graus de amplificação e com qualidade comparável a um MO convencional, ou seja, não desforme a imagem (mantem as características do tecido que se está a observar o que é uma vantagem para se realizar o diagnóstico à distância)
Vantagens
· Possibilita a movimentação da imagem instantaneamente
· Pode ser visualizada por várias pessoas ao mesmo tempo mesmo que se encontrem em diferentes partes do globo
· Têm uma durabilidade superior assim como qualidade uma vez que estão em ficheiro
· A arrumação do arquivo de lâminas não é necessário num laboratório digital
· Requisito obrigatório para software de análise de imagem
Desvantagem
· Dispendioso
· Formação dos utilizadores
· Aquisição de imagens são demoradas por vezes
· Aquisição de um digitalizador de lâminas para se ‘guardar as lâminas’
Controlo de qualidade
· O objetivo é obter as imagens melhores possíveis pelo que os seguintes pontos são fulcrais a tal:
· Dependem da técnica utilizada para a produção da lâmina física (os artefactos diminuem a qualidade da lâmina)
· O equipamento que digitaliza tem de estar num local estável de maneira a evitar vibração 
· Utilizar lâminas de teste diariamente para garantir a consistência dos resultados (como em hematologia com os controles) 
· A calibração deve ser de cor – utilização de autocolantes com uma cor conhecida e reconhecida pelo equipamento vai servir de referência
- Com esta digitalização têm surgido vários softwares de análises de imagem 
- Base do software – padrões e princípios pré-estabelecidos pelo equipamento/ utilizador para analisar características de células e tecidos, identificando assim as estruturas anómalas
Preparação de peças anatómicas para exposição
· A preservação surge pela primeira vez com os egípcios, com fins religiosos, há mais de 5000 anos
· André Flamenco – primeiro a utilizar a dissecação anatómica como método de ensino o que lhe rendeu o título de Pai da Anatomia
· Conservação de cadáveres – feito para fins académicos e didáticas; apesar de ser de a aprendizagem ter de ser o mais próxima do real devido aos processos de autólise o cadáver não deve estar a fresco uma vez que se perde muito rapidamente e por isso desenvolveram-se várias técnicas de fixação e conservação
Vantagens
· Ensino médico (para estruturas anatómicas - tecnologia 3D, visualização de peças sintéticas e manipulação de peças anatómicas naturais)
· Interpretação de determinadas lesões e patologias
· Execução de procedimentos clínico e cirúrgico em diferentes especialidades
Técnicas de fixação
· Possuem diferentes características e apresentam melhor ou pior resultado na fixação de tecidos
· Rotina – chegada da peça ao laboratório, fixação do material de maneira a preservar e impedir o processo de autólise, processo de dissecação e aplicação de várias técnicas anatómicas para destacar as estruturas a serem visualizadas
· Mais relevante – o custo do agente fixador ao escolher a técnica de preservação de tecidos
· Mais utilizado – formaldeído apesar de não oferecer vantagens a quem o está a manusear
· Técnica de Giocomini e Plastinação – ótimas técnicas com resultados fantásticos, mas muito dispendiosos o que é um fator limitante
Mais utilizados:
· Formol
· Glicerina
· Álcool etílico
· Fenol
Menos utilizado
· Plastinação ou inclusão com resina ou poliéster
Formol
· Solução aquosa com 30 a 56% de formaldeído + 6 a 15% de metanol; também tem na sua composição resinas to tipo fenólicas, poliacetatos, hexamina; menor quantidade – chumbo e cádmio
· Fixador mais utilizado por ser a técnica mais barata e de fácil obtenção
· Negativo
- Toxicidade elevada (irritante para o trato respiratório e olhos)
- Coloração diferente da cor original
- Aumento do peso da peça o que dificulta o seu manuseamento e transporte
Glicerinação
· Karl Wilhelm Sheele desenvolver a técnica em 1762 
· Carlo Giocomini – utilizou-a e preservou corpos (Eva Perón)
· Maior alternativa para a substituição do formol
· Utilização do álcool 100º para evitar falha quanto à confiança e resultados
Vantagens:
· Substância inodora 
· ação fúngica e bactericida
· Permite a coloração das peças 
· Menor peso em função da desidratação proporcionada pela técnica
· Longo período de conservação 
· Fácil visualização e identificação detalhada das estruturas
Desvantagem – Custo elevado em comparação com formol
Técnica de Laskowski
· Mais complicada em comparação com o formol
· Muito utilizada na preparação de espécimes naturais
· Empregue em animais de pequeno porte e pequenas peças anatómicas
· Álcool etílico a 96º+ácido fénico+ ácido bórico – cavidades e vasos sanguíneos com preservação do cadáver em urnas de metal para os manter hidratados
· Permite corantes para manter a tonalidade
· Desvantagem – risco genotóxico dos fenóis sobre os manipuladores
Plastinação
· Utilizada em museus demonstrativos sobre o corpo humano
· Von Hagens desenvolveu a técnica em 1980
· Extração dos líquidos corporais com químicos (acetona) e substituição com resinas elásticas de silicone
· Qualidade sofisticada
· Desvantagem – alto grau deespecialização e infraestruturas para a sua elaboração o que apresenta um maior custo
Cada peça requer abordagens diferentes:
· Músculo – Deve ficar preso ao osso ou fáscia (tecido conjuntivo) para manter a estrutura 
· Vasos e nervos – Dissecação deve ser mais aperada pois são mais delicadas
· Osso – demora mais tempo e contem várias etapas (lavagem, banho em cola e envernização)
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