Métodos de separação e caracterização de proteínas

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Disciplina: Optativa I / Bioquímica Avançada 
Curso: Licenciatura em Química
 Métodos de separação e caracterização de proteínas 
1. Pesquisa e descreva sucintamente os métodos abaixo utilizados para fracionar e caracterizar proteínas:
a. Diálise 
Na separação de proteínas por diálise em uma solução aquosa é colocado um filtro com poros bem pequenos que impede a passagem de molécula de proteínas maiores. As membranas de diálise são hidrofílicas, nano porosas, homogêneas ou de troca iônica. Os parametros importantes da diálise: massa molar e o tamanho dos poros.
b. Cromatografia de afinidade 
Baseada na afinidade de ligação.
Resina: ligante (grupo químico covalentemente ligado).
Proteínas com afinidade se ligam ao ligante.
Pequenas proteínas são ligadas aos suportes e a mistura complexa de proteínas é aplicada.
Proteínas ligadas podem ser eluídas com moléculas pequenas ou reagents
Formado um complexo entre proteína e ligante.
As proteínas que não se ligam são lavadas da coluna.
Proteína de interesse é eluída com uma elevada concentração de sal e do ligante livre.
O sal interfere nas ligações iônicas que ligam a proteína ao ligante.
O ligante livre se liga a coluna de afinidade.
c. Cromatografia de troca iônica 
A cromatografia de troca iônica, é uma técnica de biocromatografia também conhecida como IEC ou IEX, é um processo de cromatografia que separa íons e moléculas polares com base em sua afinidade com a resina da coluna trocadora de íons. O ponto isoelétrico (pI) é o pH onde a proteína possui carga líquida zero.
É baseado nas diferenças de sinal e magnitude da carga elétrica líquida de proteínas em um dado pH. Resina: Trocadora de cátions (grupos aniônicos); Trocadora de ânions (grupos catiônicos). Afinidade afetada: o pH (determina o estado de ionização da molécula); a concentração dos íons dos sais livres que competem na solução circundante.
d. Cromatografia de exclusão molecular 
Cromatografia por exclusão de tamanho (SEC ou SEC-HPLC) para medição da massa molecular absoluta, da estrutura, do tamanho e da conformação da proteína
A cromatografia por exclusão de tamanho (SEC ou SEC-HPLC) é uma técnica analítica que separa macromoléculas dissolvidas por tamanho com base em sua eluição de colunas preenchidas com um gel poroso.
Quando a SEC for atrelada ao espalhamento da luz, viscosímetro e detectores de concentração (conhecidos como detecção tripla), será possível medir o peso molecular absoluto, o tamanho molecular e a viscosidade intrínseca, e gerar informações sobre a estrutura macromolecular, conformação, agregação e ramificação.
Ao utilizar a SEC para medir o peso molecular e essas outras propriedades, os cientistas podem caracterizar moléculas, como proteínas, polímeros sintéticos e naturais, como polissacarídeos.
Para todas essas moléculas, esses parâmetros se relacionam, bem de perto, ao seu desempenho em inúmeras aplicações.
e. Eletroforese uni e bidimensional 
Eletroforese uni
A eletroforese unidimensional consiste em separar as proteínas apenas por seu peso molecular, aplicando as amostras diretamente no gel com auxílio de um gel de empilhamento, fazendo com que as proteínas migrem verticalmente, sem passar pela etapa de separação por ponto isoelétrico.
Bidimensional
É uma forma de eletroforese em gel geralmente utilizada para análise e separação de proteínas em mistura. Ela possui combinação sequencial da focalização isoelétrica e SDS-PAGE, separação de mistura complexa proteica. Mais sensível que os métodos isolados. Massa molecular e pI.