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Autoras: Profa. Luciana Mantzouranis Profa. Raquel Bagattini Colaboradoras: Profa. Fernanda Torello de Mello Profa. Laura Cristina da Cruz Dominciano Biologia Molecular CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 Professoras conteudistas: Luciana Mantzouranis / Raquel Bagattini Luciana Mantzouranis Formou-se em Química pela Universidade de São Paulo em 2003. É licenciada em Química pelas Faculdades Oswaldo Cruz, onde formou-se em 2012. Fez doutorado em Ciências na área de Bioquímica, pela Universidade de São Paulo e obteve o título em 2009, ano no qual começou a atuar na docência universitária como professora titular da Universidade Paulista – UNIP, em São Paulo. Desde 2014 atua como professora conteudista no curso de educação a distância da UNIP, sendo responsável pelas disciplinas de Química e Bioquímica. Leciona nas áreas de Química, Bioquímica e Biologia Molecular. Raquel Bagattini Formou-se em Odontologia pela Universidade de Mogi das Cruzes em 1993 e concluiu licenciatura em Ciências Biológicas pela Universidade Metropolitana de Santos em 2013. Fez doutorado em Ciências na área de Bioquímica, pela Universidade de São Paulo e obteve o título em 2005. Em 2004 começou a atuar na docência universitária como professora titular da Universidade Paulista – UNIP, em São Paulo. Leciona nas áreas de Bioquímica e Biologia Molecular. © Todos os direitos reservados. Nenhuma parte desta obra pode ser reproduzida ou transmitida por qualquer forma e/ou quaisquer meios (eletrônico, incluindo fotocópia e gravação) ou arquivada em qualquer sistema ou banco de dados sem permissão escrita da Universidade Paulista. Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) M293b Mantzouranis, Luciana. Biologia molecular. / Luciana Mantzouranis, Raquel Bagattini. – São Paulo: Editora Sol, 2016. 100 p., il. Nota: este volume está publicado nos Cadernos de Estudos e Pesquisas da UNIP, Série Didática, ano XXII, n. 2-008/16, ISSN 1517-9230. 1. Biologia molecular. 2. Mutação. 3.Expressão gênica. I. Bagattini, Raquel. II. Título. CDU 576.3 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 Prof. Dr. João Carlos Di Genio Reitor Prof. Fábio Romeu de Carvalho Vice-Reitor de Planejamento, Administração e Finanças Profa. Melânia Dalla Torre Vice-Reitora de Unidades Universitárias Prof. Dr. Yugo Okida Vice-Reitor de Pós-Graduação e Pesquisa Profa. Dra. Marília Ancona-Lopez Vice-Reitora de Graduação Unip Interativa – EaD Profa. Elisabete Brihy Prof. Marcelo Souza Prof. Dr. Luiz Felipe Scabar Prof. Ivan Daliberto Frugoli Material Didático – EaD Comissão editorial: Dra. Angélica L. Carlini (UNIP) Dra. Divane Alves da Silva (UNIP) Dr. Ivan Dias da Motta (CESUMAR) Dra. Kátia Mosorov Alonso (UFMT) Dra. Valéria de Carvalho (UNIP) Apoio: Profa. Cláudia Regina Baptista – EaD Profa. Betisa Malaman – Comissão de Qualificação e Avaliação de Cursos Projeto gráfico: Prof. Alexandre Ponzetto Revisão: Virgínia Bilatto Giovanna Oliveira CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 Sumário Biologia Molecular APRESENTAÇÃO ......................................................................................................................................................7 INTRODUÇÃO ...........................................................................................................................................................7 Unidade I 1 ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS .......................................................................................................9 1.1 Nucleotídeos........................................................................................................................................... 10 1.2 Estrutura dos ácidos nucleicos ....................................................................................................... 18 1.3 Propriedades das bases nitrogenadas .......................................................................................... 20 1.4 Desnaturação e renaturação .......................................................................................................... 22 2 EVIDÊNCIAS DE QUE O DNA ARMAZENA A INFORMAÇÃO GENÉTICA ...................................... 23 3 ORGANIZAÇÃO GÊNICA DE PROCARIOTOS E EUCARIOTOS ........................................................... 27 3.1 Empacotamento do DNA eucariótico .......................................................................................... 30 4 REPLICAÇÃO ...................................................................................................................................................... 31 4.1 A replicação é semiconservativa .................................................................................................... 32 4.2 Origem de replicação .......................................................................................................................... 33 4.3 O DNA é sintetizado no sentido 5’ → 3’ ..................................................................................... 35 4.4 Moléculas importantes para a replicação .................................................................................. 37 4.4.1 Nucleases ................................................................................................................................................... 37 4.4.2 DNA polimerase ...................................................................................................................................... 37 4.4.3 Proteínas necessárias para a separação das fitas ...................................................................... 39 4.4.4 DNA topoisomerases ............................................................................................................................. 39 4.4.5 Primase ........................................................................................................................................................ 40 4.4.6 DNA ligase ................................................................................................................................................. 41 Unidade II 5 MUTAÇÃO .......................................................................................................................................................... 45 5.1 Mutações pontuais .............................................................................................................................. 45 5.2 Mutações induzidas ............................................................................................................................ 49 5.2.1 Agentes físicos ......................................................................................................................................... 49 5.2.2 Agentes químicos ................................................................................................................................... 49 5.3 Efeitos da mutação .............................................................................................................................. 50 6 REPARO ............................................................................................................................................................... 50 6.1 Principais tipos de reparos ................................................................................................................ 51 6.1.1 Reparo de despareamento .................................................................................................................. 51 CB IO -R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 6.1.2 Reparo por excisão de base ................................................................................................................ 55 6.1.3 Reparo por excisão de nucleotídeos ............................................................................................... 56 6.1.4 Reparo direto ............................................................................................................................................ 58 6.2 Recombinação genética .................................................................................................................... 59 Unidade III 7 TRANSCRIÇÃO DO RNA ................................................................................................................................ 64 7.1 Estrutura do RNA ................................................................................................................................ 64 7.2 Uma das fitas da dupla fita do DNA é usada como molde ................................................. 