AULA 1 Classificação e identificação de microrganismos e Transferência de Genes em Bactérias

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MICROBIOLOGIA
AULA 
PROF. ANTONIO CARLOS JÚNIOR
Classificação e Identificação de Microrganismos
Classificação e Identificação de Microrganismos 
Como identificar?
Classificação e Identificação de Microrganismos 
Taxonomia
É a ciência que distribui os organismos por categorias taxonômicas ou taxa que traduzem o seu grau de semelhança
Divide-se em:
• classificação – define a forma de distribuição dos organismos em grupos taxonómicos (taxa; singular taxon) (com base em semelhança mútua ou relação evolutiva).
• nomenclatura – atribui nomes aos grupos taxonômicos de acordo com regras pré-estabelecidas.
• identificação – é o processo de determinar a que grupo taxonômico pertence um determinado isolado.
Classificação e Identificação de Microrganismos 
Taxonomia
IMPORTÂNCIA:
Permite organizar grandes quantidades de informação
Permite fazer uma previsão das características de um determinado isolado
A criação de grupos com nomes precisos facilita a comunicação científica
É essencial para a identificação correta dos organismos
Classificação e Identificação de Microrganismos 
Taxonomia
GÊNERO:
Grupo bem definido de uma ou mais espécies, claramente separado de outros gêneros.
ESPÉCIE:
Conjunto de estirpes que partilham muitas características estáveis e diferem significativamente de outros grupos de estirpes;
Conjunto de estirpes com composição G+C (genoma) idêntica, e em que a sequência de nucleotídeos do DNA apresenta ≥ 70% de semelhança.
ESTIRPE:
População de organismos que se distingue de outras dentro de uma espécie, descende de um único organismo ou cultura pura (isolado)
Classificação e Identificação de Microrganismos 
Taxonomia
ESTIRPE:
Estirpes de uma espécie podem variar ligeiramente de várias formas:
BIOVAR – apresentam diferenças bioquímicas e fisiológicas;
MORFOVAR – diferem morfologicamente;
SEROVAR – diferem nas propriedades antigênicas.
ESTIRPE TIPO:
Primeira estirpe a ser estudada de uma espécie
É geralmente a mais bem caracterizada
Não é necessariamente o membro mais representativo da espécie
Classificação e Identificação de Microrganismos 
Taxonomia
CARACTERÍSTICAS CLÁSSICAS USADAS EM TAXONOMIA
	Categorias Majoritárias	Componentes
	Morfologia	Forma, tamanho, reação de gram, arranjo flagelar presente
	Motilidade	Motilidade por flagelo, outras motilidades, imobilidade
	Nutrição e Fisiologia	Mecanismos de conservação de energia (fototropismo), relações com o oxigênio, temperatura, pH, exigência de sal, tolerância ao sal, habilidade de usar carbono, nitrogênio, fontes de enxofre.
	Outros fatores	Pigmentos, inclusões celulares, camadas superficiais, patogenicidade, sensibilidade à antibiótico.
Classificação e Identificação de Microrganismos 
Taxonomia
CARACTERÍSTICAS ECOLÓGICAS USADAS EM TAXONOMA
Ciclo de vida;
Relações Simbióticas;
Capacidade de causar doenças em hospedeiros;
Habitat preferencial;
Fatores que influenciam o crescimento.
CARACTERÍSTICAS GENÉTICAS USADAS EM TAXONOMA
Capacidade de troca de informação genética por Transformação ou Conjugação.
Existência de Plasmídeos.
Classificação e Identificação de Microrganismos 
Filogenia
Traduz a história evolutiva de um grupo de organismos. A hierarquia taxonômica revela relações evolutivas ou filogenéticas estudando as relações evolutivas entre os organismos vivos (base da classificação moderna)
Desta maneira surgiu a bioinformática (Combinação de métodos de Biologia Molecular e Análise Computacional, com base em Algoritmos Matemáticos)
A
B
C
D
E
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Árvore Filogenética
A
B
C
D
E
Ramos: O comprimento representa a distância evolutiva ou grau de relacionamento evolutivo entre os organismos
Nó Interno: Representam organismos ancestrais
Nó Externo: Representam organismos atuais
Nó = Unidade Taxonômica
Classificação e Identificação de Microrganismos 
Árvore Filogenética
Classificação e Identificação de Microrganismos 
Domínio Bacteria
Árvore Filogenética
Classificação e Identificação de Microrganismos 
Classificação Filogenética
Baseia-se na comparação direta das sequências de material genético (genes) ou dos seus produtos (proteínas);
Ribossomos
As Moléculas de RNA ribossomal (rRNA) são excelentes ferramentas para determinar relações evolutivas entre organismos
PORQUE:
São universais (estão presentes em todos os organismos vivos e com a mesma função);
A sua função não se alterou ao longo do processo evolutivo;
Contém várias regiões em que a sequência de nucleotídeos é conservada em todos os tipos de células;
Sequências assinatura / grupos taxonômicos específicos
Classificação e Identificação de Microrganismos 
Classificação Filogenética
Escherichia coli
rRNA 16S
(Domínio Bacteria)
Mathanococcus vannieli
rRNA 16S
(Domínio Archaea)
Saccharomyces cerevisiae
rRNA 18S
(Domínio Eukarya)
Classificação e Identificação de Microrganismos 
Classificação Filogenética
Escherichia coli
rRNA 16S
(Domínio Bacteria)
Mathanococcus vannieli
rRNA 16S
(Domínio Archaea)
Saccharomyces cerevisiae
rRNA 18S
(Domínio Eukarya)
PROCARIOTAS
Classificação e Identificação de Microrganismos 
Classificação Filogenética
OBTENÇÃO DA ÁRVORE FILOGENÉTICA COM BASE NA SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DO rRNA:
Classificação e Identificação de Microrganismos 
Classificação Filogenética
OBTENÇÃO DA ÁRVORE FILOGENÉTICA COM BASE NA SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DO rRNA:
Classificação e Identificação de Microrganismos 
Classificação Filogenética
Base de Dados “Ribossomal Database Project”
Onde está depositada uma coleção de mais de 850.000 sequências de 16S rRNAs de Archea e Bacteria.
