Nanopartículas de Gelatina com Paclitaxel para Câncer de Bexiga

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Paclitaxel-Loaded 
Gelatin Nanoparticles 
for Intravesical Bladder 
Cancer Therapy
Nanopartículas de gelatina carregadas 
com paclitaxel para terapia intravesical
de câncer de bexiga
ARTIGO
1. Introdução
50.000/ ano
2
2004
ENTRE OS 10 TIPOS DE CÂNCER MAIS INCIDENTES NO 
MUNDO
TRATAMENTO ATUAL 
▪ Ressecção tumoral
▪ Quimioterapia intravesical
Vantagem: Administração de drogas em alta 
concentração na bexiga portadora de tumor, 
minimizando a exposição sistêmica
Desvantagem: Alguns fármacos (Ex: Mitomicina C e 
Doxorrubicina) apresentam incapacidade de penetrar no 
tecido da bexiga e baixa atividade terapêutica contra os 
tumores mais agressivos
PACLITAXEL
Estudo de fase II mostrou que a infusão intravenosa de 
Paclitaxel por 24 horas produziu uma taxa de resposta 
parcial e completa de 42% do câncer de bexiga avançado 
e / ou metastático.
▪ Alta atividade terapêutica
▪ Alta lipofilicidade e retenção intracelular
Pode penetrar mais rapidamente no urotélio do que 
outros medicamentos comumente usados.
▪ Causa apoptose por vias dependentes e 
independentes de p53
PROBLEMATIZAÇÃO E OBJETIVOS
▪ A formulação de Paclitaxel aprovada pela
FDA para uso humano usa Cremophor para
solubilizar a droga, formando micelas.
Reduz a fração livre do fármaco e 
consequentemente a penetração no tecido
▪ Quimioterapia intravesical
MÉTODO 1
• Utilização de um agente tensoativo capaz de
romper a estrutura da micela.
• Utilizado o dimetilsulfóxido (DMSO)
• Estudo em cães
• DMSO também aumentou a taxa de produção
de urina e aumentou a remoção do
medicamento.
Objetivo: Propor métodos para utilização do 
fármaco na quimioterapia intravesical
MÉTODO 2
• Nanopartículas de gelatina
• Liberação completa depois de 2 horas
• Medicamento liberado por difusão e partículas
submicrônica
2. Materiais
• Produtos químicos
- Paclitaxel
- Gelatina tipo A da pele suína, 
- Tween 20, 
- Sulfato de sódio,
- Metabissulfito de sódio,
- Pronase e glutaraldeído (25% em 
água) 
- Cefotaxima sódica 
- Gentamicina 
- Suprimentos de cultura de células
2. Métodos
1. Preparação de nanopartículas de gelatina carregadas com Paclitaxel
Bloom numbers (75–100, 175 e 300) e
usando o método de dessolvatação
A gelatina (200 mg) foi dissolvida em
10 mL de água contendo 2% Tween
20
A solução foi aquecida a 40 ° C com
agitação constante a 300 rpm
+ 2 mL de uma solução aquosa de
sulfato de sódio a 20%
1 mL de isopropanol contendo 2 mg de
paclitaxel.
+ alíquota da solução de sulfato de
sódio 6mL) até a solução ficar turva, o
que indicava a formação de agregados
de gelatina.
+1 mL de água destilada até a solução
ficar clara.
+ solução aquosa de glutaraldeído
(25%, 0,4 mL) foi adicionada para
reticular a gelatina.
+ solução de metabissulfito de sódio
(12%, 5 mL) 5 minutos depois para
interromper o processo de reticulação.
Após 1 hora, o produto em bruto 
foi purificado numa coluna 
Sephadex G-50. 
A fração contendo nanopartículas 
foi liofilizada em um congelador 
durante um período de 48 horas.
2. Caracterização de nanopartículas 
carregadas com Paclitaxel. 
• Uma mistura de nanopartículas de gelatina e água
destilada foi colocado em papel alumínio, seco,
revestido com ouro e observado ao microscópio
eletrônico de varredura
• O rendimento da produção foi calculado a partir do
peso das nanopartículas de gelatina liofilizadas e
expresso como uma porcentagem do peso inicial da
gelatina.
• Os espectros de difração de raios das amostras foram
obtidas usando o difratômetro. As amostras foram
digitalizadas de 5 a 60 graus com uma taxa de
varredura de 1 grau por minuto.
3. Determinação da carga de Paclitaxel em 
nanopartículas de gelatina.