65 7.3 Transcrição em procariotos .............................................................................................................. 66 7.3.1 Início do processo de transcrição em procariotos ..................................................................... 67 7.3.2 Alongamento ............................................................................................................................................ 69 7.3.3 Término do processo de transcrição ............................................................................................... 70 7.4 Transcrição em eucariotos ................................................................................................................ 72 7.4.1 Início da transcrição em eucariotos ................................................................................................ 73 7.4.2 Alongamento, término e processamento do RNA .................................................................... 74 8 TRADUÇÃO E CONTROLE DA EXPRESSÃO GÊNICA ............................................................................ 77 8.1 Código genético .................................................................................................................................... 77 8.2 Síntese de proteínas ............................................................................................................................ 79 8.2.1 Início da tradução ................................................................................................................................... 81 8.2.2 Alongamento ............................................................................................................................................ 83 8.3 Controle da expressão gênica em procariotos ......................................................................... 85 8.3.1 Controle negativo da transcrição ..................................................................................................... 87 8.3.2 Controle positivo da transcrição ...................................................................................................... 88 7 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 APRESENTAÇÃO Esta disciplina tem como objetivo geral fornecer conhecimentos a respeito da estrutura química dos ácidos nucleicos bem como compreender o funcionamento molecular da célula através do conhecimento básico dos processos moleculares como replicação, transcrição e tradução. Ao término deste curso, o aluno terá uma ampla visão dos princípios gerais da Biologia celular e molecular e compreenderá os mecanismos moleculares que regem a função celular normal bem como as alterações patológicas. Todos esses assuntos são de extrema importância para a vida profissional de um biológo, visto que várias pesquisas atuais como sequenciamento do genoma, terapia gênica, clonagem, transgênicos dentre outros assuntos dependem do conhecimento abordado nesse livro-texto. INTRODUÇÃO Você já aprendeu que o DNA é replicado, transcrito formando uma molécula de RNA mensageiro e traduzido formando uma proteína. Nesta disciplina, esses processos serão retomados, mas com um aprofundamento maior. Leia atentamente e veja se você já se fez alguma dessas perguntas: qual a enzima que catalisa o processo de síntese do DNA? Existem outras enzimas envolvidas nesse processo? Em qual sequência a replicação começa? Será que é aleatório? As duas fitas de DNA são copiadas ao mesmo tempo? Pode haver erros no processo de síntese de DNA? Todo o RNA mensageiro é transformado em proteína? Quais enzimas sintetizam o RNA? E a proteína? Se diferentes genes são expressos em diferentes tecidos e em diferentes situações, como é feito esse controle? Como a mensagem do RNA é transformada em proteína? Todas essas questões, que devem ter aguçado sua curiosidade, serão abordadas durante o percurso de nossos estudos. Vamos aprender sobre a estrutura dos ácidos nucleicos, DNA e RNA, ou seja, você verá quais são os átomos que compõem essas moléculas e como esses átomos estão organizados para formá-las. Serão apresentadas também as propriedades dos ácidos nucleicos, como desnaturação e renaturação, e outra propriedade muito importante, que é a replicação, o processo no qual uma molécula de DNA é produzida a partir de uma fita molde DNA. Serão estudados também os processos de mutação, reparo e recombinação e, por fim, veremos como se dão os processos de transcrição, tradução e do controle da expressão gênica. 9 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 BIOLOGIA MOLECULAR Unidade I 1 ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS Os nucleotídeos possuem uma variedade de funções, dentre elas: • são a energia nos processos metabólicos na forma de ATP (adenosina trifosfato); • participam da resposta das células aos hormônios e outros estímulos extracelulares; • são componentes de cofatores enzimáticos; • são os constituintes dos ácidos nucleicos: DNA e RNA. Essa última função será analisada mais detalhadamente nessa unidade. Os ácidos nucleicos são uma classe de moléculas que compreendem o DNA (ácido desoxirribonucleico) e o RNA (ácido ribonucleico). Essas moléculas são biopolímeros constituídos por nucleotídeos, ou seja, os ácidos nucleicos são moléculas grandes formadas pela união de vários nucleotídeos, que são os monômeros (figura a seguir). Nucleotídeo Ácido nucleico Figura 1 – Representação esquemática de um ácido nucleico. Os ácidos nucleicos são formados pela união de nucleotídeos Os biopolímeros são polímeros produzidos naturalmente. Lembrete Na fase S do ciclo celular, ocorre o processo de síntese de DNA, chamado de replicação. O RNA é produzido através do processo de transcrição. 10 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 Unidade I Observação Existem também os polímeros sintéticos, como o polietileno, que está presente nas sacolas plásticas, e o poliestireno, presente em recipientes de isopor. Exemplo de Aplicação Em Bioquímica, são citados outros biopolímeros. Quais são eles? Relembre a estrutura e suas funções. 1.1 Nucleotídeos Os nucleotídeos são formados por um grupo fosfato (PO4 2-), uma pentose e uma base nitrogenada. A molécula formada pela união apenas da pentose com a base nitrogenada é denominada nucleosídeo (figura a seguir). Grupo fosfato Base nitrogenada Pentose Nucleosídeo Nucleotídeo Figura 2 – Representação esquemática deum nucleotídeo e de um nucleosídeo O nucleotídeo é formado por um grupo fosfato ( ), por uma pentose ( ) e uma base nitrogenada ( ). O nucleosídeo é formado apenas por pentose e base nitrogenada. As bases nitrogenadas são classificadas em purinas e pirimidinas. As bases purinas são a adenina (A) e a guanina (G), essas bases possuem dois anéis na sua estrutura; as bases pirimidinas são citosina (C), timina (T) e uracila (U), essas bases são formadas por apenas um anel (figuras 3 e 4). H N N N NNN pirimidina purina Figura 3 – Estrutura geral das purinas e pirimidinas. As purinas possuem dois anéis e as pirimidinas possuem apenas um anel 11 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 BIOLOGIA MOLECULAR N N N N H N N H H N O O O N N N NH H H NH2 NH2 H3C NH2 NH2 Purinas Pirimidinas adenina (A) timina (T) guanina (G) uracila (U) cilosina (C) H HH H N N N O O H H H H H H Figura 4 – Bases nitrogenadas purina e pirimidina. As purinas são adenina e guanina e as pirimidinas são timina, citosina e uracila As bases nitrogenadas encontradas na molécula de DNA são A, T, C e G, e as bases nitrogenadas encontradas na molécula de RNA são A, U, C e G. Essa é uma diferença importante entre a molécula de DNA e RNA. Outra diferença existente entre as moléculas de DNA e RNA é a pentose; a pentose presente no RNA é a ribose, a qual possui um grupo - OH na posição 2’; e a pentose presente no DNA é a desoxirribose, a qual possui um átomo de hidrogênio nessa mesma posição (figura a seguir). 