Biologia molecular e engenharia genética na fitopatologia

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Biologia Molecular e Engenharia 
Genética na Fitopatologia
FONTE: http://manipulaciongeneticaplantas.blogspot.com/2017/03/manipulacion-
genetica-plantas.html
INTRODUÇÃO
❑ As necessidades do aumento da produção de
alimentos e outros produtos agrícolas tem levado o
homem a aprimorar técnicas de melhoramento genético
vegetal;
❑ cruzamentos sexuais de plantas com diferentes
base genéticas; e
❑ retrocruzamentos de híbridos.
As desvantagens são:
✓ Viável somente para espécies sexualmente compatíveis;
✓ O tempo necessário para a obtenção de um híbridos
comercialmente aceitável é bastante longo, pois
envolve seleção de várias gerações;
✓ Vários genes indesejáveis das linhas parentas, podem
ser transferidos aos descendentes com o gene de
interesse;
✓ Genes de interesse podem ser perdidos.
A engenharia genética de plantas consiste em:
• identificação e isolamento de genes que conferem
características desejáveis; e
• na introdução desse genes em variedades de
interesse agrícola.
Na fitopatologia através da engenharia genética, pode-
se introduzir genes de outras espécies vegetais sob o
controle de promotores adequados, de interesse
agronômico, de modo que as plantas transgênicas
resultantes sejam capazes de resistir aos ataques de
patógenos.
BIOLOGIA MOLECULAR DAS
CÉLULAS MATERIAL GENÉTICO
As células possuem dois tipos de ácidos nucléicos, o
DNA e o RNA;
As diferenças e semelhanças básicas entre o DNA e o
RNA são:
• No DNA, a pentose é uma desoxiribosse e o RNA uma
ribose;
• A molécula de DNA armazena informações , enquanto
a de RNA participam da transferência da informação
genética.
FONTE: sciencesamhita.com
DESENVOLVIMENTO DAS 
TÉCNICAS DE BIOLOGIA 
MOLECULAR
Varios fatos possibilitaram o avanço acelerado da
biologia molecular nas décadas de 70 e 80, onde
foram descoberto e aprimorados os estudos sobre
enzima de restrição, ligação de dois fragmentos de
DNA, técnicas de seqüenciamento direto de fragmentos
de DNA.
✓ Após o surgimento do vetor plasmidial e de
sistema de transformação mais eficientes a
manipulação do DNA tornou-se muito mais
simplificada e acessível a qualquer laboratório
razoavelmente equipado;
✓ Um vetor plasmidial é uma molécula de DNA
circular purificada, construída por meio de técnicas
do DNA recombinante.
DESENVOLVIMENTO DAS 
TÉCNICAS DE BIOLOGIA 
MOLECULAR
FERRAMENTAS DA 
BIOLOGIA MOLECULAR
As ferramentas utilizadas na biologia molecular
para clonagem de genes são:
• as enzimas de restrição;
• as enzimas modificadoras;
• os vetores; e
• as células hospedeiras.
• São produzidas normalmente por bactérias e que
possuem a propriedade de defendê-las de vírus
invasores;
• Essas substâncias “picotam” a molécula de DNA em
determinados pontos, levando a produção de
fragmentos contendo pontas adesivas, que podem se
ligar a outras pontas de moléculas de DNA que
tenham sido cortadas com a mesma enzima.
Enzimas de Restrição: 
FONTE: http://autopomorfico.blogspot.com/2012/12/enzimas-de-restricao.html
• DNA polimerase;
• Terminal transferase;
• DNA polimerase RNA – dependentes;
• RNA polimerase DNA – dependentes;
• DNA ligase;
• Fosfatases Alcalinas;
• Quinase de Polinucleotídeo.
Enzimas Modificadoras: 
• Os vetores para clonagem de genes devem:
• possuir elementos que permitam uma alta taxa de
replicação;
• fácil seleção das células transformadas; e
• fácil seleção de clones recombinantes;
• Após a transformação de uma população de células
com o vetor plasmidial, as células, contendo o
vetor, devem ser selecionadas a fim de saber se
esse vetor contém ou não fragmentos de DNA a
serem clonados.
VETORES: 
VETORES
Características 
desejáveis:
 Baixo peso molecular;
 Variedade de sistemas
de seleção.
Características 
essenciais:
 Replicação na célula 
hospedeira;
 Sítios de clonagem
únicos para enzimas de
restrição;
 Ao menos um sistema de 
seleção;
 DNA dupla fita.
CÉLULAS HOSPEDEIRAS: 
• Para eliminar o risco das células recombinantes
proliferarem indiscriminadamente, causando danos,
foram desenvolvidas bactérias mutantes incapazes
de sobreviver fora do tubo de ensaio;
• Atualmente, existem hospedeiros apropriados para
cada situação e tipo de vetor, garantindo a
otimização dos procedimentos experimentais.
• Ferramentas básicas, aliadas a uma boa
metodologia cientifica são os elementos
fundamentais para clonagem de genes e estudo de
mecanismos que controlam sua expressão.