▪ 2mg nanopartículas carregadas com Paclitaxel foram
dispersos em 0,5 mL de PBS e digeridos com 0,5 mL de
Pronase (1 mg / mL em PBS) em um agitador metabólico a
37 ° C.
▪ Após cerca de 1 hora (ou quando uma solução clara foi
obtida), foi adicionado o padrão interno, cefalomanina,
seguido de extração com 2 volumes de 3 mL de acetato de
etila . As camadas de acetato de etila foram reunidas, secas
sob uma corrente de ar e reconstituídas em acetonitrilo.
▪ As concentrações de Paclitaxel nos extratos foram
analisadas usando cromatografia líquida de alta pressão
(HPLC) e comparadas com as concentrações nas amostras de
referência para determinar a carga de Paclitaxel.
4. Libertação de Paclitaxel a partir de 
nanopartículas de gelatina.
5. Adsorção de Paclitaxel a nanopartículas
• A adsorção de Paclitaxel em nanopartículas foi determinada
pela incubação de uma quantidade vestigial de Paclitaxel
[3H] (0,022 Ci) com nanopartículas de gelatina vazias por 5
horas a 37 ° C.
• Alíquotas foram coletadas para análise da radioatividade
total.
• Após a incubação, a mistura foi centrifugada por 15 minutos
e o sedimento resultante continha as nanopartículas e a
facção sobrenadante foram coletadas.
• O sedimento foi digerido com Pronase. A radioatividade da
mistura original e do sedimento e sobrenadante digerido foi
analisada usando um analisador de cintilação líquida
• A adsorção de Paclitaxel em nanopartículas de gelatina foi
calculada como a porcentagem de radioatividade no
sedimento.
• As nanopartículas de Paclitaxel (12mg) foram
dispersas em 100mL de PBS ou urina de cão e
incubadas a 37 ° C.
• Amostras seriais 1mL foram retiradas e centrifugadas
por 15 minutos a 143.000 g usando uma
ultracentrífuga.
• O sobrenadante livre de nanopartículas (400 L) foi
removido e extraído com 3 mL de acetato de etila
duas vezes.
• O extrato de acetato de etila foi analisado quanto à
concentração de Paclitaxel por HPLC.
6. Degradação enzimática de
nanopartículas de gelatina
• Nanopartículas foram dispersas em PBS e incubadas
com Pronase.
• Monitoramento da degradação → absorbância em
540 nm.
• A absorbância foi proporcional à concentração de
nanopartículas.
7. Avaliação da atividade biológica in vitro
• Células cancerígenas RT4 foram cultivadas em Meio
McCoy suplementado com soro fetal bovino a 9%, L-
glutamina, gentamicina e cefotaxima sódica a 37 °C.
• As células foram semeadas em placas de
microtitulação de 96 poços por 24 horas.
* Efeito imediato e citotoxicidade tardia *
• Efeito imediato → Células incubadas com 0,2 mL de
meio de cultura contendo uma alíquota de Paclitaxel
livre ou nanopartículas carregadas com Paclitaxel →
Verificação do efeito imediatamente após o
tratamento.
• Efeito tardio → Células tratadas de maneira
semelhante por 15 minutos e 2 horas, lavadas uma vez
com PBS e depois incubadas com a droga livre durante
um total de 96 horas → Observação do efeito.
* Solução estoque de Paclitaxel livre → Etanol como
solvente
8. Avaliação in vivo da penetração de 
Paclitaxel nos tecidos da bexiga
• 4 cães → Jejum.
* Testes realizados entre 7 e 10 horas
• Foram coletadas amostras de sangue e adicionado
cateter para administração de analgésicos.
• Cateter uretral → amostras de urina
• Anestesia → Esvaziamento da bexiga → dose
intravesical do Paclitaxel → Remoção da bexiga →
Animais sacrificados
• Amostras de urina antes e durante a administração e
antes da remoção cirúrgica → Amostras foram
incubadas com Pronase → adição do padrão interno →
Extração com 6 mL de acetato de etila →
Centrifugação (3000 rpm por 10min) → Sobrenadante
foi transferido e evaporado → Resíduo foi
reconstituído e injetado no sistema HPLC.