12 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 Unidade I B)A) HOHO HH HH HH OO 3’3’ 4’4’ 2’ 2’ 1’ 5’5’ CH2CH2 HOH OHOH OHOH HH Figura 5 – Pentoses. A) Ribose, presença de um grupo – OH na posição 2’; B) Desoxirribose, presença de um átomo de hidrogênio na posição 2’ Observação O prefixo “desoxi” indica a falta de um átomo de oxigênio em relação ao composto original, que é a ribose. No sequenciamento do DNA, baseado no método de Sanger, são utilizadas moléculas chamadas didesoxirribonucleotídeos, as quais não têm oxigênio nas posições 2’ e 3’. Observe na figura 4 que a numeração dos átomos da pentose recebe o apóstrofo para diferenciá-la da numeração dos átomos das bases nitrogenadas. Como visto anteriormente, a molécula formada pela união entre um grupo fosfato, uma pentose e uma base nitrogenada é denominada nucleotídeo; e a molécula formada pela união apenas da pentose com a base nitrogenada é denominada nucleosídeo. Dependendo da pentose e da base nitrogenada constituintes dos nucleosídeos e dos nucleotídeos, elas adquirem uma nomenclatura. Essa nomenclatura está resumida do quadro a seguir. Quadro 1 – Nomenclatura de nucleotídeos e nucleosídeos Base Nucleosídeo Nucleotídeo Ácido nucleico Purinas Adenina Adenosina Adenilato RNA Desoxiadenosina Desoxiadenilato DNA Guanina Guanosina Guanilato RNA Desoxiguanosina Desoxiguanilato DNA Piramidinas Citosina Citidina Citidalato RNA Desoxicitidina Desoxicitidalato DNA Timina Timidina ou desoxitimidina Timidilato ou desoxitimidilato DNA Uracila Uridina Uridilato RNA 13 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 BIOLOGIA MOLECULAR Os nucleotídeos que possuem desoxirribose como pentose são chamados de desoxirribonucleotídeos, e os nucleotídeos que possuem ribose como pentose são chamados ribonucleotídeos. A figura a seguir mostra as estruturas dos desoxirribonucleotídeos, e a figura 7 mostra as estruturas dos ribonucleotídeos. A) C) B) D) Figura 6 – Desoxirribonucleotídeos. A) Desoxiadenilato, desoxiadenosina 5’-monofosfato, A, dA ou dAMP; B) Desoxiguanilato, desoxiguanosina 5’-monofosfato, G, dG, dGMP; C) Desoxitimidilato, desoxitimidina 5’-monofosfato, T, dT ou dTMP; D) Desoxicitidilato, desoxicitidina 5’-monofosfato, C, dC ou dCMP 14 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 Unidade I A) C) B) D) Figura 7 – Ribonucleotídeos. A) Adenilato, adenosina 5’-monofosfato, A, AMP; B) Guanilato, guanosina 5’-monofosfato, G, GMP; C) Uridilato, uridina 5’-monofosfato, U, UMP. D) Citidilato, citidina 5’-monofosfato, C, CMP Tanto o DNA quanto o RNA possuem bases modificadas em pequena quantidade. A modificação mais comum no DNA é a metilação, ou seja, adição do grupo metil (– CH3). De maneira geral, essas modificações estão envolvidas na regulação e na proteção da informação genética. No RNA existem diversos tipos de bases minoritárias, principalmente no RNA transportador (tRNA). A ligação que une a base nitrogenada à pentose é uma ligação N-β-glicosídica, que ocorre entre o carbono 1’ da pentose e o N-1 das pirimidinas e pelo N-9 das purinas. A ligação N-β-glicosídica é formada pela reação entre um grupo – OH da pentose e o hidrogênio da base. O grupo fosfato está esterificado na posição 5’ da pentose. 15 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 BIOLOGIA MOLECULAR A ligação entre os nucleotídeos sucessivos, tanto no DNA quanto no RNA, ocorre entre o grupo - OH da posição 3’ e o grupo fosfato da posição 5’. Essa ligação é denominada ligação fosfodiéster (figura a seguir). Adenina Timina Ligação fosfodiéster Figura 8 – Ligação fosfodiéster – a ligação que une dois nucleotídeos consecutivos O esqueleto dos ácidos nucleicos é constituído por grupos fosfatos e pentoses alternados. As bases nitrogenadas aparecem em intervalos regulares (figura a seguir). 16 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 Unidade I Adenina Timina Citosina Guanina Adenina Citosina Guanina Uracila A) B) Figura 9 – Estrutura em cadeia dos ácidos nucleicos. A) DNA; B) RNA 17 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 BIOLOGIA MOLECULAR Lembrete A molécula de DNA possui como pentose a desoxirribose, e a molécula de RNA possui a ribose. A timina é constituinte apenas da molécula de DNA e a uracila é constituinte apenas da molécula de RNA. Observe na figura anterior que tanto na molécula de DNA quanto na de RNA existe uma parte da molécula que é invariável, o fosfato e a pentose, e uma parte que é variável, as bases nitrogenadas. Por esse motivo, as sequências das moléculas de DNA e RNA são frequentemente representadas apenas pela sequência das bases nitrogenadas. Observe também na figura anterior que o grupo fosfato é carregado negativamente. Essa característica é observada em pH = 7,0 e essas cargas, geralmente, estão neutralizadas por proteínas ou íons metálicos. Os esqueletos do DNA e do RNA são hidrofílicos. Os grupos – OH dos resíduos de pentose formam ligações de hidrogênio com a água. As moléculas de DNA e RNA possuem duas extremidades. Uma das extremidades possui um grupo fosfato livre, o qual está ligado ao carbono 5’ e, por isso, essa extremidade é denominada 5’. A outra extremidade possui um grupo – OH livre, o qual está ligado ao carbono 3’ e, por isso, essa extremidade é denominada 3’. Portanto, os ácidos nucleicos possuem uma extremidade 5’ e uma extremidade 3’, essas extremidades possuem um grupo fosfato e um grupo hidroxila livres, respectivamente (figura a seguir).Extremidade 5’ Extremidade 3’ Guanina Timina Figura 10 – Extremidades do DNA. O DNA possui uma extremidade 5’, a qual possui um grupo fosfato livre, e uma extremidade 3’, a qual possui um grupo – OH livre 18 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 Unidade I As sequências de ácidos nucleicos são representadas, por convenção, da extremidade 5’ para a 3’. Na sequência ACCTG, o grupo fosfato livre está no desoxiadenilato, e o grupo hidroxila livre está no desoguanilato. Observação As sequências ACCTG e GTCCA são diferentes. Em condições alcalinas, o RNA é hidrolisado facilmente, enquanto o DNA não. Essa característica está associada à presença do grupo – OH na posição 2’. Polímeros contendo 50 ou menos nucleotídeos são chamados de oligonucleotídeos, e um ácido nucleico maior é chamado de polinucleotídeo. 1.2 Estrutura dos ácidos nucleicos A estrutura tridimensional do DNA foi descoberta em 1953 por James Watson e Francis Crick. Um trabalho que contribuiu muito para desvendar a estrutura do DNA foi o de Erwin Chargaff e seus colaboradores nas últimas décadas de 1940. Eles estudaram um grande número de espécies e chegaram às seguintes conclusões: • espécies diferentes possuem diferentes quantidades de bases nitrogenadas; • amostras da mesma espécie, mas de diferentes tecidos, apresentam a mesma quantidade de bases nitrogenadas; • a composição de bases do DNA não é alterada pela idade, pelo estado nutricional ou por modificação ambiental; • em todas as amostras analisadas, a quantidade de resíduos de adenosina é igual à quantidade de resíduos de timidina, e a quantidade de resíduos de guanosina é igual à quantidade de resíduos de citidina. Essas conclusões são chamadas regras de Chargaff. Saiba mais Para conhecer todos os pesquisadores envolvidos com a descoberta do DNA, leia: THIEMAN, O. H. A descoberta da estrutura do DNA: de Mendel a Watson e Crick. Química Nova na Escola, n. 17, maio 2003. 19 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 BIOLOGIA MOLECULAR Em 1950, Rosalind Franklin e Maurice Wilkins usaram o método de difração de raio X para analisar cristais de DNA, observando um padrão característico. Com esse experimento, puderam deduzir que os polímeros de DNA são helicoidais. Em 1953, Watson e Crick reuniram as informações já disponíveis e propuseram uma estrutura tridimensional para a molécula de DNA. Esse modelo propõe que: • duas cadeias polinucleotídicas estão enroladas em torno de um eixo, formando uma dupla hélice que gira no sentido da mão direita; • as bases nitrogenadas estão empilhadas na parte interna da molécula; • o esqueleto da molécula, fosfato e pentose, está na parte externa da molécula; • o pareamento das duas fitas cria um sulco principal (maior) e um sulco secundário (menor) na superfície da molécula; • o plano das bases é perpendicular ao eixo da hélice; • as bases de uma fita estão pareadas no mesmo plano das bases da outra fita; • as cadeias polinucleotídicas são unidas por ligações de hidrogênio, nas quais adenina pareia com timina e guanina pareia com citosina; Observação Esse postulado explica os experimentos de Chargaff, por meio dos quais ele observou que as quantidades de adenina e timina e de citosina e guanina eram iguais. • as cadeias polinucleotídicas estão em sentidos opostos, ou seja, elas são antiparalelas; • o diâmetro da hélice é de 20 Å e as bases são separadas por 3,4 Å. 20 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 Unidade I A figura a seguir ilustra algumas características. sulco menor Esqueleto pentose-fosfato sulco maior 5’ 5’ C G A T G C C T A T G A T T A C A G G G C C A C T G G C 3’ 3’ Figura 11 – Características estruturais do DNA propostas por Watson e Crick em 1953 Na figura, é possível observar a dupla hélice, o esqueleto pentose-fosfato na parte externa da molécula, as bases nitrogenadas na parte interna e perpendicular ao eixo da hélice, o sulco maior e o sulco menor, e o pareamento entre as bases no mesmo plano, o pareamento entre adenina e timina e entre citosina e guanina e as fitas antiparalelas. Saiba mais A revista Fapesp publicou uma edição especial sobre os 50 anos da descoberta da estrutura do DNA, acesse: PESQUISA FAPESP, ed. especial Dupla Hélice 50 Anos, abr. 2003. Disponível em: <http://revistapesquisa.fapesp.br/2003/04/01/folheie-o- especial-dupla-helice-50-anos/>. Acesso em: 15 dez. 2015. 