Reparo de danos ao DNA

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Reparo de danos celulares ao DNA
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE QUÍMICA DE SÃO CARLOS
Bioquímica 2
Fernando Brondani Minussi
Rafael Sardeli de Oliveira
Rodolfo Santos Deda
Victor Alves Venâncio
PRESERVAÇÃO DO MATERIAL GENÉTICO
IMPORTÂNCIA DO DNA
REPARO DE DANOS CELULARES AO DNA 1
Síntese de proteínas e funções metabólicas
Transmissão da sequência à linhagem germinativa
Necessidade de um sistema de 
manutenção da integridade do DNA
Armazenamento da informação genética 
Prêmio Nobel de Química 2015
“Os mecanismos de reparo de DNA”
Tomas Lindahl, Paul Modrich e Aziz Sancar
CONSEQUÊNCIA DE DANOS AO DNA
ALTERAÇÃO DA SEQUÊNCIA DE BASES
REPARO DE DANOS CELULARES AO DNA 2
Lesões não reparadas
DNA com dano é replicado e transmitido
Algumas impedem a utilização como um molde para a replicação e transcrição
Mutação
“Raramente, uma mutação confere 
alguma vantagem biológica.”
Lehninger
MUTAÇÕES E CÂNCER
EM MAMÍFEROS
REPARO DE DANOS CELULARES AO DNA 3
Forte correlação entre acúmulo de mutações e câncer
Lesões nos genes que controlam o ciclo celular
Mecanismos de reparo protegem as células tumorais
Resistência da célula a agentes quimioterápicos
BENEFÍCIOS DAS MUTAÇÕES? EVOLUÇÃO
Variação genética
Novas funções, novas espécies
Equilíbrio entre a ocorrência de uma mutação e seu reparo
BIODIVERSIDADE
TIPOS DE LESÃO AO DNA
TIPOS DE LESÃO E SEUS REPAROS
REPARO DE DANOS CELULARES AO DNA 4
Erros de replicação
Malpareamento durante a replicação do DNA
Lesões espontâneas
Reações do DNA no meio celular (hidrólise, deaminação,...)
Lesões exógenas
Causadas por agentes ambientais (radiação, substâncias,...)
Reversão direta
Excisão de base
Excisão de nucleotídeo
Recombinação
Transleção
Reparo de malpareamentos
TIPOS DE LESÃO AO DNA
SÍTIOS VULNERÁVEIS NO DNA
REPARO DE DANOS CELULARES AO DNA 5
Sítios de hidrólise Sítios de oxidação Sítios de alquilação
TIPOS DE LESÃO AO DNA
DEAMINAÇÃO Eliminação de amônia por hidrólise
REPARO DE DANOS CELULARES AO DNA 6
SÍTIO ABÁSICO Eliminação de uma base por hidrólise
citosina → uracila: transversão C:G por A:T após replicação
Alterações “não-naturais”, 
reconhecíveis pelos 
sistemas de reparo! 
TIPOS DE LESÃO AO DNA
ALQUILAÇÃO Transferência de um grupo alquil para uma base
REPARO DE DANOS CELULARES AO DNA 7
OXIDAÇÃO
oxoguanina
𝑶𝟐
−
𝑯𝟐𝑶𝟐
𝑯𝑶∙
𝑵𝑶∙
Pareamento com C ou incorreto com A 
Transversão G:C para T:A 
após a replicação! 
Pareamento incorreto com T 
O6-metilguanina
TIPOS DE LESÃO AO DNA
ANÁLOGOS DE BASES Substâncias que substituem as bases
REPARO DE DANOS CELULARES AO DNA 8
AGENTES INTERCALANTES Moléculas que se alocam entre as bases pareadas
Etídio Proflavina Acridina
5-bromouracila (análogo de timina)
Pareamento incorreto com G 
Transversão T:A para C:G
Distorcem a conformação espacial regular do DNA Causam deleção ou inserção de um nucleotídeo extra
TIPOS DE LESÃO AO DNA
RADIAÇÃO
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Absorção de UV pode causar fusão de 
pirimidinas adjacentes, formando dímeros
Radiação a → quebra de fita simples
Radiação g e raios X → quebra de fita dupla
EFEITO INDIRETO
Formação de espécies reativas que danificam o DNA
DETERMINAÇÃO DA CAPACIDADE MUTAGÊNICA
TESTE DE AMES
REPARO DE DANOS CELULARES AO DNA 10
Cultura de Salmonella typhimurium com mutação no gene responsável pela biossíntese de His
Ágar com nutrientes, 
mas sem histidina
Adição de substância
“mutagênica”
Mutações induzidas 
revertem a mutação 
do gene!