• Bexiga removida foi cortada em três seções, que foram
congeladas em nitrogênio líquido → Tecidos foram
cortados em finas fatias que foram usadas para analisar
as concentrações totais de Paclitaxel
9. Análise do Paclitaxel por cromatografia 
líquida de alta eficiência (HPLC)
• Fase estacionária: Coluna de Limpeza e Coluna Analítica
• Fase móvel de limpeza: 37,5% de Acetonitrila em água
• Fase móvel analítica: 49% de Acetonitrila
• A fração de 8 a 15 min contendo Paclitaxel e
Cefalomanina foi transferida da coluna de limpeza para a
coluna analítica.
10. Análise Estatística
• A comparação dos valores entre os grupos foi realizada
usando two-tailed Student’st tests. Um valor de P<0,05
foi considerado estatisticamente significativo.
3. Resultados
Caracterização das nanopartículas
Gelatina 175-bloom
1% = 671 ± 267 nm
2% = 620 ± 218 nm
Gelatina 300-bloom = 976 ± 462 nm
Paclitaxel livre → Estrutura cristalina
Paclitaxel livre + Nanopartículas de 
gelatina em branco → Estrutura cristalina
Paclitaxel em nanopartículas → Estado 
amorfo
Alto peso molecular = baixa eficiência e 
rendimento
Baixo peso molecular = baixa eficiência 
Melhores resultados → Peso molecular 
médio (175-bloom)
Liberação rápida de Paclitaxel das nanopartículas
55% em 15 minutos
87% em 2 horas
92% liberados em 3 horas
4,5 ± 0,4% da quantidade total de Paclitaxel 
carregado em nanopartículas foi adsorvida nas 
nanopartículas.
Liberação de Paclitaxel das Nanopartículas
O gráfico expressa o efeito das concentrações de enzimas na 
degradação de nanopartículas.
As nanopartículas de gelatina foram incubadas com e sem Pronase a 37 ° C.
Degradação enzimática de nanopartículas de gelatina
Concentração de Pronase 
= 
Velocidade de degradação ( reduz o 
tempo necessário) 
Efeitos observados:
Atividade biológica de nanopartículas carregadas com 
Paclitaxel em células RT4
Uma solução aquosa de Paclitaxel ( quadrados) nanopartículas de gelatina carregadas 
com Paclitaxel ( círculos) foi incubado com células RT4 de câncer de bexiga humana.
Para medições de efeito imediato: O efeito do
medicamento foi medido imediatamente após o
tratamento
• Células tratadas por 48h – símbolos preenchidos
• Células tratadas por 96h – símbolos abertos
Para o efeito imediato, os tratamentos com
Paclitaxel livre ou contendo nanopartículas
resultaram em inibição máxima de 60% em 48 horas
e 84% em 96horas.
Para medições de efeito retardado: efeito medido em
96h
• Células tratadas por 15 minutos – símbolos
preenchidos
• Células tratadas por 2 horas - símbolos abertos
Para o efeito retardado, os tratamentos com
Paclitaxel livre ou contendo nanopartículas
resultaram em inibição máxima de 74% em 15
minutos e 85% em 2h.
Discussão
Problemas relacionados:
• Solubilidade do Paclitaxel Uso de Cremophor para
solubilizar Hipersensibilidade potencialmente fatal
associada ao Cremophor.
• Durante a terapia regional, o Paclitaxel permanece
preso nas micelas de Cremophor Limita a
penetração do fármaco nos tecidos da bexiga.
Abordagens propostas:
• Formulações sustentadas de microesferas e
nanoesferas de Paclitaxel Liberação lenta (o
fármaco não permanece na bexiga por muito tempo).
• Desenvolvimento de nanopartículas de gelatina
carregadas com Paclitaxel Liberaram rapidamente o
medicamento em vitro, em PBS ou na urina de cães
(87% em 2 horas sem enzimas).
Vantagens das nanopartículas
Duas propriedades das nanopartículas de
gelatina são favoráveis para uma difusão mais
rápida:
• O tamanho das nanopartículas bem como a
hidrofilicidade da gelatina que aumenta a
captação de fluidos;
• Estado amorfo (mais solúvel em água nas
nanopartículas)
As nanopartículas proporcionaram maior
concentração do fármaco no tecido da bexiga
Conclusão
Portanto, as nanopartículas de gelatina carregadas com Paclitaxel que liberaram
rapidamente o fármaco, mostraram atividade significativa contra células cancerígenas da
bexiga humana e mostraram concentrações mais elevadas no tecido em comparação
com a formulação comercial Cremophor / EtOH.
Esses dados sugerem as nanopartículas como uma formulação potencialmente útil de
Paclitaxel para o tratamento intravesical do câncer de bexiga.