1.3 Propriedades das bases nitrogenadas As bases purinas e pirimidinas são fracamente básicas. As bases nitrogenadas possuem estruturas ressonantes, o que confere às ligações o caráter parcial de dupla ligação, essa característica dá às 21 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 BIOLOGIA MOLECULAR bases nitrogenadas a capacidade de absorver luz. Os ácidos nucleicos são caracterizados por uma forte absorção nos comprimentos de onda próximos do 260nm. As bases nitrogenadas são insolúveis em água no pH próximo da neutralidade. Em pH ácido ou básico, as bases nitrogenadas tornam-se carregadas e, portanto, aumentam a sua solubilidade. Nas moléculas de ácidos nucleicos, as bases nitrogenadas estão dispostas de maneira que os anéis das bases fiquem um embaixo de outro e paralelos, como moedas empilhadas. Essa disposição das bases nitrogenadas permite a interação entre as bases chamada de interação de empilhamento, a qual é importante para minimizar o contato das bases com a água e para estabilizar a estrutura terciária. Além das interações de empilhamento, ocorrem as ligações de hidrogênio, as quais acontecem entre duas bases nitrogenadas. Essas interações ocorrem entre os grupos amino e carboxila das bases nitrogenadas, permitindo a associação de duas fitas na molécula de DNA. Ocorrem duas ligações entre adenina e timina e três ligações entre citosina e guanina (figura a seguir). Figura 12 – Ligações de hidrogênio entre as bases nitrogenadas. A união entre A e T ocorre através de duas ligações de hidrogênio e a união entre C e G ocorre através de três ligações de hidrogênio Saiba mais Esses padrões de ligações foram definidos por Watson e Crick em 1953. Consulte: NELSON, D. L.; COX, M. Lehninger: princípios de bioquímica. 3. ed. São Paulo: Sarvier, 2002. 22 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 Unidade I 1.4 Desnaturação e renaturação Tanto a dupla hélice do DNA quanto o RNA sofrem desnaturação quando submetidos a extremos de pH ou temperaturas elevadas. Lembrete Essas condições também causam desnaturação em proteínas. A desnaturação é causada pela quebra das ligações de hidrogênio, provocando o desenrolamento da dupla hélice e a formação de duas duplas fitas. A desnaturação pode ser total, ou seja, pode ocorrer em toda a extensão da molécula, ou em parte da molécula. Observação As ligações fosfodiéster são ligações mais fortes quando comparadas às ligações de hidrogênio e nessas condições não são quebradas. Nenhuma ligação covalente é quebrada. Caso as condições originais sejam restabelecidas, as ligações voltam a ser formar e esse processo é conhecido como renaturação ou anelamento (figura a seguir). Dupla hélice de DNA DNA parcialmente desnaturado Assocação das fitas por pareamento das bases Anelamento Desnaturação Fitasde DNA separadas, com alças aleatórias Separação das fitas Figura 13 – Desnaturação e renaturação da molécula de DNA 23 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 BIOLOGIA MOLECULAR O processo de renaturação ocorre em duas etapas. Na primeira etapa, as duas fitas devem se encontrar e formar um segmento de fita dupla; na segunda etapa, as bases remanescentes são aneladas. A primeira etapa é lenta e a segunda etapa é rápida. Quando o DNA está como dupla hélice, as bases estão empilhadas no interior da molécula e, como as bases são responsáveis por absorver luz, a luz absorvida é menor. Esse efeito é chamado de hipocrômico. Quando o DNA sofre um processo de desnaturação, com a abertura das fitas, as bases ficam mais expostas e, portanto, absorvem mais luz, esse efeito é chamado hipercrômico. Cada molécula possui uma temperatura diferente de desnaturação dependendo da sua constituição de bases. A temperatura utilizada para comparar a desnaturação é a Tm, temperatura de melting ou temperatura de fusão. A Tm é a temperatura na qual 50% das moléculas sofreram desnaturação. Quanto maior a %GC maior a Tm. 2 EVIDÊNCIAS DE QUE O DNA ARMAZENA A INFORMAÇÃO GENÉTICA Em 1868, Friedrich Miescher isolou, de células de pus, uma substância contendo fósforo. Essa substância foi chamada de nucleína. Posteriormente, ele descobriu que a nucleína continha uma porção ácida e uma porção básica. Hoje, sabe-se que a porção básica é composta por proteínas e a porção ácida é composta pelo DNA. Os pesquisadores da época suspeitavam que a nucleína estava ligada à herança celular. Segue o relato de dois experimentos que foram importantes para a identificação de qual molécula é a possuidora da informação genética. Em 1928, Fred Griffith fez um experimento em que ele inoculou em camundongos uma mistura de pneumococos não patogênicos com penumococos patogênicos mortos pelo calor. As bactérias patogênicas possuem uma cápsula, a qual é responsável pela sua patogenicidade. Essa bactéria provoca pneumonia. As bactérias mutantes que não possuem essa cápsula não são patogênicas. As bactérias não patogênicas e as bactérias patogênicas mortas pelo calor não causam a doença quando administradas isoladamente, porém, quando administradas em conjunto, causaram a morte de um camundongo. Além disso, quando o sangue desse camundongo morto foi isolado, viu-se que continha pneumococos patogênicos vivos. A conclusão desse experimento foi que de alguma maneira o pneumococo patogênico morto havia transformado o pneumococo não patogênico em patogênico e, portanto, havia alguma molécula que causava essa transformação. Essa molécula foi chamada de princípio transformante (figura a seguir). 24 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 Unidade I Injeção Bactéria virulenta, encapsulada, viva Bactéria não virulenta, não-encapsulada, viva Bactéria virulenta, morta pelo calor Calor Mistura de bactéria não-virulenta, viva e bactéria virulenta morta pelo calor Bactéria virulenta, encapsulada, viva Bactéria não- virulenta, não- encapsulada, viva Camundongo morre Camundongo Vive Camundongo Vive Camundongo Morre A) B) C) D) Bactéria virulenta morta pelo calor Figura 14 – Experimento de Griffith. A) A bactéria encapsulada é letal para o camundongo; B) A cepa não encapsulada é inócua; C) A bactéria encapsulada morta pelo calor é inócua; D) A mistura de bactéria não encapsulada com bactéria encapsulada morta pelo calor é letal 25 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 BIOLOGIA MOLECULAR A busca então era pela natureza química do princípio transformante. Em 1944, Oswald Avery, Colin MacLeod e Maclyn McCarty fizeram vários experimentos para desvendar a natureza química do princípio transformante. Esses experimentos resultaram nas seguintes observações: • a atividade transformante não era perdida pela extração das proteínas e dos lipídeos; • tratamento com tripsina e quimiotripsina, enzimas que hidrolisam ligações peptídicas, não afetam a atividade transformante; • tratamento com ribonuclease, enzima que degrada RNA, não tem efeito sobre o princípio transformante; • tratamento com desoxirribonuclease, enzima que degrada DNA, provoca a perda da atividade transformante. Esses experimentos mostram que a informação genética está relacionada à molécula de DNA. O outro experimento importante para a descoberta do papel genético do DNA foi realizado com vírus que infectam a bactéria E. coli. Esse vírus é formado, basicamente, por uma capa proteica, pela cauda e pelo material genético, o qual é DNA. Em 1951, Roger Herriott sugeriu que, no processo de infecção da bactéria pelo vírus, este não atinge a parte interna da bactéria, ele apenas injeta o DNA na bactéria. Em 1952, Alfred Hershey e Martha Chase fizeram experimentos para testar essa ideia. Em uma preparação de vírus, eles marcaram o DNA com 32P e, em outra preparação de vírus, eles marcaram a proteína com 35S. Observação As moléculas de DNA não contêm enxofre, e as moléculas de aminoácidos, constituintes das proteínas, não contêm fósforo, tornando essa marcação específica. Posteriormente, cada preparação de vírus foi incubada com bactérias. As bactérias infectadas foram centrifugadas, causando a separação dos vírus e das bactérias e a deposição das bactérias como precipitados. As bactérias infectadas com vírus marcados com 32P ficaram radioativas e as bactérias marcadas com 35S não apresentaram radioatividade. Esses resultados mostram que é o DNA que entra nas bactérias, e não as proteínas (figura a seguir). 