Aumento do 
número de colônias 
em crescimento
Incubação por 12h
DETERMINAÇÃO DA CAPACIDADE MUTAGÊNICA
SUBSTÂNCIAS MUTAGÊNICAS
REPARO DE DANOS CELULARES AO DNA 11
Mais de 90% das substâncias carcinogênicas são mutagênicas por Ames!
Composto
Tipo principal de 
exposição
Principal via de exposição Órgão afetado
Aflatoxinas Ambiental Ingestão, inalação Fígado
Benzeno Ocupacional Inalação, contato com a pele Sistema hematopoietico
Compostos de cromo Ocupacional Inalação Pulmão
Contraceptivos orais Medicinal Ingestão Fígado
REPARO DE DANOS AO DNA
MECANISMOS DE REPARO ASSOCIADOS AOS DANOS
REPARO DE DANOS CELULARES AO DNA 12
Tipo de reparo Tipo de dano Enzimas de atuação
Reversão direta Dímero de pirimidinas, bases alquiladas DNA fotoliase, alquiltransferase
Excisão de base
Modificação de base, sítios apurínicos, 
quebra de fita simples
DNA glicosilase
Excisão de nucleotídeo
Dímero de pirimidinas, adutos
volumosos de base
UvrA, UvrB, UvrC e UvrD (em E. coli)
XPC, XPA, XPD, ERCCI-XPF e XPG (em humanos)
Recombinação Quebra de fita dupla RecA e RecBCD (em E. coli)
Transleção Dímero de pirimidinas, sítio apurínico DNA polimerases da família Y
EXEMPLO DA IMPORTÂNCIA → depurinação : cerca de 10000 erros/célula/dia
→ desaminação: cerca de 100-500 erros/célula/dia
Há cerca de 
1013 células no 
corpo humano!
REPARO DE DANOS AO DNA
REVERSÃO DIRETA DE DANO - FOTORREATIVAÇÃO
REPARO DE DANOS CELULARES AO DNA 13
Radiação UV → fusão de pirimidinas → distorção local da estrutura de pareamento → Transcrição Replicação
Restauração a partir da ação de DNA-fotoliases
Cromóforo ligado à enzima absorve luz de 300-500 nm
A energia de excitação é transferida a um FADH- → e- para o dímero
O ânion de pirimidina resultante reduz novamente o FADH∙ e o DNA, agora sem dano, é liberado
Dímeros de pirimidina são separados pela DNA-fotoliase
REPARO DE DANOS AO DNA
REVERSÃO DIRETA DE DANO - REMOÇÃO DE GRUPOS ALQUILA
REPARO DE DANOS CELULARES AO DNA 14
Formação de resíduos de O6-alquilguanina
Incorporação de timina ao invés de citosina (mutação) 
Reparo dos danos pela O6-alquilguanina-DNA-alquiltransferase
Grupo alquila é removido e transferido diretamente para um resíduo de cisteína da enzima
REPARO DE DANOS AO DNA
EXCISÃO DE BASE (BER) 
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DNA-glicosilases cliva a ligação glicosídica de um nucleotídeo alterado 
O resíduo de desoxirribose é clivado por uma AP-endonuclease
Um bloco de resíduos é removido pela ação de uma 
exonuclease celular
A lacuna é preenchida e selada por uma DNA-polimerase 
e pela DNA-ligase
REPARO DE DANOS AO DNA
EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEO (NER)
REPARO DE DANOS CELULARES AO DNA 16
Elimina lesões pela remoção de um oligonucleotídeo e preenche a 
lacuna de fita simples resultante
A NER depende da utilização de ATP, por meio da ação do sistema 
de endonucleases UvrABC
Clivagem da fita de DNA danificada
O oligonucleotídeo de 11 ou 12 nt removido é deslocado pela 
ligação UvrD e substituído pelas ações da Pol I e da DNA-ligase
REPARO DE DANOS AO DNA
RECOMBINAÇÃO
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Quebra de fita dupla
Enzima de quebra de DNA irá produzir extensões de 
fitas simples (ssDNA)
Os fragmentos de ssDNA irão invadir a fita não 
danificada.