Classificação e Identificação de Microrganismos 
Classificação Filogenética
SEQUÊNCIA ASSINATURA:
Sequências curtas de nucleotídeos que ocorrem na maior parte ou em todos os membros de um grupo filogenético
Únicas - podem servir de diagnóstico de um organismo particular ou de um grupo de organismos particulares;
EXEMPLO:
Sequências assinatura específicas para cada um dos três domínios (i.e., são conservadas no rRNA de todas as espécies de cada um dos domínios);
Sequências assinatura que definem um grupo de organismos dentro de 1 domínio (são conservadas entre todos os géneros e espécies desse grupo);
Sequências assinatura que estão presentes nos organismos pertencentes a um certo género ou a uma certa espécie (p.ex., são mais variáveis, isto é, diferem entre os organismos de grupo mais amplo )
Classificação e Identificação de Microrganismos 
Classificação Filogenética
a - Y são Pirimidinas; R são Purinas;
b - Número da posição aproximada no 16S rRNA;
c - Ocorrência em porcentagem de organismos examinados
SEQUÊNCIA ASSINATURA:
Classificação e Identificação de Microrganismos 
Classificação Filogenética
a - Y são Pirimidinas; R são Purinas;
b - Número da posição aproximada no 16S rRNA;
c - Ocorrência em porcentagem de organismos examinados
SEQUÊNCIA ASSINATURA:
Relembrar
Classificação e Identificação de Microrganismos 
Classificação Filogenética
Dois anéis heterocíclicos unidos
Apenas um anel
Classificação e Identificação de Microrganismos 
Classificação Filogenética
a - Y são Pirimidinas; R são Purinas;
b - Número da posição aproximada no 16S rRNA;
c - Ocorrência em porcentagem de organismos examinados
O conhecimento sobre sequências assinatura específicas pode ser usado para gerar sondas filogenéticas ® úteis no dignóstico de microrganismos ou na análise de comunidades microbianas
SEQUÊNCIA ASSINATURA:
Classificação e Identificação de Microrganismos 
Classificação Filogenética
SONDA DE ÁCIDO NUCLEICO:
Fragmento de ácido nucleico, em cadeia simples, que pode ser marcado, com Fósforo radioativo ou com molécula fluorescente, e usado para hibridar (emparelhar) com sequência complementar de ácido nucleico numa mistura (p.ex. moléculas de ácidos nucleicos de uma população mista de microrganismos – em amostra de alimento, ambiental ou clínica).
Permite deste modo identificar a presença de um microrganismo específico que contenha essa sequência-diagnóstico.“FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION (FISH)” na
detecção e identificação de microrganismos específicos
(NÃO requere que os microrganismos sejam cultivados em cultura pura)
Classificação e Identificação de Microrganismos 
Classificação Filogenética
“FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION (FISH)” na
detecção e identificação de microrganismos específicos
(NÃO requere que os microrganismos sejam cultivados em cultura pura)
(a)
(b)
(a)
(b)
(a)
(b)
Classificação e Identificação de Microrganismos 
Classificação Filogenética
“FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION (FISH)” na
detecção e identificação de microrganismos específicos
(NÃO requere que os microrganismos sejam cultivados em cultura pura)
MICROBIOLOGIA
AULA 
PROF. ANTONIO CARLOS JÚNIOR
Transferência de genes em Bactérias
Transferência de Genes em Bactérias
“Sexo Bacteriano”
Bactérias podem trocar ou transferir DNA entre elas por três diferentes vias. Em todos os casos, as células que fornecem o DNA são chamadas de DOADORAS e as que recebem são denominadas RECEPTORAS. O DNA do doador é incorporado ao DNA do receptor por recombinação. Se a recombinação envolver um alelo diferente daquele presente no gene do receptor, o genoma e o fenótipo do segundo serão alterados. As três formas de transferência de DNA entre bactérias são: (1) TRANSFORMAÇÃO, (2) CONJUGAÇÃO e (3) TRANSDUÇÃO.