26 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 Unidade I Célula bacteriana Injação Tratamento com o homogeneizador separa as cabeças virais Separação por centrifugação Fago Capa não radioativa Capa radioativa DNA radioativo Não radioativo Não radioativo Radioativo Radioativo DNA não radioativo Figura 15 – O experimento de Hershey-Chase. Em duas preparações de vírus, uma foi marcada no DNA com 32P, e a outra foi marcada nas proteínas com 35S. As bactérias foram infectadas com os vírus e depois foram separadas. As bactérias que foram incubadas com o vírus marcado no DNA ficaram radioativas, e as outras não 27 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 BIOLOGIA MOLECULAR 3 ORGANIZAÇÃO GÊNICA DE PROCARIOTOS E EUCARIOTOS O genoma celular é formado por moléculas de DNA, as quais ficam empacotadas em estruturas chamadas de cromossomos. As moléculas de DNA são formadas por genes e por regiões intergênicas. As bactérias e os vírus possuem, geralmente, um cromossomo, enquanto as células eucarióticas possuem vários cromossomos. O conceito de gene evoluiu com o passar do tempo, antigamente gene era considerado um segmento de DNA que codifica uma enzima, posteriormente observou-se que nem todas as moléculas formadas apresentavam função enzimática, e então denominou-se gene um segmento de DNA que codifica uma proteína. Com a descoberta de que algumas proteínas são formadas por mais de uma cadeia polipeptídica como, por exemplo, a hemoglobina, a qual é formada por duas cadeias a e duas cadeias β, as quais são formadas por genes diferentes. O gene passou a ser denominado como um segmento de DNA que codifica uma cadeia polipeptídica. Porém essa definição de gene – umacadeia polipeptídica – ainda não era suficiente, pois existem segmentos de DNA que formam os RNAs ribossômicos, os RNAs transportadores e as ribozimas, sendo que esses não precisam ser transformados em proteínas para exercerem sua função. Lembrete As ribozimas são moléculas de RNA que atuam como enzimas, ou seja, atuam como catalisadores de reações químicas. A definição de gene aceita atualmente é: gene é todo segmento de DNA que produz uma sequência de algum produto gênico final, o qual pode ser uma cadeia polipeptídica ou um RNA com função estrutural ou enzimática. Porém, como já foi dito, o DNA não é formado apenas por genes, ele também é formado por sequências intergênicas que possuem função regulatória, podendo indicar a origem para replicação ou transcrição, por exemplo. As bactérias possuem, normalmente, um único cromossomo, sendo que esse cromossomo é circular. Nos cromossomos bacterianos, a maioria dos genes apresentam-se em uma única cópia; alguns genes estruturais, como genes que codificam o RNA ribossômico, apresentam-se em mais cópias. Grande parte do DNA do cromossomo bacteriano corresponde a genes reguladores e estruturais. Quase todo gene procariótico é colinear com o RNA e a proteína, ou seja, todo o segmento que corresponde ao gene é transcrito em RNA e traduzido em proteína (figura a seguir). 28 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 Unidade I DNA mRNA Polipetídeo 5’ C G T G G A T A C A C T T T T G C C G T T T C T 3’ 5’ C G U G G A U A C A C U U U U G C C G U U U C U 3’ Arg Gly Tyr Thr Phe Ala Val Ser 3’ G C A C C T A T G T G A A A A C G G C A A A G A 5’ amino - terminal carboxila - terminal Figura 16 – Colinearidade entre o DNA, o RNA mensageiro e a proteína formada em organismos procarióticos. Uma das fitas do DNA é utilizada como molde para a produção do RNA mensageiro, o qual é lido em trincas, as quais codificam um aminoácido As bactérias, além do DNA cromossômico presente nos nucleóides, apresentam uma ou mais moléculas de DNA circulares, que são chamadas de plasmídeos. Os plasmídeos são replicados de maneira independente da replicação dos cromossomos e são transmitidos para células-filhas. Alguns plasmídeos conferem vantagens para a célula, como a capacidade de ser resistente a certos antibióticos. Os plasmídeos bacterianos foram modificados em laboratório e são muito utilizados para a construção de moléculas de DNA recombinante. A organização dos cromossomos eucarióticos é muito mais complexa. Os cromossomos eucarióticos possuem centrômeros, os quais se ligam às proteínas do fuso mitótico durante a divisão celular. A ligação dos centrômeros com as proteínas do fuso mitótico é importante para a correta segregação dos cromossomos para as células filhas. Os centrômeros, geralmente, são constituídos por sequências repetitivas de uma ou mais sequências de 5 a 10 pb. As sequências altamente repetitivas são chamadas de DNA simples ou satélites. A denominação de satélite vem do fato de que essas sequências repetitivas fazem esse DNA migrar como bandas satélites, ou seja, separadas do restante do DNA. 29 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 BIOLOGIA MOLECULAR Essas sequências repetitivas são encontradas nos centrômeros, como explicado anteriormente, e também nos telômeros. Os telômeros são sequências que estão localizadas nas extremidades dos cromossomos eucarióticos e têm como função a estabilização do DNA. O número de repetições do telômero varia entre 20 e 100 para eucariotos unicelulares e mais de 1.500 para mamíferos. As sequências teloméricas não são copiadas no processo de replicação, elas são adicionadas pela enzima telomerase. Grande parte dos genes eucarióticos possui sequências que não codificam aminoácidos. Essas sequências são chamadas sequências intercaladas ou íntrons, e as sequências que codificam aminoácidos são chamadas de éxons. A presença das sequências intercaladas faz com que se perca a colinearidade entre o DNA e a proteína, como é visto nos genes bacterianos. Poucos genes procarióticos contêm íntrons. Existe uma grande variedade entre a quantidade de íntrons, o tamanho deles e a fração total do gene que ele ocupa. Seguem dois exemplos, o gene que codifica a proteína do ovo da galinha, a ovoalbumina e a subunidade β da hemoglobina. 1 1 2 2 3 4 5 6 7 8 3 B A A A) B) C D E F B G Éxon Íntron Figura 17 – Genes eucarióticos que possuem íntrons. A) Gene da ovoalbumina, possui 7 íntrons (A a G) e oito éxons (1 a 8); B) Subunidade β da hemoglobina, possui 2 íntrons (A e B) e três éxons (1 a 3) 30 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 Unidade I Nas células eucarióticas a mitocôndria e o cloroplasto possuem seu próprio DNA. Ambos são circulares e dupla fita. Nos procariotos, uma molécula de RNA mensageiro pode produzir uma ou mais cadeias polipeptídicas; já em eucariotos, na maioria dos casos, uma molécula de RNA mensageira codifica uma cadeia polipeptídica. Quando um RNA codifica um único produto gênico, ele é chamado de monocistônico, e quando um RNA codifica mais de um produto gênico ele é chamado de policistrônico (figura a seguir). gene 1 5’ 3’ 5’ 3’ A) B) gene 1 gene 2 gene 3 Figura 18 – Diferentes tipos de RNAs. A) Monocistrônico; B) Policistrônico 3.1 Empacotamento do DNA eucariótico Para que o DNA consiga permanecer dentro de uma célula, ele adquire uma estrutura altamente compacta. Esse empacotamento também regula o acesso à informação genética. Na forma de dupla hélice, o DNA é chamado de espiralado. O posterior espiralamento do DNA em torno do seu próprio eixo é chamado de DNA superespiralado. Em células eucarióticas, que não estão em divisão celular, o material genético aparece sob a forma de um material sem forma. Esse material é chamado de cromatina. A cromatina condensa-se quando as células se preparam para a divisão celular. Quando isso ocorre, o material genético adquire a forma de cromossomos. Cada espécie tem um número característico de cromossomos. A cromatina é formada por DNA, proteína e uma pequena quantidade de RNA. Dentre as proteínas encontradas na cromatina, existem a histonas, as quais empacotam o DNA em unidades estruturais chamadas nucleossomos; e as não histônicas, as quais estão envolvidas no controle da expressão gênica. As histonas, em pH fisiológico, estão carregadas positivamente devido ao seu alto conteúdo de lisina e arginina. 