FERRAMENTAS DA 
BIOLOGIA MOLECULAR
Estratégias básicas para clonagem de genes:
✓ Três passos básicos de aplicam a qualquer estratégia
de clonagem adotada:
• Escolher uma fonte de DNA;
• Produzir Fragmentos de DNA que possam ser
inserido em vetores adequados;
• Selecionar os recombinantes com genes adequados.
CLONAGEM DE GENES
CLONAGEM DE GENES
Etapa 1: faz-se a ligação entre um fragmento de
DNA, chamado inserto, contendo o gene de interesse
com uma outra molécula de DNA, o vetor, para
formar uma quimera ou molécula de DNA
recombinante.
CLONAGEM DE GENES
CLONAGEM DE GENES
Etapa 2: a molécula de DNA recombinante é
transportada para dentro de uma célula hospedeira,
em geral uma bactéria, ocorrendo o processo de
transformação;
➢ A célula que recebeu o DNA recombinante é
chamada de célula transformada, a qual sofre
muitos ciclos de divisão, produzindo várias cópias do
DNA recombinante
Plantas melhoradas através da engenharia genética
podem ser obtidas utilizando duas estratégias:
• Alteração de seqüências de DNA;
• Transferência de genes de outras espécies para a
planta de interesse.
ENGENHARIA GENÉTICA 
NAS PLANTAS
• Depende não somente da eficiência de transformação,
mas também da capacidade de regeneração de plantas
a partir de células ou tecidos transformados;
• Muitas espécies, dentre gramíneas e leguminosas são
de difícil regeneração in vitro, dificultando a
engenharia genética de grande interesse agrícola,
como milho e feijão.
PLANTAS TRANSGÊNICAS
• AS plantas transgênicas são normalmente
produzidas a partir das células infectadas por
agrobacterium;
• Porém existem outros métodos de transformação
como:
• Eletroporação; e
• Bombardeamento de mocroprojeteis.
PLANTAS TRANSGÊNICAS
FONTE: http://melhorsemlactose.blogspot.com/2015/03/alimentos-transgenicos.html
A utilização da Engenharia genética, aliada aos
métodos de melhoramento vegetal conferem:
✓ o desenvolvimento de cultivares resistentes ao
ataque de patógenos; e
✓ diminuição no uso de defensivos agrícolas.
ENGENHARIA GENÉTICA NO 
CONTROLE DE DOENÇAS
• Umas das idéias para a produção de plantas
transgênicas resistentes a doenças seria através da
clonagem de genes de resistência e sua integração
no genoma de uma cultivar suscetível.
Resistência a Patógenos: 
Resistência a Patógenos: 
• A introdução de genes específicos de resistência
para determinadas raças de patógenos poderia
resolver somente uma parte do problema de
resistência a doenças, pois a planta ainda estaria
suscetível a outras raças de patógenos.
Resistência a Patógenos: 
• A introdução do gene de uma quitinase (proteína
de Defesa) de feijão, sob o controle do promotor
35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), em
tabaco, resultou em um aumento de resistência ao
fungo Rhizoctonia solani.
Resistência a Patógenos: 
• Após uma exposição a patógenos, as plantas
produzem, localmente, substâncias antibióticas,
chamadas fitoalexinas;
• Em muitos casos, existe uma correlação entre a
concentração de fitoalexinas e a resistência a
patógenos específicos.
Resistência a Patógenos: 
• A resistência a doenças causadas por bactérias já
foi obtida através na introdução de um gene de
lisozima do bacteriófago T4 em batata, o que
resultou na produção de plantas transgênicas
resistentes a Erwinia carotovora.
RESISTÊNCIA A PATÓGENOS: 
• A observação de que a infecção de plantas com
estirpes de vírus atenuadas confere proteção contra
estirpes mais virulentas possibilitouo desenvolvimento
de plantas resistentes a vírus através da engenharia
genética;
• Diferentes genes e seqüências nucleotídicas virais já
foram introduzidos e expressos em plantas, com o
objetivo de induzir resistência a infecções por vírus
RESISTÊNCIA A HERBICIDAS
• É uma característica de interesse agronômico;
• Considerando-se que diversos deles exercem seu
efeito inativando enzimas essenciais aos processos
vitais da planta;
• O objetivo geral é desenvolver plantas que possam
tolerar a exposição a herbicidas de largo espectro.
RESISTÊNCIA A HERBICIDAS: 
Existem três estratégias gerais para a introdução de
tolerância a herbicidas em plantas:
✓ alteração da estrutura da enzima-alvo, de forma a
torná-la insensível à ação do herbicida;
✓ superprodução da enzima não modificada;
✓ introdução de genes de enzimas capazes de degradar
o herbicida, antes que ele inicie sua ação sobre a
planta.
RESISTÊNCIA A INSETOS: 
• A introdução de resistência a doenças e pragas é
uma prioridade de programas de melhoramento,
tendo em vista que:
• cerca de 10% de perdas são atribuídas a insetos e
nematóides;
• 12% a fungos; e
• 20% a vírus e bactérias.
RESISTÊNCIA A INSETOS: 
• A engenharia genética pode contribuir também para
a proteção dos grãos, durante o armazenamento
pós-colheita, com a utilização de genes
correspondentes a proteínas que inibam enzimas
digestivas, sob o controle de promotores específicos
de sementes.