REPARO DE DANOS AO DNA
RECOMBINAÇÃO
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Ocorre a formação da junção Holliday entre as fitas 
As pontas 3’ terminais irão servir de iniciadores para 
a síntese complementar da região lesada, utilizando a 
fita intácta como padrão. 
A extremidade é então assimilada ao restante da fita, reparando 
a região danificada. 
REPARO DE DANOS AO DNA
RECOMBINAÇÃO
REPARO DE DANOS CELULARES AO DNA 19
O DNA danificado pode 
prosseguir para 
replicação antes de ser 
reparado
Formação de dímeros 
DNA danificado pelo dímero de pirimidina; Forma fita com lacuna ao ser replicada
REPARO DE DANOS AO DNA
RECOMBINAÇÃO
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A fita irmã, com a lacuna, pode ser facilmente
reparada, utilizando a fita complementar intacta.
Com a recombinação completa, a maquinaria celular terá outra chance de reparo.
O DNA intacto doa o fragmento ausênte na fita
danificada. Intermpediado pelas Ku proteínas;
REPARO DE DANOS AO DNA
TRANSLEÇÃO
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Algumas lesões obstruem a DNA-Polimerase
impedindo que a mesma continue a replicação 
O mecanismo de translesão permitirá que a maquinaria dereplicação atravesse essa região, prosseguindo a replicação. 
Sem replicação, a célula tem sua funcionalidade 
comprometida. 
REPARO DE DANOS AO DNA
TRANSLEÇÃO
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A DNA-Pol impedida de seguir com a
replicação deixa a fita parental;
DNA-Pol Y “força” a replicação da nova fita;
Mecanismo de reparo para situações críticas.
Fanconi anemia
Causa: mutações nos genes reguladores
da remoção de crosslinks entre as fitas de
DNA
Sintomas: pequena estatura, anomalias
na pele, olhos, fígado, articulações e no
sistema endócrino, alta incidência de
leucemia mieloide aguda, incapacidade de
produção de células sanguíneas
Expectativa de vida: cerca de 30 anos
Incidência: 1 em 160000 hab.
DEFICIÊNCIAS NO SISTEMA DE REPARO DE DANOS
REPARO DE DANOS CELULARES AO DNA 23
Ataxia-telangiectasia
Causa: defeito no gene responsável
pela resposta das células à quebra de fitas
duplas do DNA
Sintomas: problemas de motricidade e
coordenação, crescimento físico lento mas
com sinais de envelhecimento precoce,
dilatação de capilares sanguíneos,
predisposição à infecção e câncer
Expectativa de vida: cerca de 25 anos
Incidência: 1 em 40000 a 10000 hab.
Xeroderma pigmentosum
Causa: defeito nas enzimas que atuam no
reparo por excisão de nucleotídeo, levando
à sensibilidade à radiação UV
Sintomas: bolhas e manchas na pele,
envelhecimento prematuro, cegueira,
retardo intelectual e de desenvolvimento,
perda de audição, alta susceptibilidade a
diversos tipos de câncer de pele
Expectativa de vida: de 20 a 40 anos
Incidência: 1 em 50000 a 100000 hab.
REFERÊNCIAS
Campbell, M.K.; Farrell, S.O. Biochemistry. 6th ed., Thomson Brooks/Cole, 838p., 2009.
Lodish, H.; Berk, A.; Marsudaira, P.; Kaiser, C.A.; Krieger, M.; Scott, M.P.; Zipursky, L. Molecular cell biology. 4th
ed., W. H. Freeman, 1184p., 1999.
Mathews, L.A.; Cabarcas, S.M.; Hurt, E.M. DNA Repair of cancer stem cells. 1st ed., Springer, 176p., 2013.
Nelson, D.L.; Cox, M.M. Principles of biochemistry. 4th ed., W. H. Freeman, 1125p., 2004.
Voet, D.; Voet, J.G. Biochemistry. 4th ed., John Wiley & Sons, 1515p., 2011.
Watson, J.D.; Baker, T.A.; Bell, S.P.; Gann, A.; Levine, M.; Losick, R.; Harrison, S.C. Molecular biology of the
gene. 7th ed., Pearson, 911p., 2014.
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Obrigado!