31 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 BIOLOGIA MOLECULAR Lembrete O DNA é uma molécula carregada negativamente. Cada nucleossomo é formado por oito moléculas de histonas, sendo duas cópias das histonas H2A, H2B, H3 e H4. Os espaçamentos entre os nucleossomos são de cerca de 50 pares de bases e, ao redor do núcleo, o DNA faz aproximadamente duas voltas. Os nucleossomos podem se organizar em polinucleossomos, assumindo uma forma de corda que é chamada de fibra de 30nm. Níveis adicionais de organização levam a estrutura cromossômica (figura a seguir). DNA Nucleossomo centrômero Filamento de cromatina compactado Filamento de cromatina distendido Região condensada do cromossomo Cromossomo mitótico 2 nm 11 nm 30 nm Figura 19 – Organização da cromatina 4 REPLICAÇÃO Uma das questões que intrigavam os cientistasera a capacidade de as células criarem cópias idênticas de si próprias. Para que isso acontecesse, a molécula responsável pela hereditariedade também deveria ser copiada. Em 1940, foi provado que a molécula responsável pela transmissão das características genéticas é o DNA, porém só depois da descoberta da estrutura do DNA foi possível descobrir o processo de duplicação da molécula de DNA. 32 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 Unidade I 4.1 A replicação é semiconservativa No modelo de Watson e Crick (apud NELSON; COX, 2002), as duplas fitas de DNA seguem uma regra de pareamento em que A se liga com T e C se liga com G. Watson e Crick propuseram que uma das fitas funcionava como molde para a síntese da nova fita, e essas duas fitas, ou seja, a fita parental e a fita recém-sintetizada, permaneceriam unidas. Portanto, nesse processo, as novas moléculas seriam formadas por uma fita parental (fita antiga) e uma fita nova, conservando, portanto, metade da molécula original e denominando-se replicação semiconservativa. A hipótese proposta por Watson e Crick, em 1953, foi testada por Matthew Meselson e Franklin Stahl, em 1957. Meselson e Stahl tinham duas possibilidades, ou replicação seria semiconservativa, processo explicado anteriormente, ou conservativa, em que as fitas novas seriam sintetizadas de maneira independente e depois seriam associadas e as antigas também voltariam a ficar aneladas. Meselson e Stahl (apud NELSON; COX, 2002) fizeram um experimento utilizando o conhecimento de que o 15N é mais pesado do que o nitrogênio mais abundante, o 14N. As moléculas de DNA contendo 15N possuem pesos diferentes das moléculas de DNA contendo 14N. A diferença é pequena, porém é possível observá-la no processo de centrifugação em um gradiente de densidade de cloreto de césio. Quando o DNA contendo 15N é centrifugado, observa-se uma banda mais densa do que quando o DNA contendo 14N é centrifugado (figura a seguir). DNA dupla fita contendo Gradiente de densidade de cloreto de césio 15N 14N Figura 20 – Diferença na centrifugação em cloreto de césio. Moléculas de DNA contendo 15N são mais densas do que bandas de DNA contendo 14N Meselson e Stahl cresceram bactérias E. coli por várias gerações em um meio contendo 15N como única fonte de nitrogênio, posteriormente transferiram as bactérias crescidas nesse para um meio contendo 14N e aguardaram até que as células duplicassem. Quando eles extraíram o DNA das bactérias obtidas e o submeteram ao processo de centrifugação, observaram o aparecimento de uma banda intermediária entre a banda formada por DNA constituído com 15N e DNA constituído com 14N, mostrando, então, que a nova molécula de DNA era formada por uma molécula híbrida, ou seja, uma molécula formada por DNA contendo 15N e uma formada por DNA contendo 14N. Esse resultado confirmava a hipótese de Watson e Crick de que a replicação é um processo semiconservativo (figura a seguir). 33 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 BIOLOGIA MOLECULAR Controles Análise do DNA Primeira geração Bactéria crescendo em meio contendo apenas 15N Transferência para o meio contendo apenas 14N Figura 21 – Experimento de Meselson e Stahl Observação A replicação é semiconservativa tanto em procariotos quanto em eucariotos. Você acha que com isso o processo da replicação foi totalmente desvendado? As dúvidas só estavam começando. Dentre elas, temos: • A replicação acontece em qualquer ponto? • Será que o DNA é totalmente desnaturado antes de a fita ser copiada? • A replicação ocorre em uma única direção ou em ambas direções? • As duas fitas são sintetizadas ao mesmo tempo? Cada fita é sintetizada por uma enzima? Vamos lá, ao longo do texto esses questionamentos serão respondidos. 4.2 Origem de replicação A região onde ocorre um evento de replicação é chamada de replicon. O replicon possui todos os elementos necessários para a replicação, possuindo uma origem de replicação e um término, onde a replicação é encerrada. Em células procarióticas, o genoma possui um único replicon, ou seja, todo cromossomo bacteriano é replicado de uma única vez. A divisão celular bacteriana ocorre 34 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 Unidade I através do desenvolvimento de um septo. A replicação ocorre uma única vez a cada divisão celular, sendo que esse tipo de controle é chamado de cópia única. Observação Os plasmídeos das bactérias constituem um replicon independente. O genoma eucariótico consiste de vários replicons. Os replicons são ativados uma única vez a cada ciclo celular, sendo assim, deve existir algum sinal para distinguir os replicons já ativados dos não ativados. Os replicons não são ativados simultaneamente, mas ainda não se conhece exatamente o mecanismo de ativação dos replicons. Não se sabe também se o padrão de ativação dos replicons se mantém a cada replicação. Será que todas as origens são ativadas em cada ciclo celular, ou algumas são silenciadas? Será que as origens são sempre ativadas na mesma ordem a cada ciclo celular? Algumas origens já foram identificadas em bactérias, leveduras, cloroplastos e mitocôndrias e uma característica observada foi a presença de sequências ricas em AT. A região do DNA onde ocorre a transição do DNA parental fita dupla para as novas fitas filhas é chamada de forquilha de replicação. A partir de cada origem formam-se duas forquilhas de replicação. A replicação do DNA é bidirecional tanto em procariotos quanto em eucariotos, pois duas forquilhas movem-se em ambos os sentidos (figura a seguir). Múltiplas origens de replicaçãoOrigens da replicação Abertura local da dupla-hélice Forquilha da replicação Forquilha da replicação Replicação contínua nos dois sentidos Bolha de replicação B)A) ++ ⇒⇒⇒⇒⇒⇒⇒⇒ Figura 22 – Origens e forquilhas de replicação. A) No DNA circular de organismos procarióticos existem apenas uma origem, e duas forquilhas de replicação movem-se em sentidos opostos, ou seja, de maneira bidirecional; B) Em organismos eucarióticos, existem várias origens e várias forquilhas de replicação, movendo-se de maneira bidimensional 35 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 BIOLOGIA MOLECULAR A origem melhor caracterizada é a oriC de E. coli. A região necessária para que ocorra a replicação foi definida como tendo 245pb. Em organismos procarióticos, a terminação está localizada em um sítio que se encontra do lado oposto da origem. O DNA não é totalmente desnaturado antes do processo de replicação, ele é desnaturado aos poucos, formando uma estrutura conhecida como olho da replicação. Em procariotos, a coordenação entre o ciclo celular e a replicação é feita através do processo de metilação – somente origens completamente metiladas podem iniciar o processo de replicação. Após a replicação do DNA, as fitas parentais estão metiladas, e as fitas recém-sintetizadas permanecem por um tempo sem metilação. Portanto, como as novas fitas de DNA são formadas por uma fita parental e uma fita nova, durante um período a fita nova não se encontra metilada e, portanto, o DNA encontra-se hemimetilado. Nessa condição, o DNA não pode ser replicado. Os sítios hemimetilados permanecem por 2/3 da geração de uma célula. A enzima Dam metilase é responsável por adicionar um grupo metil (- CH3) na adenina da sequência GATC. 4.3 O DNA é sintetizado no sentido 5’ → 3’ Para que o DNA seja sintetizado,são necessárias várias moléculas, que serão estudadas mais adiante, porém para o entendimento do sentido da síntese do DNA, é necessário lembrar que a ligação que une os nucleotídeos é a ligação fosfodiéster. Lembrete A ligação fosfodiéster acontece entre um grupamento fosfato de um nucleotídeo e o grupo – OH da posição 3’ do outro nucleotídeo. Os nucleotídeos são adicionados a partir de uma extremidade 3’ que é fornecida por uma molécula iniciadora ou, em inglês, primers, e é necessária também uma fita como molde. Como a adição acontece na extremidade 3’, a fita sintetizada aumenta no sentido 5’ → 3’ (figura a seguir). 