Transferência de Genes em Bactérias
Transformação
O fenômeno da transformação envolve um processo no qual o DNA (de uma célula doadora) livre no meio é tomado por uma segunda (receptora), resultando em alterações genotípicas nessa. Para a célula conseguir captar o DNA é necessário que a mesma encontre-se em estado de competência cálcio-dependente. O DNA adere-se à face externa da membrana celular bacteriana, quando então, DNA binding proteins e endonucleases clivam esse DNA em fragmentos de 6.000 – 8.000 bp. Algumas exonucleases clivam as pontes de hidrogênio estabelecidas entre os pares de base e separam as duas metades da dupla fita, para que somente uma entre na célula. Uma vez no citoplasma, o DNA alienígena ligado às DNA binding proteins (que evitam a digestão pelas DNAses) encontra o cromossomo da célula receptora ou um plasmídeo e ocorre a recombinação em sítios de homologia. Esse fenômeno pode ser observado em organismos gram-positivos e em gram-negativos.
Transferência de Genes em Bactérias
Transformação
Transferência de Genes em Bactérias
Transdução
O segundo meio de transferir DNA entre organismos envolve a mediação de vírus. Como você sabe, vírus bacterianos são chamados de bacteriófagos, ou simplesmente fagos, pela maioria dos microbiologistas
Dois cientistas, F. Twort e F. d'Herrelle, descobriram os bacteriófagos independentemente, em 1915 e 1917. O termo fago significa “que come”.
Transferência de Genes em Bactérias
Transdução
A transdução ocorre da seguinte maneira:
Um fago infecta uma bactéria susceptível injetando seu DNA.
2. O DNA fágico induz a célula hospedeira a converter todo seu metabolismo para a síntese de novos fagos.
3. Finalmente, ao término do ciclo lítico do fago, vários componentes das partículas virais, no citoplasma, são montados e a célula é lisada, liberando novos fagos infectivos.
Durante o processo de montagem, alguns erros ocasionais ocorrem e grandes segmentos de DNA BACTERIANO ACABAM POR SE INCORPORAR NO GENOMA DO NOVO FAGO, em detrimento de porções do DNA do próprio vírus. Esses novos fagos são denominados fagos defectivos.
Transferência de Genes em Bactérias
Transdução
Transferência de Genes em Bactérias
Transdução
ABC.... .... XYZ
...XYZ
ABC...
abc...
ABC.... .... XYZ
abc...
A recombinação pode ocorrer entre os segmentos de DNA da primeira célula e o DNA da nova célula, sendo que alguns alelos carreados pelo fago defectivo podem tornar-se
incorporados no novo genoma, com alteração do seu genótipo.
Transferência de Genes em Bactérias
Transdução
ABC.... .... XYZ
...XYZ
ABC...
abc...
ABC.... .... XYZ
abc...
A recombinação pode ocorrer entre os segmentos de DNA da primeira célula e o DNA da nova célula, sendo que alguns alelos carreados pelo fago defectivo podem tornar-se
incorporados no novo genoma, com alteração do seu genótipo.
“Se esse evento é tão raro, como podemos detectar a ocorrência?”
Transferência de Genes em Bactérias
Conjugação
PLASMÍDEOS:
Podemos considerar como sendo mini-cromossomos que são compostos de DNA disposto em moléculas circulares que variam em extensão, mas cuja maioria contém entre 1.000 e 25.000 pares de base, contra os 4.000.000 bp do genoma cromossômico;
Esses segmentos replicam-se de forma autônoma, e comumente, são encontradas várias cópias em uma única célula;
Plasmídeos geralmente carregam genes que não são essenciais para a sobrevivência da célula, exceto em circunstâncias especiais, por exemplo, muitos plasmídeos carream genes para resistência à antibiótico, e quando esses plasmídeos estão presentes em uma célula, essa se torna não afetada por determinados antibióticos;
Transferência de Genes em Bactérias
Conjugação
PLASMÍDEOS:
Em outro caso, plasmídeos denominados plasmídeos de virulência, carregam genes de virulência que aumentam a possibilidade da célula bacteriana em causar doenças. Isso é, uma bactéria portando um plasmídeo com genes de virulência é capaz de causar uma determinada doença, mas quando esse plasmídeo é perdido, a mesma bactéria torna-se incapaz de promover aquela patologia;
QUAL O PAPEL DESSES PLASMÍDEOS NO ESQUEMA EVOLUCIONÁRIO?
Plasmídeos constituem um conjunto adicional de alelos que aumentam efetivamente a diversidade gênica de uma população bacteriana. Cabe lembrar que o genoma de procariotos carrega somente informação para 1.000 – 5.000 genes e que uma maior variedade aumentam as chances de sobrevivência de uma bactéria num meio adverso.
Transferência de Genes em Bactérias
Conjugação
Transferência de Genes em Bactérias
Conjugação
Plasmídeos que conseguem incorporar-se no DNA genômico da célula receptora
Higt frequency recombination
Transferência de Genes em Bactérias
Conjugação
CONJUGAÇÃO ENVOLVENDO CÉLULA F+
Clivagem
Pili proteíco especial
Plasmídeos Sexuais