36 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 Unidade I P PP P PP PP PP P A AC T C T T TG GA AG G 5’ 5’ 5’ 5’3’ 3’ 3’ 3’ OH OH fita molde Molécula iniciadora P P O- O- P P O O O O O O– O- O– O- O OH P P P O O- O Figura 23 – Crescimento da fita de DNA. As adições dos nucleotídeos ocorrem na extremidade 3’. Nessa reação, ocorre a liberação de pirofosfato inorgânico Lembrete As fitas são antiparalelas e, portanto, a fita nova é sintetizada de 5’ → 3’ e a fita parental é lida de 3’ → 5’. A enzima que faz a síntese de DNA é chamada de DNA polimerase e ela consegue sintetizar as duas fitas de DNA simultaneamente. Mas como as fitas de DNA são sintetizadas simultaneamente, já que o sentido da síntese ocorre de 5’ → 3’? (figura a seguir) 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 3’enzima Não é possível fazer a síntese nesse sentido sentido da forquilha de replicação Figura 24 – Questionamento sobre a síntese do DNA. Como as fitas podem ser sintetizadas simultaneamente se há a necessidade de uma extremidade 3’ livre para a adição de novos nucleotídeos? Em 1960, Reiji Okazaki (apud NELSON; COX, 2002) e seus colaboradores solucionaram essa questão. Os pesquisadores descobriram que uma das fitas é sintetizada de maneira contínua e a outra fita é sintetizada em fragmentos, ou seja, de maneira descontínua. Esses fragmentos foram chamados de fragmentos de Okazaki. A fita sintetizada de maneira contínua foi nomeada de fita líder, a qual é 37 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 BIOLOGIA MOLECULAR sintetizada no sentido da forquilha de replicação e a fita descontínua foi nomeada de fita atrasada, a qual é sintetizada no sentido oposto da forquilha de replicação (figura a seguir). Observação O tamanho dos fragmentos de Okazaki varia de acordo com o tipo celular. 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ Forquilha de replicação Fita descontínua Fita contínua Fragmento de Okazaki Figura 25 – Replicação. Uma das fitas é sintetizada de maneira contínua e a outra de maneira de descontínua 4.4 Moléculas importantes para a replicação 4.4.1 Nucleases As nucleases são enzimas que degradam ácidos nucleicos. As nucleases podem ser classificadas como exonucleases ou endonucleases. As exonucleases degradam o DNA a partir da extremidade 5’ ou 3’, as exonucleases que degradam a partir da extremidade 5’ são chamadas de exonucleases 5’ → 3’ e as exonucleases que degradam a partir da extremidade 3’ são chamadas 3’ → 5’. As endonucleases clivam ácidos nucleicos em posições internas. 4.4.2 DNA polimerase As DNA polimerases são enzimas que sintetizam DNA. A reação ocorre através de um ataque nucleofílico pelo – OH da posição 3’ ao fósforo do desorribonucleosídeo 5’- trifosfato. Nessa reação ocorre a liberação do pirofosfato inorgânico. A E. coli possui pelo menos cinco DNA polimerases. 38 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 Unidade I As DNA polimerases requerem duas condições: • precisam de uma fita molde. A síntese da nova fita é baseada em uma fita molde e as regras de pareamento de Watson e Crick são seguidas; • precisam de um iniciador (primer). Os iniciadores são pequenos fragmentos de RNA que fornecem a extremidade 3’ para a síntese da nova fita de DNA. A DNA polimerase adiciona os nucleotídeos e pode continuar se movendo pela fita ou se dissociar. A dissociação e a reassociação da DNA polimerase dita a velocidade da síntese. A quantidade de nucleotídeos adicionados até a dissociação da DNA polimerase é definida como processividade. As diferentes DNA polimerases variam muito em relação à processividade. A DNA polimerase adiciona os nucleotídeos de maneira correta por causa do padrão de ligações de hidrogênio e também por causa da geometria da combinação A com T e C com G. A DNA polimerase I possui um sítio que só acomoda as combinações corretas, sendo que a combinações incorretas serão eliminadas antes de fazer as ligações fosfodiéster. Para garantir a fidelidade da síntese do DNA, além do padrão das ligações de hidrogênio e da geometria dos pares corretos, quase todas as DNA polimerases possuem uma atividade exonucleásica 3’ → 5’. Essa atividade funciona como uma verificação depois da adição de cada nucleotídeo, sendo chamada de atividade revisora. Caso o nucleotídeo esteja incorreto, ele é retirado e um novo nucleotídeo é adicionado (figura a seguir). A BFunção de polimerase Função de revisão DNA- -polimerase Um nucleosídeo trifosfatado sendo incorporado é colocado corretamente em frente a sua base complementar no molde de DNA e adicionado na forma de nucleotídeo monofosfatado à cadeia de DNA de crescimento. Se o DNA-polimerase parear erroneamente um nucleotídeo com o molde, ela utiliza a sua atividade exonucleásica 3’ → 5’ para retirar o nucleotídeo não pareado. Enzima avança Enzima recua Matriz de DNA Fita recém-sintetizada Atividade de DNA- -polimerase 5’ → 3’ Atividade de exonuclease 5’ → 3’ Figura 26 – Atividade de polimerização e de revisão 39 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 BIOLOGIA MOLECULAR A enzima DNA polimerase III é a principal enzima de replicação. A DNA polimerase I está envolvida no processo de replicação, reparo e recombinação; e a DNA polimerase II está envolvida no processo de reparo. As polimerases IV e V estão envolvidas em formas de reparo não usuais. A DNA polimerase I possui uma atividade exonucleásica 5’ → 3’, sendo que a maioria das outras não a possui. Essa enzima possui uma baixa processividade. A DNA polimerase III possui 10 subunidades e tem atividade de polimerização e de revisão. 4.4.3 Proteínas necessárias para a separação das fitas As proteínas DnaA ligam-se às sequências específicas da origem de replicação, ocasionando a separação de um pedaço pequeno da fita. As enzimas helicases, sendo a principal a DnaB, ligam-se ao DNA simples fita e separam as fitas da vizinhança. As proteínas SSB ligam-se ao DNA simples fita, mantendo essas fitas separadas (figura a seguir). 5’ 5’ 3’ 3’ SSB Helicase Figura 27 – Separação das fitas. A helicase separa as fitas e as SSB ligam-se ao DNA simples fita evitando que as fitas voltem a se anelar 4.4.4 DNA topoisomerases As DNA topoisomerases são enzimas que desfazem supertorções nas moléculas de DNA. As torções no DNA são consequências da abertura das fitas. À frente da forquilha de replicação são formadas supertorções chamadas de positivas, ou seja, aquelas que causam maior número de voltas. Atrás da forquilha de replicação são formadas supertorções negativas, ou seja, aquelas que causam menor número de voltas. A figura a seguir mostra dois cordões enrolados, em que uma das extremidades é mantida fixae a outra é aberta. Essa abertura dos cordões leva a supertorções. 40 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 Unidade I Figura 28 – Torções. Dois cordões foram enrolados, uma das extremidades foi mantida fixa e a outra desenrolada, com isso aparecem supertorções Existem dois tipos de DNA topoisomerases: • DNA topoisomerases I: essas enzimas têm atividades de nuclease e ligase, ou seja, conseguem cortar e depois religar o DNA. A DNA topoisomerase corta uma das fitas, relaxando, assim, o DNA, e depois reestabelece a ligação. Na E. coli, essas enzimas relaxam supertorções negativas e, em células eucarióticas, as supertorções positivas e negativas. • DNA topoisomerases II: essas enzimas também possuem atividade de nuclease e ligase, porém o corte é feito em ambas as fitas. Essas enzimas conseguem aliviar supertorções positivas e negativas. 4.4.5 Primase A DNA polimerase não consegue sintetizar uma nova fita de DNA apenas a partir do molde de fita simples. Essa enzima precisa de uma molécula iniciadora que forneça uma extremidade 3’ – OH livre. Essa molécula iniciadora, em inglês, é chamada de primer. A molécula iniciadora possui cerca de 10 nucleotídeos e é sintetizada por uma RNA polimerase chamada de primase. Lembrete Como a fita descontínua é sintetizada em fragmentos, cada fragmento necessita de uma molécula iniciadora. Posteriormente, a molécula iniciadora é retirada e substituída por uma molécula de DNA. Em E. coli, esse processo é feito pela DNA polimerase I. 41 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 BIOLOGIA MOLECULAR 4.4.6 DNA ligase Essa enzima catalisa a reação de formação da ligação fosfodiéster. Resumo Os ácidos nucleicos fazem parte de uma classe de moléculas que compreendem o DNA (ácido desoxirribonucleico) e o RNA (ácido ribonucleico). Essas moléculas são biopolímeros constituídos por nucleotídeos, os quais são formados por um grupo fosfato, uma pentose e uma base nitrogenada. A molécula formada por pentose e base nitrogenada é denominada nucleosídeo. As bases nitrogenadas são classificadas em purinas e pirimidinas. As purinas são adenina e guanina e as pirimidinas são citosina, uracila e timina. As diferenças entre as moléculas de DNA e RNA estão na constituição das bases nitrogenadas e na pentose. As bases nitrogenadas presentes no DNA são: adenina, timina, citosina e guanina; e as presentes no RNA são: adenina, uracila, citosina e guanina. A pentose presente no RNA é a ribose, a qual possui um grupo – OH na posição 2, já no DNA a pentose é a desoxirribose, a qual possui apenas um átomo de hidrogênio nessa mesma posição. A ligação entre os nucleotídeos sucessivos, tanto no DNA quanto no RNA, ocorre através de ligações fosfodiéster. As moléculas de DNA possuem uma extremidade denominada 5’ e uma extremidade denominada 3’. As bases nitrogenadas são fracamente básicas e, por possuírem estruturas ressonantes, absorvem luz. As bases nitrogenadas presentes nos ácidos nucleicos interagem por interações de empilhamento e por pontes de hidrogênio. As ligações de hidrogênio são formadas entre A e T (ou U) e também entre C e G. Duas ligações de hidrogênio são formadas entre A e T e três ligações são formadas entre C e G. Tanto a dupla hélice do DNA quanto o RNA sofrem desnaturação quando submetidos a extremos de pH ou temperaturas elevadas. A desnaturação é causada pela quebra das ligações de hidrogênio, provocando o desenrolamento da dupla hélice e a formação de duas duplas fitas. Caso as condições originais sejam restabelecidas, as ligações voltam a se formar e esse processo é conhecido como renaturação ou anelamento. A definição de gene aceita atualmente é: gene é todo segmento de DNA que produz uma sequência de algum produto gênico final, o qual pode ser uma cadeia polipeptídica ou um RNA com função estrutural ou enzimática. 42 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 Unidade I O DNA não é formado apenas por genes, ele também é formado por sequências intergênicas que possuem função regulatória, podendo indicar a origem para replicação ou transcrição, por exemplo. Quase todo gene procariótico é colinear com o RNA e a proteína, ou seja, todo o segmento que corresponde ao gene é transcrito em RNA e traduzido em proteína. Grande parte dos genes eucarióticos possuem sequências que não codificam aminoácidos. Essas sequências são chamadas de sequências intercaladas ou íntrons e as sequências que codificam aminoácidos são chamadas de éxons. A presença das sequências intercaladas faz com que se perca a colinearidade entre o DNA e a proteína, com é visto nos genes bacterianos. Nos procariotos, uma molécula de RNA mensageiro pode produzir uma ou mais cadeias polipeptídicas; já em eucariotos, na maioria dos casos, uma molécula de RNA mensageiro codifica uma cadeia polipeptídica. Para que o DNA consiga permanecer dentro de uma célula, ele adquire uma estrutura altamente compacta. Em células eucarióticas, que não estão em divisão celular, o material genético aparece como um material sem forma. Esse material é chamado de cromatina. A cromatina é formada por DNA, proteína e uma pequena quantidade de RNA. Dentre as proteínas encontradas na cromatina, existem a histonas, as quais empacotam o DNA em unidades estruturais chamadas de nucleossomos. Cada nucleossomo é formado por oito moléculas de histonas, sendo duas cópias das histonas H2A, H2B, H3 e H4. Os nucleossomos podem se organizar em polinucleossomos, assumindo uma forma de corda que é chamada de fibra de 30nm. Níveis adicionais de organização levam à estrutura cromossômica. A replicação é semiconservativa tanto em procariotos quanto em eucariotos. A região onde ocorre um evento de replicação é chamada de replicon. Em células procarióticas, o genoma possui um único replicon, ou seja, todo cromossomo bacteriano é replicado de uma única vez. O genoma eucariótico consiste de vários replicons. A região do DNA onde ocorre a transição do DNA parental fita dupla para as novas fitas filhas é chamada de forquilha de replicação. A replicação do DNA é bidirecional, tanto em procariotos quanto em eucariotos, pois duas forquilhas movem-se em ambos os sentidos. O DNA é sintetizado no sentido 5’ → 3’. Uma fita é sintetizada de maneira contínua e a outra fita de maneira descontínua. A fita descontínua é formada pelos fragmentos de Okazaki. Para que o DNA seja sintetizado, são necessárias várias moléculas, dentre elas, DNA polimerases, as quais têm função de polimerização 43 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 BIOLOGIA MOLECULAR e síntese; helicases, as quais separam a dupla fita de DNA; primases, as quais sintetizam as moléculas iniciadoras; DNA ligases, as quais catalisam a reação da formação da ligação fosfodiéster; DNA topisomerases, as quais desfazem as torções presentes no DNA. Exercícios Questão 1. (Enade, 2008) Analise as seguintes asserções: I – É mais fácil separar nucleotídeos que unem as duas fitas complementares da molécula de DNA que separar nucleotídeos que pertençam à mesma fita. As ligações entre nucleotídeos que unem as duas fitas são ligações de hidrogênio (também chamadas de pontes de hidrogênio), enquanto II – as ligações que unem nucleotídeos da mesma fita são do tipo fosfodiéster. Acerca das asserções apresentadas, assinale a opção correta: A) As duas asserções são proposições verdadeiras, e a segunda é uma justificativa correta da primeira.B) As duas asserções são proposições verdadeiras, mas a segunda não é uma justificativa correta da primeira. C) A primeira asserção é uma proposição verdadeira, e a segunda, uma proposição falsa. D) A primeira asserção é uma proposição falsa, e a segunda, uma proposição verdadeira. E) Tanto a primeira asserção quanto a segunda são proposições falsas. Resposta correta: alternativa D. Análise das afirmativas As duas afirmações são verdadeiras e a segunda propõe uma explicação correta para a primeira. I – Afirmativa correta. Justificativa: as fitas complementares de DNA estão unidas graças às ligações ocorridas entre as bases nitrogenadas A-T e C-G. Essas ligações são naturalmente rompidas por diversas enzimas que participam dos processos de replicação e transcrição do DNA, como também o podem ser por procedimentos laboratoriais diversos que promovem a desnaturação da molécula, como aquecimento e pH alcalino extremo. Por outro lado, as ligações entre os nucleotídeos de uma mesma fita são as responsáveis por manter a integridade de cada uma das fitas de DNA, mesmo que separadas umas das outras. 44 CB IO - R ev isã o: V irg ín ia - D ia gr am aç ão : F ab io - 1 8/ 01 /2 01 6 Unidade I II – afirmativa correta e explica o fato descrito na afirmativa I. Justificativa: as ligações de hidrogênio efetuadas entre as bases nitrogenadas dos pares A-T e C-G são fracas, se consideradas individualmente. As duas fitas de DNA se mantêm unidas pelo fato de existir um número muito grande dessas ligações ao longo do biopolímero. Um exemplo de ligação de hidrogênio existente no DNA é aquele que envolve o grupamento NH2 de uma base nitrogenada e o oxigênio de outra base, como descrito a seguir: O átomo de nitrogênio do grupo NH2 tende a atrair os elétrons dos hidrogênios aos quais está ligado. Os átomos de hidrogênio, por esse motivo, tornam-se levemente positivos. O átomo de oxigênio normalmente apresenta seis elétrons não compartilhados em sua camada mais externa, fato que explica a sua negatividade. A ligação de hidrogênio ocorre quando há uma atração entre os átomos de hidrogênio (levemente positivos) de uma base nitrogenada e um átomo de oxigênio (levemente negativo) de outra base. A força de uma ligação de hidrogênio é da ordem de 3% daquela apresentada por uma ligação covalente. Convém lembrar que as ligações fosfodiéster são ligações covalentes ocorridas entre o grupo fosfato e os átomos de carbono da molécula de desoxirribose. Essa observação explica o fato de ser muito mais fácil separar as duas fitas da molécula de DNA do que os nucleotídeos que compõem cada uma das fitas. Questão 2. (Enade, 2008) Testes bioquímicos realizados durante um experimento revelaram a presença, em uma solução, de dois tipos de biopolímeros, um composto por nucleotídeos unidos por ligações fosfodiéster e o outro composto por aminoácidos unidos por ligações peptídicas. Além disso, constatou-se que o segundo biopolímero exercia atividade de nuclease. A propósito da situação acima, é correto afirmar que: A) As características bioquímicas descritas para os dois biopolímeros permitem concluir que se trata de DNA e RNA. B) A atividade de nuclease observada refere-se à capacidade de os fosfolipídios, descritos como biopolímeros, formarem a membrana nuclear de algumas células. C) O biopolímero composto por aminoácidos unidos por ligações peptídicas é um hormônio esteroidal. D) O material, de acordo com as características bioquímicas descritas, contém ácido nucleico e enzima capaz de degradá-lo. E) As biomoléculas encontradas nas análises bioquímicas são carboidratos, que formam polímeros como o glucagon. Resolução desta questão na plataforma.
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